分類號 密級 U D C 編號 中南大學(xué) 士學(xué)位論文 論文題目 幾種嗜酸氧化亞鐵硫桿菌表型和遺傳多樣性研究 學(xué)科、專業(yè) 微生物學(xué) 學(xué)院（系 所） 資源加工與生物工程學(xué)院 研究生姓名 彭 宏 導(dǎo)師姓名及 專業(yè)技術(shù)職稱 胡岳華 教 授 2006 年3 月 分類號 密級 碩士學(xué)位論文 幾種嗜酸氧化亞鐵硫桿菌表型和遺傳多樣性研究 on 者姓名：彭 宏 學(xué)科專業(yè)：微生物學(xué) 學(xué)院（系、所）：資源加工與生物工程學(xué)院 指導(dǎo)教師：胡岳華 教 授 楊 宇 副教授 論文答辯日期 答辯委員會主席 柳建設(shè) 中南大學(xué) 2006 年3 月 碩士學(xué)位論文 摘要 I 摘 要 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌（ 下簡稱 硫化礦浸出體系中最主要的細菌之一， 同時對于礦山生態(tài)環(huán)境的形成特別是酸性礦坑廢水（ 產(chǎn)生，有重要影響，目前做為酸性極端環(huán)境的模式菌株得到各方面的研究探索。本文主要從 的分離與鑒定出發(fā)，對多株分離純化的菌株進行表型和遺傳特性的比較研究， 同時探討影響生物浸礦效率的有關(guān)因素。 本文研究中，分別從廣西銅坑、甘肅白銀、江西九江、江西城門山，采集礦坑水富集分離得到，代號分別為： 、 、 、 。并對四個菌株對亞鐵和元素硫的氧化能力進行了研究， 發(fā)現(xiàn)不同菌株的氧化活性存在明顯差異，并且亞鐵氧化活性與氧化元素硫的能力非顯著相關(guān)。 本文完成了四個菌株在 9K 亞鐵培養(yǎng)基的生長參數(shù)的測定工作。掃描電鏡的結(jié)果顯示： 株直徑為 長度為 長度為 株直徑為 株直徑為 長度為 株的最適生長溫度為 25 30，最適 為 對數(shù)期細菌的比生長速率（）分別為 h，h，h，h。同時，針對菌株的生長曲線，本文提出了隨機生長模型，模擬結(jié)果可以很好的表征實際生長曲線，利用該模型對初始菌群數(shù)量和菌種活性對遲緩期的影響進行了分析。 對有機碳源和氮源利用研究方面發(fā)現(xiàn)： 類似，而 則比較特殊，該菌不能在亞鐵和蛋白胨混合培養(yǎng)液中生長。 16s 列顯示，四株菌株均為嗜酸氧化亞鐵硫桿菌，其中，菌株準菌株而菌株但是菌株所有已提交的 A. 其中與菌株相似度也僅為 綜合有機碳源和氮源利用研究中所也反映出的 其他三個菌株不一致，我們認為菌株 能是 A. f 菌種的一個新菌系。為此進行和出27 天后，兩者的碩士學(xué)位論文 摘要 果類似，金屬鋅的浸出量達到650，比無菌對照高一倍，說明該菌株具有一定的浸礦效果。 對細菌生長過程中產(chǎn)生的沉淀進行分析， 發(fā)現(xiàn)當示沉淀的結(jié)晶狀態(tài)良好，可以觀察到明顯的晶面，平均粒徑 15m，量比分別是 60和 37，另外研究其熱分解效應(yīng)，主要分兩個化學(xué)分解過程，由動力學(xué)計算結(jié)果知，沉淀熱分解的第一階段的反應(yīng)活化能E=KJ前因子的對數(shù)值 二階段的E=KJ個階段的機理函數(shù)都是符合 程，即隨機成核，向后生長。 設(shè)計特異性引物，對 的亞鐵代謝系統(tǒng)的關(guān)鍵基因亞鐵氧化酶基因進行克隆和測序， 序列同發(fā)現(xiàn)序列相似性在99%97%之間，分析編碼區(qū)域發(fā)現(xiàn)在第 7987 位可能存在一個高變異區(qū)：在第 7981 位，菌株 碼的氨基酸 在第 8587 位，菌株 菌株 是 外在位點第 111 位，所有菌株都是 TC，但編碼的氨基酸未發(fā)生變化,屬于同義密碼子。