密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 我國(guó) 羊泰勒蟲的生物學(xué)特性研究 I 摘 要 羊泰勒蟲病（ 由媒介蜱傳播的由泰勒科泰勒屬的原蟲寄生于綿羊和山羊巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和紅細(xì)胞內(nèi)所引起的疾病的總稱。泰勒蟲與巴貝斯蟲、無漿體、可厥體可分別引起家畜的泰勒蟲病、巴貝斯蟲病、無漿體病及心水病，將這 些疾病統(tǒng)稱為蜱傳病 (在全世界每年造成約 70 億美元的經(jīng)濟(jì)損失。羊泰勒蟲病危害嚴(yán)重，可引起羔羊和外地引進(jìn)羊大量死亡，使慢性發(fā)病的山羊和綿羊發(fā)育變緩，產(chǎn)肉量和產(chǎn)毛量顯著下降，從而給養(yǎng)羊業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。 在 我 國(guó)， 羊泰勒蟲 病 是一種重要 而常見 的蜱傳性原蟲病，主要分布于我 國(guó)西部 地區(qū) ，包括甘肅、寧夏 、 內(nèi)蒙古、青海、四川 和 陜西 等省 。 然而， 目前國(guó)內(nèi)對(duì)羊泰勒蟲病的研究尚不全面。本項(xiàng)研究以我國(guó)分布的兩種羊泰勒蟲為主要研究對(duì)象，對(duì)其生物學(xué) 特性 進(jìn)行進(jìn)一步的研究，主要研究結(jié)果如下： 1 利用 傳 播試驗(yàn)，確定 青海血蜱和長(zhǎng)角血蜱 可以作為 我國(guó) 新定名的 呂氏泰勒蟲的傳播媒介。從感染呂氏泰勒蟲的羊體飽血的 青海血蜱 幼蜱 和 若蜱 發(fā)育而來的 若蜱 和 成蜱 ，能分別傳播這種泰勒蟲給除脾綿羊；同時(shí)，從感染呂氏泰勒蟲的羊體飽血的長(zhǎng)角血蜱 幼蜱 和 若蜱 發(fā)育而來的長(zhǎng)角血蜱 若蜱 和 成蜱 ，也能分別傳播這種泰勒蟲給除脾綿羊。實(shí)驗(yàn) 結(jié)果 表明，呂氏泰勒蟲至少能被 2種硬 蜱 青海血蜱和長(zhǎng)角血蜱 傳播 ，傳播方式為階段性傳播。 2 利用 傳播試驗(yàn)，確定 青海血蜱和長(zhǎng)角血蜱 可以作為 我國(guó) 新定名的尤 氏泰勒蟲的傳播媒介。從感染尤氏泰勒蟲的羊體飽血的 青海血蜱 幼蜱 和 若蜱 發(fā)育而 來的 若蜱 和 成蜱 ，能分別傳播這種泰勒蟲給 除脾和未除脾 綿羊 ； 同時(shí)，從感染尤 氏泰勒蟲的羊體飽血的 長(zhǎng)角血蜱 若蜱 發(fā)育而來的 成蜱 ，能 將 這種泰勒蟲 傳播 給 除脾和未除脾綿羊； 但是，從感染 尤 氏泰勒蟲的羊體飽血的 長(zhǎng)角血蜱 幼蜱發(fā)育而來的 若蜱 ，對(duì) 尤氏泰勒蟲 的 傳播 沒有成功。 實(shí)驗(yàn)表明， 尤 氏泰勒蟲至少能被 2種 硬 蜱 青海血蜱和長(zhǎng)角血蜱 傳播 ，傳播方式為階段 性 傳播。 3 用 液氮保存 的 呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的蟲血分別感染綿羊，待蟲體出現(xiàn)后，每日做血液涂片、空氣干燥、甲醇固定和姬姆薩染色，進(jìn)行兩種蟲體的形態(tài)學(xué)觀察。觀察內(nèi)容包括蟲體形態(tài)種類、各類蟲體 出現(xiàn)的先后次序、最高染蟲率和染蟲率高峰時(shí)各類蟲體所占比例。結(jié)果表明，這兩種泰勒蟲的蟲體 胞漿呈淺藍(lán)色，細(xì)胞核成紫色，形態(tài) 類型 主要 包括圓形、卵圓形、針形、桿狀、三葉草形、十字架形、逗點(diǎn)形和 不規(guī)則等多種形態(tài)。在整個(gè)病程中，以梨籽形、圓形（卵圓形）、針形 3類蟲體 占 優(yōu)勢(shì)；而且這 2個(gè)蟲種在形態(tài)學(xué)上幾乎沒有 明顯 差異。 4 對(duì)尤氏 泰勒蟲人工感染的試驗(yàn) 綿羊 進(jìn)行了病理學(xué)觀察。