蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 1 第一章 前言 噬體由來，概念及分類 1962 年 人使用電子顯微鏡在人的肝細胞中觀察到的“自我吞食” (象，將其命名為“ 即自噬。 1974 年士因為在自噬方面開創(chuàng)性的成果而獲得了諾貝爾獎，稍后溶酶體也被發(fā)現(xiàn)。近些年來，人們對自噬的研究逐步深入，目前研究表明，自噬是真核細胞在正常發(fā)育、自體免疫、衰老或遭受生物與非生物脅迫過程中對自身胞質組分再分解利用的重要方式之一。自噬主要分為 4 類，即巨自噬（ 微自噬（ 超自噬（ 分子伴侶介導自噬（ 泛存在與真核細胞中，一般說的自噬指的就是 程中，最初由來源不明的膜包繞待降解物形成自噬體（ 或自噬泡（ 隨后 外膜與液泡膜融合，使體（ 入液泡內，此后 膜破裂，將內含物釋放到液泡內并被液泡內的各種水解酶降解； 液泡或溶酶體的膜通過內陷作用直接包裹長壽命蛋白，通過修剪（ 成泡內小泡，稍后泡內小泡破裂，內含物釋放到液泡內，進而被液泡內的水解酶降解（ (007)）；：細胞內的液泡或溶酶體直 接破裂，其中的水解酶被釋放到細胞之中，導致周圍大量細胞質和細胞器的降解 (007)； ：一些具有選擇性的可溶胞質蛋白與溶酶體膜表面的受體結合，然后被轉運到溶酶體內，最后被溶酶體內水解酶降解的過程。 噬現(xiàn)象的研究現(xiàn)狀 關于 20世紀 90年代， 后通過篩選大量的自噬突變體，成功篩選出一批酵母自噬相關基因，目前在酵母中已經發(fā)現(xiàn) 30多個自噬相關基因，這些基因所編碼的蛋白質參與到自噬的各個過程，包括自噬體產生的誘導，小泡的成核，質膜包裹內含物，自噬體裝配完成，與液泡融合等。對于單細胞的酵母，通過自噬降解作用使物質能重新循環(huán)利用，對維持胞內相對的穩(wěn)態(tài)起到十分重要的作用，這也是自噬的主要功能之一。 蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 2 其次是其他哺乳動物和人類 (et 1998; 005),在動物中自噬除了參與細胞營養(yǎng)脅迫過程外，還參與腫瘤的形成，免疫反應，程序化細胞死亡，神經退行性疾病等方面的生理生化過程。 近年來在植物方面自噬的研究也取得了一定的進展。目前的研究表明，在植物生長發(fā)育過程中，自噬主要有兩種途徑，即 007)。 是液泡膜內陷，包裹周圍的細胞質組分（核糖體，線粒體，細胞核，部分細胞質等），形成泡內小泡，然后泡內小泡通過 擠壓斷離作用，使包裹內含物的小泡脫離液泡膜而進入液泡內。前人在研究橡樹橡膠顆粒向液泡內的轉運及萌發(fā)的小麥種子中貯藏蛋白的積累過程中，發(fā)現(xiàn)了液泡凹陷包裹細胞內組分的類微自噬現(xiàn)象 (et 1992; et 2001)。同樣的，在一些植物種子萌發(fā)過程，微自噬參與由“內吞”作用運輸 到液泡中的貯存蛋白和淀粉顆粒的降解 (et 2003; et 1980)。然而， 同， 初起源于未知來源的前體，前體包裹帶降解的組分，然后擴張延長，最終形成雙膜結構包被的 后 膜與液泡膜融合，釋放 液泡中。最后自噬小體在液泡中各種水解酶的作用下解體，釋放出內含物，內含物在液泡中降解后生成的分子物質可以循環(huán)利用 (et 2006)。 與多種多樣的細胞代謝途徑。巨自噬在很多植物中都有報道，如擬南芥 (et 2002; et 2002),煙草(996)。 進入 21世紀后，隨著研究領域的拓寬，人們發(fā)現(xiàn) 與細胞發(fā)育、衰老和自體免疫有關 (et 2006; 005),因而研究者對 今已成為當今植物細胞和分子生物學研究的熱點，被越來越多的研究和報道。 物自噬體（泡）形成的過程、及分子機制 通常我們說的自噬為巨自噬（ 在降解無功能或受損蛋白質及細胞器過程中起主要的作用， 成前體（ 前體繼續(xù)發(fā)育，形成雙膜結構且包裹待降解物的 液泡融合形成自噬溶酶體，降解物在自噬溶酶體中降解 (008)（圖 1）。 