對 于編碼區(qū)上游序列，比對后沒有差異；而對于編碼區(qū)下游序列，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)存在一些差異位點。另外對不同能源基質(zhì)下生長的 的亞鐵氧化酶基因的 果發(fā)現(xiàn)亞鐵基質(zhì)的表達量明顯高于硫基質(zhì)?？偟目磥?， A. f 菌的亞鐵氧化酶基因是高度保守的，是其亞鐵能量代謝系統(tǒng)中的關(guān)鍵酶基因。 關(guān)鍵詞：嗜酸氧化亞鐵硫桿菌，生長曲線，16s 列，黃鉀鐵礬，亞鐵氧化酶基因 碩士學(xué)位論文 摘要 , is in as is of in In .f by of on We K、of of of no EM .0 m in .4 m in ) h， h， h h A to is 5 0 pH of MS K . f to 6S 6S of On 6S Y TW MS is K is FY K be a . f. K 7 of 50 in in pH EM 5 m. 碩士學(xué)位論文 摘要 he F 0% 7%of E=JE=Jof on ro in . f 9%7% he a DS 9th 7In 9 81 5 87 in K in Y. 11 C in in to ro in in ro be to ro in in 16s 碩士學(xué)位論文 目錄 v 目 錄 摘 要 錄 第一章 文獻綜述 物冶金工藝研究進展 生物冶金細菌學(xué)研究進展 分子遺傳學(xué)研究進展 題的研究目的與研究內(nèi)容 1 第二章 實驗材料和研究方法 3 驗材料 3 研究方法 5 析方法 9 第三章 菌種的分離與鑒定 1 品的分離與富集 1 3. 2 培養(yǎng)特性 2 源利用 4 6S 列分析與系統(tǒng)發(fā)育 0 礦試驗 4 淀分析 4 論 3 第四章 亞鐵氧化酶基因多態(tài)性研究 4 4 果與討論 6 第五章 結(jié) 論 3 株遺傳和表型多樣性 3 株亞鐵氧化酶基因多態(tài)性 4 參考文獻 5 研究成果 6 致 謝 8 碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 1第一章 文獻綜述 物冶金工藝研究進展 生物冶金是利用以礦物為營養(yǎng)基質(zhì)的微 生物，將礦物氧化分解從而使金屬離子進入溶液，通過進一步分離、富集、純化而 提取金屬的高新技術(shù)。從文獻記載來看 , 生物冶金技術(shù)已具有較長的歷史，其中，中華 民族是世界上最早采用生物冶金技術(shù)的民族，早在公元前 2 世紀，堆浸在當時就是生產(chǎn)銅的普遍做法1。在歐洲，這種技術(shù)的應(yīng)用至少始于公元二世紀，從 1687 年開始，瑞典中部 山的銅礦至少已經(jīng)浸出了 2 百萬噸銅2。 微生物在礦業(yè)中的認識和 應(yīng)用研究還處于萌芽階段。直到 1947 年 , 首先從酸性礦坑水中分離出能氧化硫化礦的氧化亞鐵硫桿菌（ ，其后 、 對這種自養(yǎng)細菌的生理特性進行了研究，發(fā)現(xiàn)這種細菌能將 化為 并能氧化礦物中的各種還原態(tài)硫化物生成硫酸。 1954 年， 等6較系統(tǒng)地研究各種硫化物的微生物浸出，報道了嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在硫化礦浸出中的作用。 