I 分類(lèi)號(hào) 學(xué)校代碼 10564 學(xué) 號(hào) 2004216006 密 級(jí) 學(xué) 位 論 文 番木瓜離體快繁體系的建立 指導(dǎo)教師姓名 李建 國(guó) 研究員 申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別 碩 士 專(zhuān)業(yè)名稱(chēng) 果樹(shù) 學(xué) 論文提交日期 2007 年 5 月 論文答辯日期 2007 年 6 月 2 日 學(xué)院名稱(chēng) 園藝 學(xué)院 學(xué)位授予日期 2007 年 6 月 答辯委員會(huì)主席 林順權(quán) 教授 評(píng)閱人 易干軍 研究員 黃旭明 教授 摘 要 研究以番木瓜（ .）為試材，比較系統(tǒng)地摸索了影響離體再生的多種因素，建立了番木瓜組織培養(yǎng)高效離體快繁體系，并在此基礎(chǔ)上，對(duì)目前番木瓜快繁中存在的主要問(wèn)題（根系質(zhì)量差）進(jìn)行了初步探討，以番木瓜組培生根苗正常根系與膨化根系為材料，開(kāi)展了番木瓜細(xì)胞組織學(xué)、形態(tài)學(xué)的觀(guān)察與分析，取得的主要結(jié) 果如下： （ 1）無(wú)菌培養(yǎng)體系的建立階段，采用番木瓜 頂芽與側(cè)芽為外植體誘導(dǎo)叢芽，外植體采用的消毒方法為：自來(lái)水沖洗 10 飽和肥皂水浸泡 20 無(wú)菌水沖洗3 次 75 酒精 30s 無(wú)菌水沖洗 3 次 4 無(wú)菌水沖洗 4 次 接種至含有 “山農(nóng)一號(hào) ”I 型溶液的培養(yǎng)基中。誘導(dǎo)培養(yǎng)基為： 30g/L 蔗糖 瓊脂。 （ 2）不定芽增殖階段，采用 3/2+蔗糖 30g/L+瓊脂 的配方為培養(yǎng)基，增殖系數(shù) 株高度理想，生長(zhǎng)健壯。 （ 3）不定芽誘導(dǎo)生根階段，采用兩步生根法。第一步根系誘導(dǎo)階段采用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化出的配方 蔗糖 30g/L+瓊脂 為基本培養(yǎng)基，第二步根系生長(zhǎng)階段采用 白培養(yǎng)基并附加 活性炭。臺(tái)農(nóng)一號(hào)可達(dá)到80以上的平均生根率，且生根根系質(zhì)量得到改善，細(xì)長(zhǎng)，無(wú)愈傷。 （ 4）移栽階段使用基質(zhì)為泥炭土：珍珠巖 9： 1 的混合基質(zhì)，代森錳鋅滅菌 ,優(yōu)化環(huán)境控制，可獲得 78 100移栽成活率和健壯的植株苗。 （ 5）使用 石蠟包埋法制作生根苗正常根系與膨化根系幼嫩根段切片，觀(guān)察發(fā)現(xiàn)膨化根系的膨化部位發(fā)生在皮層部分。膨化根系皮層厚度異常增加，細(xì)胞體積增大，形狀不規(guī)則，排列無(wú)序；膨化嚴(yán)重的材料，其皮層細(xì)胞解體。 （ 6）使用 0000描生根苗正常根系與膨化根系，005b 對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，正常根系與膨化根系在根系體積、根系平均直徑等指標(biāo)上存在顯著差異，正常根系根徑級(jí)別主要分布在 1 4 級(jí)（ 0而膨化根系根徑級(jí)別主要分布在 6 10 級(jí) （ 關(guān)鍵詞： 番木瓜 離體快繁 根系形態(tài) 根系結(jié)構(gòu) of in . 10642, .) is an in of as in a on On of of an in of as (1) to as on a a BA .2 0g/L 0in 0 5% 0s % in “ (2) At of , , 0g/L . as as (3) At of BA of BA in by at If S to a -3 in be a S .0 0g/L+ S 0g/L+AC by 0% 4) At of 8% be in 9： 1). (5) of an an of (6) to of be in a -4 . in 縮略詞表 縮寫(xiě)詞 英文全稱(chēng) 中文全稱(chēng) 6cm 米 d h 時(shí) 哚丁酸 霉素 L 升 mg 克 g lx 度單位 /勒克斯 鐘 s mm 米 S 培養(yǎng)基 S 培養(yǎng)基 乙酸 性炭 乙烯基吡咯烷酮 pH 堿度；氫離子濃度 福平 霉素 錄 1 前言 . 1 木瓜概述 . 1 木瓜離體培養(yǎng)研究進(jìn)展 . 1 木瓜組培苗根系形態(tài)與細(xì)胞組織學(xué)觀(guān)察研究進(jìn)展 . 4 究的目 的和意義 . 5 2 材料與方法 . 7 驗(yàn)材料 . 7 物材料 . 7 器設(shè)備 . 7 要試劑 . 7 驗(yàn)方法 . 7 植體的選擇、獲取與預(yù)處理 . 7 植體的消毒方法的確定 . 7 染外植體的搶救方法 . 8 芽增殖培養(yǎng)中碳源的確定 . 