1） 自噬是被雷帕霉素標記（ of 激酶信號誘導產生的 (000)。 止 抑制時， 合，經過磷酸化作用后誘導自蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 3 噬產生。 個非常關鍵的步驟 (et 2000; 005)。在擬南芥中，只有一個 兩個 因被鑒定 (et 2002; 002)。然而， 因有個小的基因家族（ (et 2006)，其功能仍在進一步研究中。 2）小泡成核 小泡成核現(xiàn)象由液泡分揀蛋白（ 3,4 二磷酸 3一復合體包括 件 (005)。擬南芥 變體表現(xiàn)出如下缺陷表型： et 2007) (et 2007b) (008)。 對營養(yǎng)脅迫更為敏感。 c. 發(fā)育畸形。 008)。這些結果表明 一個多功能的蛋白。 3） 在 ，包括兩個泛素類的共價結合路徑 (005; 001; 005)。在這兩個路徑中， 為泛素類標簽 ,分別共價結合到標靶磷脂酰乙醇胺（ 成 個中間體被轉運到 酶 后分別到達 et 2000; et 2002; 008; 005)， 合需要 白酶的參與， 價結合 4） 雙膜結構的 裹部分細胞內含物（核糖體、質體、葉綠體、部分細胞質等），最終外膜與液泡融合，釋放自噬小體，然后將內含物降解。在酵母中， 合體起了決定性的作用，包括了 白 族 (005)。 變體有早衰、對營養(yǎng)脅迫敏感等典型的自噬缺陷表型，表明 南芥基因 株表現(xiàn)出典型的自噬缺陷表型 (et 2010)。 5） 在裂解過程中， 中， 蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 4 圖 1自噬體在植物細胞內形成發(fā)展的過程 圖 1核心自噬基因參與自噬過程路徑圖（ J,005) 物自噬標記物 近期的報道大量的討論了研究自噬作用的工具 (et 2009; 蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 5 et 2010)。這些報道主要集中在植物細胞中熒光標記物方面。 1）刀豆素 A。自噬體不僅可以在自噬被誘導時期積累，也可以在自噬后期被抑制而積累。例如，如果自噬體和溶酶體的融合被抑制或延遲，自噬體將積累（ et 2010)。刀豆素 2）嗜酸性染料。中性紅， 酸性結構的標記，但對自噬體的特異性不強（ 2004）。因此，不推薦用這些染料標記自噬體活性。 3）綠色熒光蛋白標記。細胞質中 變體缺陷和 價結合路徑中觀察到了這種現(xiàn)象。例如， 雙突中檢測發(fā)現(xiàn) (et 2004)， et 2011)和 D 未發(fā)表數(shù)據）也有發(fā)現(xiàn)。 光在突變體細胞質中出現(xiàn)的原因現(xiàn)在還不清楚。但是所有發(fā)表的文章中，以花椰菜花葉病毒 35 物自噬中的生理功能 關于 量的證據表明 物生長與發(fā)育、細胞衰老有關，還與植物抗生物或非生物脅迫（氧化脅迫）有關。 噬與植物營養(yǎng)物質的循環(huán)利用 植物在遭受饑餓脅迫（ C、 件下，會誘導自噬 的產生。水稻（ 胞在受到 C 脅迫時，通過自噬作用，把蛋白質等物質運送到液泡中(007)；煙草（ 遭受 C 脅迫時，細胞中出現(xiàn)大量的雙膜包被結構，這些雙膜包被的自噬體，包裹部分細胞內含物，運送到液泡中，降解后組分可以循環(huán)利用 (996)。在擬南芥中，自噬的相關功能被較為系統(tǒng)和全面的研究。通過超微結構的觀察，可以看到擬南芥中自噬的整個過程：饑餓誘導后雙膜結構自噬體形成，自噬體外膜與液泡融合，液泡內形成自噬小體，自噬小體解體，內含物在液泡中降解。