1955 年，7,8首次申請了生物堆浸專 利并將該專利授權(quán)給 業(yè)公司，該公司在二十世紀 50 年代應(yīng)用該技術(shù)，標志 著生物冶金技術(shù)現(xiàn)代工業(yè)應(yīng)用的開端。 目前生物冶金的研究對象已經(jīng)擴大到 利用具有浸礦能力的細菌進行銅、 鈾、金、錳、鉛、鎳、鉻、鈷、鐵、砷、鋅、鋁等幾乎所有硫化礦的浸出8,9,10。同時，由于這些微生物也是礦山酸性廢水 (生的主要因素之一11，因此礦山廢水的綜合性治 理中微生物因素也值得關(guān)注12, 13。由于生物冶金技術(shù)特別適于處理貧礦、廢礦、表外礦及 難采、難選、難冶礦的堆浸和就地浸出，并具有過程簡單、成本底、能耗低、 對環(huán)境污染小等突出優(yōu)點，正在工業(yè)生產(chǎn)中逐步推廣應(yīng)用14。各國投入了大量的資金研究和發(fā)展這項技術(shù)，目前南非、澳大利亞以及美國相對領(lǐng)先，歐盟為 了縮短差距，專門啟動了一項n 劃15，該計劃在歐盟的 12 個成員國以及南非和羅馬尼亞中集合 7 家研究所， 14 所大學(xué)以及 2個政府部門展開聯(lián)合研究， 項目從 2004年 11 月啟動歷時 4年， 總預(yù)算 元。進入 21 世紀后，我國也加大了在生物 冶金領(lǐng)域的研究力度， 2004 年啟動了生物冶金重大基礎(chǔ)研究項目（即 973 計劃） ，產(chǎn)業(yè)化方面也取得一定進展，例如在江西德興銅礦的堆浸16、廣東紫金山銅礦的低品位銅礦原位堆浸 17以碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 2及廣東梅州低品味銅礦處理示范工程項目等。但 是，目前產(chǎn)業(yè)化方面的重大進展還主要集中于國外，特 別是一些礦業(yè)公司，例如 公司在 20 世紀 90 年代末期就開展了浮選精 礦細菌槽浸的研究18,19。歸納起來，產(chǎn)業(yè)化主要在兩個方面取得了進展。 化銅礦的細菌浸出 山20位于智利北部的 漠， 是表生板巖礦床，銅的平均品位為 含銅礦物為輝銅礦（占 、銅蘭（占 以及黃銅礦 （占 ， 采用原位堆浸萃取電積技術(shù) (于 1991 年工程啟動， 1994 年 1 月運轉(zhuǎn)，每天處理硫化礦 17300t, 生產(chǎn)標準銅206t。另外，在智利 區(qū)的 山設(shè)計了進行廢石礦堆的堆浸的工藝，圖 1 表示其堆浸堆以及相關(guān)設(shè)施。 銅的浮選精礦細菌槽浸也是研究熱點， 在細菌方面，主要是兩類：一類是中溫菌，主要是 作溫度是 40另一類是高溫菌，主要 是一些古細菌，如硫化葉菌和布式菌。其中，中溫菌浸出 以次生硫化銅礦為主，例如智利的 處理銅精礦 有兩條細菌浸出回路9。對于高溫菌浸出， 司開發(fā)出 8,19,20。 處理金礦的細菌預(yù)氧化 全球黃金礦藏資源有約 1/3 屬于用傳統(tǒng)氰化浸出不能有 效提取的難處理金礦1。鑒于此，必須對其進行預(yù)處理，使載金礦體發(fā)生變化，將包裹其中的金解離出來，為下一步氰化浸出提供條件，傳統(tǒng)的 預(yù)處理方法包括：氧化焙燒和圖 1 浸. (a)浸堆鼓風(fēng)機；(b) 絕熱膜；c)灌淋碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 3加氧浸出等，而生物氧化以其投資成 本低，環(huán)境友好成為優(yōu)選技術(shù)。