結(jié)果顯示： 體表少毛部位、眼結(jié)膜、 皮下脂肪 和 大網(wǎng)膜輕度黃染 ； 淋巴結(jié) 和肺 臟 腫脹，切面濕潤(rùn)多汁；心、肝、肺、腸道和瘤胃表面可見 針尖至粟 粒 大小出血點(diǎn) 或出血斑。主要 的組織學(xué)病變?yōu)榱馨徒Y(jié)充血、出血及 淋巴竇網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞增生； 肺臟間質(zhì)、網(wǎng)狀細(xì)胞增生 ， 肺泡隔增厚 ； 腎小球內(nèi) 皮 細(xì)胞 、 血管內(nèi) 皮 細(xì)胞增生 ，淋巴網(wǎng)狀細(xì)胞灶狀積累，甚至形成結(jié)節(jié) ； 心肌細(xì)胞變性壞死，染色不均 ； 腸道 肌層、粘膜層和 固 膜明顯充血、出血 ； 肝細(xì)胞顆粒變性 和 有散在細(xì)胞壞死，匯 管區(qū)和小葉間 有 淋巴網(wǎng)狀細(xì)胞增生 ；瘤胃 黏膜下層有散在性出血，肌內(nèi)層見灶狀出血。 5 建立了一種從 感染 有 羊泰勒蟲 的 羊血液細(xì)胞分離羊泰勒蟲裂殖子的快速方法。用嗜水氣單孢菌產(chǎn)生的細(xì)胞毒素 溶血素 解寄生有羊泰勒蟲的紅細(xì)胞，繼而用 度離心分離和純化羊泰勒蟲裂殖子。光學(xué)顯微鏡檢驗(yàn)表明，從感染羊泰勒蟲的紅細(xì)胞分離 的 裂殖子仍然保 持 正常的 蟲體 形態(tài)，并從宿主細(xì)胞成分中游離 出來 。 6 構(gòu)建了呂氏泰勒蟲 庫 ，文庫的重組率為 100%， 初級(jí) 文庫 庫容 量 約為 06 增 文庫滴度 約 為 08 研究用 存的呂氏泰勒蟲蟲體直接提取并純化 用 物合成雙鏈 在其兩端加 定向接頭。將所產(chǎn)生 的 子定向克隆到具有 粘性末端的 以上連接產(chǎn)物進(jìn)行體外包裝以形成完整的噬菌體，并用之轉(zhuǎn)染大腸桿菌 而構(gòu)建成呂氏泰勒蟲的 7 篩選出 9 個(gè)具有免疫反應(yīng)性的基因。 將呂氏泰勒蟲 達(dá)文庫與宿主菌E3)一定比例混合孵育并鋪板，當(dāng)噬斑出現(xiàn)后將 覆蓋于頂層膠表面并繼續(xù)培養(yǎng) 3.5 h。隨后，將此 次與呂氏泰勒蟲陽性血清和 堿性磷酸酶標(biāo)記的兔抗綿羊 后加底物顯色，初步篩選得到藍(lán)紫色的陽性克隆，并 復(fù)篩直至整個(gè)膜上均為陽性信號(hào)為止。用所得陽性噬菌體轉(zhuǎn)染宿主菌 之自動(dòng)亞克隆為重組質(zhì)粒，用此亞克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌序和蛋白表達(dá)分析，共獲得 24個(gè) 新基因 ， 10個(gè)基因能成功地 誘導(dǎo)表達(dá)， 9個(gè)具有免疫 反應(yīng)性。 8 建立了呂氏泰勒蟲的 測(cè)方法。利用從 呂氏泰勒蟲篩選的 因， 根據(jù)其序列設(shè)計(jì)了其特異性引物，用 法檢測(cè)呂氏泰勒蟲感染血樣中蟲體 基因組 自然感染呂氏泰勒蟲 的基因組 中，用該引物擴(kuò)增出 368用該引物不能從尤氏泰勒蟲，羊巴貝斯蟲 未定種 、綿羊無漿體和健康羊基因組 擴(kuò)增出 368段。 %呂氏泰勒蟲蟲血稀釋到 10，仍能檢測(cè)出蟲體 法比光學(xué)顯微鏡檢 200個(gè)視野敏感。 為 我國(guó) 呂氏泰勒蟲的流行病學(xué)調(diào)查 提供了一種可靠的 檢測(cè) 和 診斷方法。 關(guān)鍵詞 泰勒蟲病 呂氏泰勒蟲 尤氏泰勒蟲 長(zhǎng)角血蜱 青海血蜱 形態(tài)學(xué) 病理學(xué) 庫 is by is by in of a of to of as a in or to a of is an in it is In to is 1. of a in is on . to . to H. on . to . to . be by at H. . of is to 2. of a in is H. on . to . to H. on . to . to . on . to to . be by at H. . of is to 3. of . . . . in of of 0% of . . a 246 239 of an of 00 of as In in in of to a no in . . 