利用分子生物學技術 ，對 關基因表達量進行檢測發(fā)現(xiàn)，在饑餓脅迫時，明營養(yǎng)脅迫確實可以誘導自噬的發(fā)生。更為有利的證據表明，在受到營養(yǎng)脅迫時，大部分 座葉大面積黃化，生殖系統(tǒng)退化等表型。且當饑餓脅迫去除后，其表型仍不能完全恢復。這蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 6 一現(xiàn) 象表明自噬在植物受到營養(yǎng)脅迫時起著十分重要的作用，可以分解胞內物質使組分循環(huán)利用，維持一個相對平衡的細胞內穩(wěn)態(tài)，從而暫時性的減小外部脅迫對植物致命的生存壓力。 噬與植物生長與發(fā)育 在植物整個生長發(fā)育過程中，自噬體的積累在形態(tài)學上屬于程序化細胞死亡（ 一種 (et 2011; 005)。在植物 et 2011)。在動物中，自噬突變體表現(xiàn)出形態(tài)學上的缺陷，包括新生老鼠致死和果蠅蛹的發(fā)育延遲 (008; 010)。在植物結構學上，不僅在幾個擬南芥 價結合突變體中沒有明顯變化，而且在 有的成活擬南芥突變體中，葉片衰老加速，說明在衰老葉片中，不僅自噬能調控 有其他機制共同作用。 管的延遲分化是所有 變體中僅有的和 關的表型。這一發(fā)現(xiàn)表明對 自噬可能有泡狀體的生物起源 (999)作用。在植物細胞中至少有兩種結構類型的泡狀體，溶解泡狀體和蛋白儲存泡狀體（ 二者分別執(zhí)行分解和儲存功能。大量數(shù)據表明有很多方法可以產生植物泡狀體，然而泡狀體生物起源機制仍然不清楚 (et 2009)。部分原因是沒有一個功能性 泡狀體突變體是致死的 (et 2010; et 2001)。對自噬突變體缺陷型植株液泡進行更系統(tǒng)深入的分析也許可以揭示液泡生物起源的延遲或者小的碎片化結構的泡狀體形成。對大量的擬南芥突變體做前體再生將會是一項非常有意義的實驗。 在單子葉植物中自噬和 形成有關。小麥細胞中包含醇溶蛋白的蛋白體的運輸和自噬過程十分相像 (et 1992)。在玉米糊粉細胞也觀察到細胞質和 噬泡包含運輸?shù)鞍?,但這些泡狀體卻不含 白 (011)。 小麥中的一項研究發(fā)現(xiàn)自噬參與了小麥花的敗育 (et 2008)。小麥花的超薄切片觀察表明，在子房中，發(fā)現(xiàn)不同程度的自噬降解作用，且發(fā)現(xiàn)了有力的 證據，如染色質凝縮，細胞核解體等現(xiàn)象。利用 術，對自噬相關基因 因的檢測，其表達量迅速上升。以上結果表明在小花程序化死亡過程中，有自噬的參與。但到底是自噬減緩了程序化細胞死亡還是加速了程序化細胞死亡現(xiàn)在還不清楚。 在花瓣衰老方面，研究者以大牽?；閷ο?，發(fā)現(xiàn)自噬可能對其花瓣衰老起調控作用 (et 2009a; et 2009b; et 2009)；蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 7 后研究發(fā)現(xiàn)， 用基因沉默技術后 ，細胞內自噬減少，衰老加速。以上種種結果表明，自噬的確可以在花瓣中被激活，主要作用就是延緩其衰老。 細胞自噬現(xiàn)象與根的生長發(fā)育密切相關。在眾多 變體中， 根也受到一定影響 (et 2004)，在 變體中，根的伸長也受抑制 (et 2002; et 2007a)。有趣的是，在擬南芥根中自噬為組成性表達，且在伸長區(qū)和分化區(qū)自噬活躍程度遠遠超過其他區(qū)域。以上結果表明細胞自噬在根生長發(fā)育過程中起到重要作用，有可能影響根的伸長和分化作用。 噬與植物細胞衰老 植物的衰老過程實際上是植物衰老部分物質被降解后，可以循環(huán)利用的分子被運送到正在發(fā)育、急需大量營養(yǎng)供給的幼嫩組織或生殖器官，這是一種營養(yǎng)物質的再利用過程。