從 20 世紀80 年代開發(fā)出來的 難處理金礦生物氧化方面應(yīng)用最廣， 該技術(shù)主要用中溫細菌在充氣的攪 拌槽內(nèi)處理細磨礦， 圖 2 是該技術(shù)在各國應(yīng)用的情況18,19。 生物冶金細菌學(xué)研究進展 目前，生物浸出產(chǎn)業(yè)化發(fā)展要求分離與 鑒定出不同性能的專屬細菌。而這要求從各種環(huán)境進行分離采樣，主 要是在富含各種硫化礦如黃鐵礦 (、黃銅礦 (砷鐵礦 (的含重金屬離子礦山酸性廢水（ 11,21因此對 境的多樣性研究尤為重要，了解其中微生物群落的組成和演替以及優(yōu)勢菌群。早期的 研究主要是基于微生物培養(yǎng)技術(shù)23, 25和抗體或脂肪酸標記技術(shù)26只能分離和鑒定有 限的菌種，主要是嗜酸硫桿菌屬類22, 26, 而隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，特別是 術(shù)以及生物芯片，使得環(huán)境微生物的研究進入一個全新時期 ，多種無需培養(yǎng)的快速檢測方法用于研究微生物多樣性，從許多 境中發(fā)現(xiàn)了新菌屬11, 29 增 16S 因的序列多樣性以及 研究發(fā)現(xiàn)在 i = +1 7 8 = 2* %細菌裂殖 9 士學(xué)位論文 第三章 菌種的分離與鑒定 27參數(shù)說明 . 實際菌株的生長曲線數(shù)據(jù)與隨機模擬情況如上圖 3 從圖式來看，當模型參數(shù)分別 00， , D=機模型可以相對比較好的擬和出實際細菌菌群的生長情況，盡管模擬曲線相對位于實驗點下部。當然模型還需要對一些參數(shù)進行修改和優(yōu)化，這需要更多的實驗數(shù)據(jù)進行參考。 模型參數(shù)對生長曲線的影響 輸入項中的四個參數(shù)可以分為兩類：第一類是參數(shù) 主要表征接種量對菌群生長的影響；第二類這包括參數(shù) D，他們主要反應(yīng)菌種活性對菌群生長的影響。對于兩類參數(shù)，本文要討論其中的參數(shù) 0對生長曲線的影響。從圖 3 3結(jié)果來看，增加參數(shù) 0都能縮短遲緩期的時間，這一結(jié)果同前期的報道一致。為了進一步探討參數(shù)對菌群體系的影響，本文考察了不同 0值的生長曲線的平均生長速率常數(shù) K， 通過線性擬和生長曲線的對數(shù)圖，即菌數(shù)的對數(shù)值 代數(shù)（ 和直線方程，得到的斜率K，即該體系的比生長速率83，結(jié)果見圖 當 700 時， 得到方程 K 300 時， 得到方程 K 較兩者 K 的變化僅有 變化非常小，即菌群的特性沒有發(fā)生變化。 而對于不同的菌群活性值是： 01234567891010510152025303540103) 絕對菌群數(shù)量 初始絕對菌群數(shù)量 每代菌群數(shù)量 傳代代數(shù) S 迭代次數(shù) 始菌群數(shù)量 細菌活性值 每代菌群平均活性值 , D 菌群活性分布方差 K 平均生長速率常數(shù) 圖 3)實驗數(shù)據(jù), 模擬曲線 碩士學(xué)位論文 第三章 菌種的分離與鑒定 28當 ， 得到方程 K ， 得到方程 K 較兩者 K 的變化有 變化顯著，菌群特性發(fā)生變化。 由此可見兩者雖然都可以縮短遲緩期的時間，但是本質(zhì)不同。這些模擬結(jié)果有利于實際生物浸出的優(yōu)化控制以提高浸出率。 