4. of . by of of of in in of in of in of in a in in of in of 5. A in or to in a at of 6. of . . 70 . A of , in a a 06 V a 08 7. of on a E3)to an .5 by gG by to by on of of be 8. CR . A a of to A 368NA NA . CR . or NA CR to NA 0-5 is 00 CR a . in 錄 第一章 緒論 . 1 . 1 . 2 萊氏泰勒蟲 . 2 綿羊泰勒蟲 . 3 分離泰勒蟲 . 3 隱藏泰勒蟲 . 4 呂氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲 . 5 羊泰勒蟲病的分子生物學(xué)檢測(cè)方法 . 6 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ . 6 反向線狀印 跡 雜交技術(shù) . 8 的和意義 . 9 第二章 青海血蜱和長(zhǎng)角血蜱對(duì)呂氏泰勒蟲的傳播試驗(yàn) . 11 料和方法 . 12 原始蟲種 . 12 試驗(yàn)羊 . 12 供試蜱 . 12 蜱的感染 . 13 傳播試驗(yàn) . 13 . 13 . 13 觀察內(nèi)容 . 13 果 . 14 . 14 . 14 . 14 . 15 論 . 15 第三章 青海血蜱和長(zhǎng)角血蜱對(duì)尤氏泰勒蟲的傳播試驗(yàn) . 19 料和方法 . 20 原始蟲種 . 20 試驗(yàn)羊 . 20 供試蜱 . 20 蜱的感染 . 21 傳播試驗(yàn) . 21 . 21 . 21 觀察內(nèi)容 . 22 果 . 22 . 22 . 22 試驗(yàn) . 22 . 23 論 . 23 第四章 兩種羊泰勒蟲的形態(tài)學(xué)觀察和比較 . 27 料和方法 . 28 生蟲 . 28 驗(yàn)動(dòng)物 . 28 物感染 . 28 態(tài)學(xué)觀察 . 28 果 . 33 氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲的感染結(jié)果 . 33 氏泰勒蟲的形態(tài)學(xué)觀察 . 33 籽形蟲體 . 33 形蟲體 . 33 狀蟲體 . 34 形 /卵圓形蟲體 . 34 葉草型和十字架型蟲體 . 34 氏泰勒蟲的形態(tài)學(xué)觀察 . 34 籽 形蟲體 . 34 形蟲體 . 34 狀蟲體 . 35 形 /卵圓形蟲體 . 35 葉草型和十字架型蟲體 . 35 氏泰勒蟲和尤氏泰勒蟲在形態(tài) 學(xué)上的比較 . 35 論 . 35 第五章 尤氏泰勒蟲的病理學(xué)研究 . 37 料和方法 . 38 氏泰勒蟲 . 38 海血蜱 . 38 驗(yàn)動(dòng)物 . 38 的感染 . 38 物感染 . 39 察內(nèi)容 . 39 果 . 39 的感染及生化指標(biāo)的變化 . 39 檢眼觀變化 . 39 織學(xué)變化 . 40 論 . 40 六章 用溶血素從感染紅細(xì)胞分離羊泰勒蟲裂殖子 . 47 料和方法 . 48 泰勒蟲 . 48 驗(yàn)動(dòng)物 . 48 劑及配制 . 48 體增殖 . 49 血收集 . 49 體的純化 . 49 . 49 柱 . 49 解紅細(xì)胞 . 49 殖子的分離 . 50 連續(xù)梯度的制備 . 50 度離心和蟲體保存 . 50 果 . 50 體增殖 . 50 . 50 細(xì)胞裂解 . 51 殖子的分離 . 51 論 . 51 第七章 呂氏泰勒蟲 達(dá)文庫的構(gòu)建 . 54 料與方法 . 55 1 寄生蟲 . 55 2 試劑 . 55 3 儀器設(shè)備 . 55 泰勒蟲 . 55 . 56 氏泰勒蟲