近年大量的研究結果表明，自噬在植物衰老過程中，起到重要的作用。 大量的文獻報道擬南芥突變體 現(xiàn)葉片嚴重黃化、蛋白總量下 降及衰老相關基因激活等衰老表型。即使在沒有脅迫的條件下， et 2010; et 2002; et 2005; et 2005; et 2004) 。植物衰老時葉綠素含量下降，葉綠體被降解，葉片出現(xiàn)典型的黃化現(xiàn)象。最近的報道表明，在衰老細胞中自噬確實參與葉綠體降解的一 系列過程。在 20世紀 80年代， et 1982)等在觀察暗培養(yǎng)的小麥時發(fā)現(xiàn)，葉綠素水平和核酮 糖 加氧酶（ 活性下降，葉綠體含量也減少，更為重要的是，在液泡中發(fā)現(xiàn)了葉綠體，表明葉綠體在細胞中的降解是經過一系列細胞內機制完成。隨后，這一現(xiàn)象在越來越多的植物及器官中被發(fā)現(xiàn) (et 1984; et 1995)。以電子顯微鏡技術為手段研究衰老小麥葉片中 察到 et 2003)。以上結果表明衰老細胞內存在一個 解機制，自噬作為胞內蛋白降解的經典路徑，極有可能參與了這一過程，從而使分子組分循環(huán)利用。因此，在衰老的葉片細胞中，可能存在兩種自噬相關的葉綠體降解路徑，一個是直接包裹葉綠體，送入液泡中降解，另一個是將包裹 而對葉綠體內蛋白逐步降解。 然而擬南芥 變體中，葉綠體及其相關蛋白仍然可以被降解，這表明植物細胞中仍有其他路徑來行使這一功能，這一方面的研究仍在繼續(xù)。 蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 8 噬在受到生物和非生物脅迫時的作用 植物因 缺少運動免疫細胞，只能依靠先天的免疫系統(tǒng)來抵御識別外來病原體。植物免疫受體可以分為兩個大類：細胞表面受體和細胞內的免疫受體。表面受體，也叫做模式識別受體（ 識別一個病原相關的分子模式（ 是一個微生物結構，或者功能單元，活化 ，直接或者間接的通過對病原體的免疫應答和效應器相互作用細胞 。他們的相互作用致使免疫效應器（ 活，結果是使細胞致死，稱作超敏反應（ (010; 006)。 自噬突變體表型表現(xiàn)出較早的衰老并伴隨著細胞加速死亡 (011; 009)，超敏細胞死亡在植物抵抗疾病方面有著重要的作用，可以限制病原體的擴張，自噬可能以某種方式幫助植物防御反應，尤其在 自噬控制的細胞死亡和植物防御反應的關系首先在煙草中發(fā)現(xiàn)。病毒誘導的 因沉默（ 不受控制的細胞死亡擴散。丁香，番茄，或者鐵線蕨實驗表明這種植物細胞死 亡的缺陷由 后人們發(fā)現(xiàn)自噬和 關系：自噬體是被可偵測的效應器（ 導的 (et 2009)。 因為過早的衰老和病原體誘導的超敏細胞死亡，在光下生長的自噬突變體需要水楊酸（ 號，實際上，水楊酸在自噬突變體里高度積累 (et 2011; et 2009)，表明 自噬負調控了水楊酸的信號通路。水楊酸類似物用于病原體感染和治療可以誘導植物 et 2009; 008)，表明自噬和水楊酸信號互為負反饋調節(jié)。然而，一些自噬表型沒有被水 楊酸的缺乏而抑制，如 物在黑暗誘導下的衰老和饑餓下的生長抑制 (et 2009)。同樣的，被病原體侵染引起的細胞死亡，二孢白粉菌在 明自噬功能和水楊酸信號通路有依賴的方面，也有獨立的方面。在自噬突變植株中自噬的水楊酸依賴活性可以解釋為活性氧（ 是部分依賴水楊酸的 (et 2011; et 2009)。 通過檢測 因來證明它們是否參與非生物脅迫的反應。除了氧化脅迫外，多重突變體對鹽和缺水脅迫高度敏感 (et 2009)。這種超敏機制目前還不太清楚， 能是一個十分重要的參與因子。 受到營養(yǎng)脅迫和環(huán)境脅迫時，是一個普遍的植物應答調節(jié)子 (et 2004; 004)， 植物細胞中和動物中一樣，可能誘導自噬的出現(xiàn)蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 9 (007; et 2007)。