i)i)102)103) 0=B: C: 3: N 0=700; B: 00; C: 00 圖 3: 不同初始菌群活性. a: A 0b: A 0I: 不同初始菌群數(shù)量 A: N 0700, : A 0300 碩士學(xué)位論文 第三章 菌種的分離與鑒定 29數(shù)據(jù)顯示， 該隨機模型可以用于模擬嗜酸嗜酸氧化亞鐵硫桿菌在遲緩期和對數(shù)期的菌數(shù)生長變化 ;討論了模型參數(shù) 0對生長曲線的影響，雖然增加兩者的值都可以縮短遲緩期的時間，但是兩者對體系影響不一致。 源利用 本研究中，在含元素硫 (5%)的 9K 液體培養(yǎng)基中測定了這 4 種富集菌株的硫源利用情況，在初始接種量均為 106個 /養(yǎng)溫度 30，轉(zhuǎn)速 200 初始 以體系 變化表征菌株對元素硫的利用情況，如圖 3株的元素硫氧化活性從強到弱依次為： 、 、 、。其中， 和 活性類似， 較強；而這與它們的亞鐵氧化活性不同 (見圖 3， 的亞鐵氧化能力曲線以及在以亞鐵為底物的培養(yǎng)基中的生長曲線都顯著高于 ，這與已有的報道90不一致，通常認為亞鐵氧化活性高的菌株其元素硫的氧化活性也高， 這可能與菌株的生態(tài)多樣性和遺傳差異有關(guān)，需要進一步探討，具體原因?qū)⒃谙乱徽抡撌觥?機碳源和氮源的利用427 O 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基（不加9分別加入蛋白胨（ ；葡萄糖（ ； 單質(zhì)硫 （5%） ； 硫代硫酸鈉 （1%） ；427 O （ ；427 O（+ 蛋白胨（ ；427 O （+ 葡萄糖（ 。其中硫代硫酸鈉、427 O （過濾除菌后加入培養(yǎng)基，單質(zhì)硫隔水蒸煮1 4 6 8 3士學(xué)位論文 第三章 菌種的分離與鑒定 30滅菌，再加入培養(yǎng)基。以菌株懸液接種，每培養(yǎng) 3d 傳代一次。連續(xù)傳代 3 次，涂片并在顯微鏡下觀察菌的生長情況。 菌株 硫酸亞鐵 元素硫 硫代硫酸鈉 葡萄糖 蛋白胨 硫酸亞鐵葡萄糖 硫酸亞鐵蛋白胨 對于菌株 白胨、葡萄糖對其生長都是起抑制作用，可能 一株嗜酸氧化亞鐵硫桿菌新的亞種。其它三株菌株，對有機能源的利用相似，葡萄糖對菌株的生長是抑制作用 ,而少量的蛋白胨（ 可以促進菌株生長，濃度在超過 1%后，蛋白胨開始明顯抑制生長。 6s 列分析與系統(tǒng)發(fā)育 利用通用引物(見第二章)擴增出四個菌株的 16s 并且克隆到 A , 然后將克隆子交由公司測序, 序列已經(jīng)遞交到 陸號分別為: 、。同時，將序列遞交到果顯示所有序列跟已有的 A. 四株都初步判定為 A. f 菌，其中，菌株 標準菌株 相似，而菌株似度分別為 但是菌株 較特殊，與所有已提交的 A. f 菌的 16s 序列的相似性都不超過 99%,其中與菌株 相似，但相似度也僅為 從上一節(jié)的有機碳源和氮源利用情況，也反映此菌株. f 菌種的一個新菌系，為了探討其在浸出硫化礦方面的前景，后面將描述其浸出鐵閃鋅礦的情況。 同時，1, 以 本實驗中的四條序列和. 表3建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3A. 分別是其中， 屬于來我們也分離純化了多株 A. 隆和測定其16s 對結(jié)果顯示均在三個亞類中，沒有觀察到其他類型，但是主要分布在表 3士學(xué)位論文 第三章 菌種的分離與鑒定 31 沒有發(fā)現(xiàn)有 的菌株，這可能與地域和其生態(tài)環(huán)境分布有關(guān)。 另外，我們通過全序列的比對，找到了三個亞類的信息位點。