因此 ,營養(yǎng)、生物、非生物脅迫都可能誘導 果使自噬活性增高。相反的，在一個假設的非脅迫情況下， 片相比野生型來說，積累較高水平的過氧化氫，表明自噬限制 et 2009)。 如降解蛋白質和受損的細胞器），額外的非生物壓力可以使 噬現(xiàn)象研究過程中出現(xiàn)的問題 目前研究發(fā)現(xiàn)盡管在不同細胞、組織、植物和環(huán)境條件下都有雙膜結構的類植物中，大量與酵母 因具有同源性的基因（如 、 4、 7、 9、 18等）已經被克隆或鑒定，并獲得了一些具 因敲除突變體，但具體到植物中 構、形成與轉運機制和不同器官組織中所行使功能的研究才剛剛開始 ，許多問題仍然沒有研究清楚。存在的主要問題有： 1）觀察 植物中可能存在兩種路徑，一種是成熟的 接與液泡融合，隨后其中的內含物被液泡內的水解酶分解；另一種是先被溶酶體結構的細胞器吞噬，形成自噬溶酶體，自噬溶酶體隨后與液泡融合，并被液泡內的水解酶分解。以上兩種路徑在懸浮培養(yǎng)的煙草細胞中同時存在。然而，在不同細胞、組織、植物、發(fā)育階段、環(huán)境等條件，哪一種途徑其主導作用，目前仍不清楚。 2）根據氨基酸序列的同源性，在植物中克隆和鑒定了很多與酵母 因同源的基因，然而，這些基因在 程中所行使的準確功能現(xiàn)在還不清楚。即使是對研究最早、生物結構最簡單的酵母 3) 雙膜包被的 P 的主要特征，但是有關 的來源仍不完全清楚。目前有兩種觀點 :第一種觀點支持膜來源于一種稱作 隔離膜，許多 張頭尾聯(lián)合最終包裹部分細胞質與細胞器形成 C。 的生成不依賴其他膜性細胞器（如高爾基體、內質網），合成過程具有獨立性。第二種觀點認為 V 的膜來源于內質網或高爾基體等膜性細胞器。 4）過去研究一直認為細胞凋亡（ 一個概念，即 同于而，近年來大量研究結果表明， 是 些 形態(tài)學特征不符，而在有些細胞中雖顯示出 態(tài)特征的細胞死亡，但并非是程序化的； 顯示 D 也屬于 同類型的 相互關聯(lián)，相互影響的。然而在植物細胞方面關于自噬作用的具體功能和調節(jié)機制、自蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 10 噬與 5) 植物而言主要局限于擬南芥，其次為煙草，就器官、組織和細胞水平而言，主要局限在正在萌發(fā)的種子，受營養(yǎng)脅迫的細胞懸浮培養(yǎng)物、自然衰老或受外來病原真菌侵染的葉肉細胞。在其他植物、組織、細胞較少報道。 6）自噬在植物雄性不育系花藥敗育過程中是否積極參與細胞死亡過程及這一現(xiàn)象是否具有一定的普遍性。以前關于植物自噬作用的研究主要集中在體細胞方面，在生殖細胞尤其是雄性不育系花藥中鮮有報道。 數(shù)分裂過程與雄性不育敗育的細胞和分子生物學機制 減數(shù)分裂是植物有性 生殖過程中最為關鍵事件之一，也是生物遺傳、生物進化和生物多樣性得以進行的前提和基礎。減數(shù)分裂使親代和子代的染色體數(shù)目保持恒定，這樣保證了物種遺傳物質的穩(wěn)定性，而同源染色體交換及非同源染色體重組，使配子的遺傳基因多樣化，對生物進化及環(huán)境適應等方面起到十分積極的作用。減數(shù)分裂發(fā)生在花粉母細胞和胚囊母細胞中。 自花藥原基中的孢原細胞。為了保證有性生殖的有效性，孢原細胞經過分裂形成許多 些過減數(shù)分裂形成更多的雄配子體。如此大的一個群體，通過怎樣的機制維持細胞分裂的同步性以及保證最終產物具 有相同的生活能力？這是一個極有意義而長期懸而未決的問題。 在 19 世紀發(fā)現(xiàn)植物的雄性不育現(xiàn)象。本世紀以來，雄性不育的遺傳理論也不斷發(fā)展。植物產生雄性不育主要受環(huán)境和遺傳兩大因子的影響。