我們知道核苷酸替代、核苷酸缺失、核苷酸插入。單個核苷酸替代的方式又可分為轉(zhuǎn)換替代和顛換替代兩種。 全序列比對中單個核苷酸的替換出現(xiàn)三個或以上我們視其為信息位點。對核苷酸序列而言，理論上每個位點均可構(gòu)建三種可能的譜系樹。然而，并非所有的位點都能用于重建系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系?？捎糜跇?gòu)建最簡約譜系樹的位點才稱為信息位點92。由表3序列中共得到 21 個信息位點，除了位點 970 和 1375 以外93，其它都分布在A. f 菌 16s 序列的靠 5端前 800位置，以后的序列非常保守。而對于前13 個位點又主要分布于兩個區(qū)域內(nèi)，第一區(qū)域位于 175，即通常指的可變區(qū)域 外一個則是 390區(qū)域介于可變區(qū)域 間。同時計算和模擬三個亞類在這兩個區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)和最小自由能94,95，見圖 3中， 參照， 別以果顯示，在 175， 異交大，而且 最小自由能低，這與其 量高可能相關(guān)。而在 390，三個亞類的二級結(jié)構(gòu)差異都比較大，可能作為精細鑒定 A. 菌株名稱 索引號 K 11595 Y 3對中使用的16 第三章 菌種的分離與鑒定 324366(點175 A G G 178 G G A 190 C T T 205 C T T 206 G A A 218 A T T 234 C A A 394 A A G 406 T C C 411 T T C 419 A A G 427 A G G 438 T T C 587 G G A 596 T C C 598 T G C 787 G G A 790 T A T 791 A G A 970 A G G 1375 G T T 表 3個亞群的信息位點分布 1: 位置標號統(tǒng)一以 6S 標準 碩士學(xué)位論文 第三章 菌種的分離與鑒定 33圖 3三個亞區(qū)的 16S A 175三個亞區(qū)的 16S A 390 3基于 16S A. 株生態(tài)發(fā)育樹，采用 法為 A. 4366 (外來群 碩士學(xué)位論文 第三章 菌種的分離與鑒定 礦試驗 浸礦試驗主要進行鐵閃鋅礦的浸礦，實驗礦樣粒度分布為 104 m，礦漿濃度 5%(g/L)，實驗菌株采用 種量為 10%，調(diào)節(jié)初始菌濃度為 107其特殊的生理生化特性，實驗中的數(shù)據(jù)是菌株未經(jīng)馴化的情況，表現(xiàn)出一定的浸礦能力 , 能對鋅離子有一定的浸出效果，但效果不是很明顯。開始，有菌搖瓶對鐵閃鋅礦的浸出速度比較穩(wěn)定，隨時間變化不顯著，浸出鋅離子的濃度維持在比無菌對照高出 150左右的水平上，但在 25d 以后，鋅的浸出率呈現(xiàn)出加快的趨勢， 由于細菌能夠吸附在礦石表面能對礦物產(chǎn)生腐蝕電化學(xué)作用來加快浸礦速度。在 27細菌浸出的鋅離子濃度達到 650，而無菌對照只有 392 ，如圖 3中 淀分析 鐵礬是細菌浸出中常見的現(xiàn)象，為滿足細菌生長對某些無機鹽的需要，有時要在浸出液中添加 K+， 這使得鐵礬更加容易生成。少量的鐵礬對細菌的生長活性有利96，但大量鐵礬沉淀包圍在礦物表面，形成比較致密的包裹層時，對細菌的浸出影響較大。在細菌氧化亞鐵過程中，完全氧化以后會在產(chǎn)生黃色沉淀物，在細菌浸出過程中也會出現(xiàn)類似物，附于礦石表面，阻礙浸出過程