溫度和光照這兩個環(huán)境因子對植物雄性不育有重要的作用。從植物雄性不育性的遺傳背景來看，可分為核不育和細胞質不育。細胞質雄性不育在顯花植物中廣泛存在 (988)，其表現(xiàn)為卵細胞發(fā)育正常，可以通過人工傳授正?；ǚ鄱Y實，但小孢子發(fā)育異常，不能產生花粉或花粉敗育，屬母性遺傳，即細胞質遺傳。 此外，植物雄性不育在作物育種上具有重要的實用價值。然而關于植物雄性不育系花藥敗育的細胞和分子生物學機制目前仍不完全清楚。花藥（粉）敗育實際上是由基因控制的 種 有 結構出現(xiàn)表明 能與參與 化、同步性分裂及 過進一步研 究，希望能對 子調節(jié)機制、 時，進一步了解 蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 11 究目的與意義 鑒于在以上植物 觀察到的 態(tài)與結構上與目前定義的 V 十分相似，因此我們推測在這些植物的生殖細胞中都可能有 發(fā)生。在 作用可能與消除早期（造孢時期）因細胞不對稱分裂造成后來的 的是通過同步減數(shù)分裂，獲得大量均一的有功能的雄配子體，以保證成功的受精； 在 中， 可能與 因控制的花藥或花粉敗育及 是仍有許多問題有待研究，如它們的膜來源是什么？被膜包裹的內含物是否具有選擇性？自噬是否真正參與到植物花藥敗育過程？這一現(xiàn)象是否具有一定的普遍性？ 洋蔥（ 百合科蔥屬， 2 年生草本植物，是我國主要栽培的蔬菜作物。本實驗以甘肅酒泉農科所提供的 洋蔥為材料，通過光鏡、電鏡及分子生物學技術等手段，驗證在洋蔥的敗育中是否有 者 自噬與洋蔥 緊密相關？同時也可以驗證 此，本實驗在以前課題組研究的基礎上，以洋蔥花藥為實驗材料，采用細胞與分子生物學研究手段，對以上問題進行必要的探索。 蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 12 第二章 材料與方法 物材料 雄性不育系和可育系洋蔥（鱗莖）由甘肅酒泉農科所提供。 2011 年 4月 7日種下鱗莖。所有鱗莖都種植在相同大小的培養(yǎng)盆中，每個培養(yǎng)盆種一個鱗莖。在室外自然光下培養(yǎng)，隔一天澆一次水 。 5月下旬洋蔥可育系和不育系產生花芽， 6月中旬開花， 7月下旬花朵開始凋謝。收 集不同發(fā)育時期的新鮮花芽進行實驗，并固定處理一批電鏡用包埋塊。 劑配制 良苯酚品紅染液配制： 取 3000%乙醇中 取 0入 90% 石炭酸水溶液 取 55冰醋酸和福爾馬林各 6色液 取原液 C 20 30入 45%的乙酸 7080入加山梨醇 3%戊二醛固定液： 磷酸緩沖液（ 885%戊二醛 12酸 2%鋨酸原液的配制： 2%的 入棕色磨口試劑瓶中，在通風廚內把安瓿瓶敲破，即刻加入雙蒸水，配制成 2%水溶液，蓋上蓋子，放置過夜或更長時間使其溶解。此后作為儲備液，于冰箱中密封保存。 蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 13 %鋨酸固定液： 磷酸緩沖液 (2 %鋨酸 8mL 糖 16 埋劑配 方： 3 80 12滴 配制完成后需攪拌 1驗試劑盒 植物組織 取試劑盒 : 50轉錄試劑盒： 生工生物 一鏈 驗方法 S 系花藥形態(tài)分析 采集新鮮的洋蔥 察花梗、花托、花萼、花冠、雄蕊群和雌蕊等部分，對 花的不 育有個直觀感性的認識。 藥發(fā)育過程涂片法觀察小孢子發(fā)育 5月下旬收集洋蔥 涂片法擠壓出不同發(fā)育時期的花藥，經過改良苯酚品紅溶液染色后在光鏡下觀察可育系與不育系洋蔥花藥不同發(fā)育時期生殖細胞的顯微結構。生殖細胞的發(fā)育由雄蕊原基開始，產生花藥原始體，進一步發(fā)育成造孢細胞以后發(fā)育成花粉母細胞，經過減數(shù)分裂，最終形成花粉。蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 14 通過改良苯酚品紅染色，找出在花藥形成過程中 定不育系花藥的不育現(xiàn)象發(fā)生在花藥發(fā)育的具體時期，為下一步實驗做鋪墊。 品固定， 浸透，包埋，修塊及切片觀察 固定： 從 S 系中剝離花粉母細胞時期，四分體時期以及小孢子時期花藥，根據需要，花藥被切成長 1后迅速放入含 3%的戊二醛和 酸的 ,在室溫環(huán)境中處理 6小時，中間換一次固定液。然后樣品用 滌三遍，每次 后投入含 1%四氧化鋨的 酸緩沖液（ 4過夜。隨后樣品經過梯度冷酒精脫水： 30%70%95%每級 20100純酒精三次，每次 20 浸透： 將脫水后的材料用環(huán)氧丙烷過渡 30間換一次液體），隨后于 2:l、 l:1、1:2環(huán)氧丙烷 /環(huán)氧樹脂包埋劑 (分別浸透 2 4h，最后用純環(huán)氧樹脂浸透 1溫）。 包埋： 用滴管向包埋板孔注入混合好的 孔一滴，用干燥牙簽將浸透好的組織塊撥入包埋板中，并將組織塊按所需切面置于模孔頂端，用滴管向模孔注滿 包埋好的模板放入溫箱中聚合： 35 24h 45 24h60 24h。包埋塊聚合以后，分別用紙袋裝好編號，放于干燥器中保存 備用。 修塊： 將包埋塊用標本夾持器夾緊，將標本夾持器放在支持座上，便于顯微鏡下觀察，用雙面刀片在包埋塊上表面水平削一刀，使包埋的組織剛好露出，將包埋塊削成梯形截面，最后將包埋塊放于干燥器中保存。 切片： 包埋好的樣品塊用薄片切片機（ 行切片，厚度兩微米，將切片放于干凈的載玻片上，經 苯胺藍染色，用雙蒸水沖洗后，在光鏡下觀察。 薄切片機切片及電鏡觀察 將選擇好的目的包埋塊，用超薄切片機（ 新切片。銅網撈取切好的片子，用飽和醋酸雙氧鈾 水溶液和檸檬酸鉛染液染色后，保存于干燥器中，待干后進行觀察。在 觀察并照相。 蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 15 定檢測 因在洋蔥根、葉及花藥中表達 提取 ，及可育系和不育系花藥的總 轉錄后，使用劉巖林同學根據不同植物 5 5 進行 25個 后瓊 脂糖凝膠電泳，檢測 20 1 l l l l l l 模板 1 l 程序過程 溫度 時間 預變性 94 4性 94 30S 退火 54 30S 延伸 72 40S 蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 16 第三章 實驗結果 F 系和 花藥形態(tài)學觀察分析 月下旬花芽開始發(fā)育， 6月中旬開花。早期剛形成花蕾時， 開花藥，這些花藥呈淺綠色，比較圓潤飽滿。隨著花的進一步發(fā)育，花朵盛開，經過仔細比較，花梗、花托、花萼、花冠、和雌蕊發(fā)育正常，但 花 6個花藥中，有不同數(shù)目的花藥畸形，每朵花中畸形花藥數(shù)目從 1到 6都有發(fā)現(xiàn) (圖 3取一朵開放的 3），剝離花藥，看到有 5個花藥形態(tài)畸形，一個花藥正常。將部分花藥放大，我們發(fā)現(xiàn)，在形態(tài)上，正常花藥 (圖 3)整體飽滿，表面平滑，色澤光亮， 藥隔筆直，畸形花藥 (圖 3)較為干癟瘦小，表面有溝壑凸凹不平，色澤暗淡，藥隔深且彎曲。由此可以說明，此品系的確為雄性不育株系。 圖 3- 1 A： 花朵，顯示有正常的六個花藥； B,C： 花朵，顯示有不正常的花藥 ,B 為三花藥畸形， D： 一朵花中六個花藥其中 5個為畸形化藥，一個正常； E： 色亮麗； F： 中畸形花藥，花藥干癟皺縮，色澤暗淡。 蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 17 片法觀察 和 花藥發(fā)育過程 在洋蔥 花蕾壓片中，可以觀察到 形態(tài)飽滿圓潤的花粉母細胞 (圖 3)，此時花粉母細胞形態(tài)規(guī)則，染色體形狀完整。四分體時期的細胞具有相對明顯特征 (圖 3)，此時四分體細胞外面仍有胼胝質包裹，四分體結構排列較為緊湊，以及較為規(guī)則、比較飽滿的小孢子細胞 (圖 3)；然而在 中發(fā)現(xiàn)大部分花粉母細胞初期形態(tài)相對不規(guī)則，染色體混亂，有些細胞發(fā)育畸形（圖3,D）， 到了花粉母細胞時期的稍后期，可以看到細胞胼胝質壁增厚不明顯或者沒有，細胞呈變形蟲狀，嚴重畸形（圖 3），隨后細胞結構完全破壞，只有部分細胞和和細胞質殘余（圖 3）。細胞未向四分體方向發(fā)育，走向解體。由此可以看到， 的不育發(fā)生在花粉母細胞階段。由于某些原因未能接著發(fā)育到四分體以及小孢子階段。 圖 3 A： 花粉母細胞形態(tài)規(guī)則圓潤，較為規(guī)則，細胞核濃縮，處于第一次減數(shù)分裂時期； B：C： 小孢子； D， E： 花粉母細胞，大部分細胞形態(tài)和 分細胞畸形，解體； F：解體的 胞結構完全破壞，只有部分細胞核和細胞質殘余。 F 系和 蔥花藥顯微結 構觀察 洋蔥成熟花藥壁由外到內依次為：表皮、藥室內壁、中層、絨氈層（圖 3）。表皮和藥室內壁的液泡化程度很高。此時的中層和絨氈層細胞呈扁平的條狀，絨氈層的外形很不規(guī)則。洋蔥絨氈層為腺質絨氈層，在發(fā)育過程中在原位解體。在絨氈層以內的 積巨大，約為表皮、 藥室內壁細胞的 2，早期造孢細胞呈較為規(guī)則的多邊形。隨著 繼續(xù)發(fā)育，細胞間隙加大，細胞變得圓蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 18 潤，細胞外的胼胝質壁增厚，細胞核中的染色質濃縮變形為染色體，小孢子開始為進入減速分裂前期做好準備（ 圖 3） 。 過精妙的減數(shù)分裂形成 四分體（ 圖 3）， 4個小孢子大多呈等四面體排列，外層由厚厚的胼胝質包被。此時藥壁的表皮、藥室內壁和中層細胞沒有特殊明顯的形態(tài)變化，但絨氈層的體積極度膨大，細胞呈較有規(guī)則的橢圓型，細胞核巨大且呈規(guī)則的圓形，位于細胞中央，絨氈層細胞與細胞之間接觸緊密無間隙，細胞內有較多的液泡化現(xiàn)象。隨后的繼續(xù)發(fā)育使四分體胼胝質壁解體，成型的 4個小孢子被釋放出。此時絨氈層逐漸解體消失，（ 圖 3）。這一時期小孢子壁繼續(xù)發(fā)育和加厚，形成了完整的花粉壁結構，覆蓋層、基粒層、外壁內層和花粉內壁都清晰可見（ 圖 3）。 圖 3 A：早期花粉母細胞排列緊密，染色質松散，表皮、藥室內壁、中層和絨氈層已分化形成； B：晚期花粉母細胞胼胝質壁加厚，染色質凝聚，絨氈層細胞體積沒有明顯變化； C：經過減數(shù)分裂形成四分體， 4個小孢子被包裹在厚厚的胼胝質中； D：四分體胼胝質壁解體，小孢子釋放成為游離狀，此時絨氈層細胞膨大明顯； E：小孢子晚期時細胞核遷移、靠邊，產生極性；絨氈層明顯收縮； F：小孢子經過一次不均等分裂形成二胞花粉。 EN：T： 蘭州大學碩士 研究生學位論文 洋蔥雄性不育系花粉母細胞敗育與自噬現(xiàn)象的關系 19 藥結構表皮，藥室內壁 ，中層和絨氈層及花粉母細胞分化已形成，看出表皮和藥室內壁細胞的液泡化程度比較多，一個中央大液泡占據細胞的大部分，細胞質和細胞核被擠到一個較小的區(qū)域（ ）。在洋蔥花藥發(fā)育早期的初期階段，洋蔥花藥的表皮和藥室內壁細胞相對狹長，呈現(xiàn)長條狀（ 圖 3, C） ；隨著花藥的發(fā)育，表皮和藥室內壁細胞膨脹變圓，體積變大。中層細胞大致呈長條形，細胞核為長條狀，絨氈層細胞處于分化早期階段，形狀不甚規(guī)則。但隨后絨氈層 細胞卻解體消失，而不是 減數(shù)分裂后形成體積膨大的形態(tài)特征（圖 3、 F、 G、 H、I），中層細胞也有部分解體。 1）在發(fā)育初期，即造孢細胞時期，細胞形態(tài)不規(guī)則，細胞壁 (度彎曲變形，呈變