8 代增殖培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn) . 8 根培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn) . 9 他幾個(gè)影響生根率的因素探討 . 10 同生根方法 . 10 同品種生根比較試驗(yàn) . 11 性炭對(duì)生根的影響 . 11 定芽大小與生根關(guān)系試驗(yàn) . 11 培養(yǎng)時(shí)間與生根關(guān)系試驗(yàn) . 11 度對(duì)生根的影響試驗(yàn) . 11 黃素對(duì)生根的影響 . 12 苗移栽 . 12 苗方式 . 12 栽步驟 . 12 管苗移栽成活的品種差異 . 13 栽基質(zhì)與生根苗根系長(zhǎng)度對(duì)移栽成活率的影響 . 13 常根系與膨化根系形態(tài)學(xué)比較 . 13 常根系與膨化根系組織學(xué)比較 . 13 料準(zhǔn)備 . 13 定 . 13 洗 . 13 色（媒染、整染、沖洗） . 14 水 . 14 明 . 14 蠟 . 14 埋 . 14 塊的分割、修整與固著 . 14 片 . 15 片、展片與烤干 . 15 蠟及封固 . 15 檢、觀(guān)察與拍照 . 15 驗(yàn)觀(guān)察與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法 . 15 3 結(jié)果與分析 . 16 植體消毒方法的確定 . 16 菌污染材料的搶救 . 16 同碳源對(duì)不定芽增殖的影響 . 16 本培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的種類(lèi)和濃度配比對(duì)繼代增殖的影響 . 17 本培養(yǎng)基及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和濃度配比對(duì)生根的影響 . 19 他幾個(gè)影響生根因素的探討 . 20 同生根法的效果比較 . 20 同品種的生根效果差異 . 21 性碳對(duì)生根的影響 . 21 定芽大小對(duì)生根的影響 . 22 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生根的影響 . 23 溫度對(duì)生根的影響 . 23 黃素對(duì)生根的影響 . 24 培生根苗的移栽 . 26 苗方式的比較 . 26 栽成活率的品種差異 . 26 根苗根系長(zhǎng)度與移栽基質(zhì)對(duì)移栽成活率的影響 . 27 常根系與膨化根系形態(tài)學(xué)與組織學(xué)比較 . 28 態(tài)學(xué)比較 . 28 常根系與膨化根系直觀(guān)形態(tài)差異比較 . 28 常根系與膨化根系的直徑分布差異 . 28 化根系與正常根 系形態(tài)學(xué)指標(biāo)差異 . 29 常根系與膨化根系組織學(xué)比較 . 30 4. 討論 . 31 于外植體的選擇與表面消毒 . 31 于增殖繼代培養(yǎng) . 33 養(yǎng)基優(yōu)化問(wèn)題 . 33 代增殖過(guò)程中的玻璃化現(xiàn)象 . 34 于生根培養(yǎng)問(wèn)題 . 36 步生根與兩步生根法優(yōu)缺點(diǎn)比較 . 36 養(yǎng)基優(yōu)化問(wèn)題 . 37 響根系發(fā)育的其它幾個(gè)重要因子 . 38 響移栽成活率的因素 . 40 管苗移栽后易于死亡的原因 . 40 試驗(yàn)中五種不易移栽成活的試管苗類(lèi)型總結(jié) . 41 苗技術(shù)與環(huán)境控制對(duì)移栽的影響 . 42 栽與煉苗過(guò)程中需要注意的其 它問(wèn)題 . 42 5 結(jié)論 . 43 致 謝 . 44 參 考 文 獻(xiàn) . 45 附錄： 圖版及其說(shuō)明 . 51 位論文原創(chuàng)性聲明 . 62 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū) . 62 1 1 前言 木瓜概述 番木瓜（ .）隸屬番木瓜科（ 木瓜屬（ , 是一種重要的半草本熱帶亞熱帶果樹(shù)，別名木瓜、萬(wàn)壽果、石瓜、乳瓜等。原產(chǎn)于南美洲巴西，約于 17 世紀(jì)引入我國(guó)，在我國(guó)南方有較大的種植面積，華南地區(qū)種植面積約 6,667內(nèi)以廣東、廣西、福建、云南、海南、臺(tái)灣、四川等省栽培面積較大（林冠雄等， 2005）。 番木瓜植株是多年生軟木質(zhì)小喬木，干直立；葉大，掌狀深裂；花兩性或單性異株；花萼小，下部聯(lián)合，上部 5 裂；雄花冠長(zhǎng)管狀；雌花花瓣 5；雄蕊 10 或 5（兩性花），近基部合生； 子房 上位， 1 室，有多數(shù)的胚珠生于側(cè)膜胎座上；果為一漿果。 番木瓜品種頗多，栽培容易，生長(zhǎng)迅速，結(jié)果快，單稈直立適于間作，常年結(jié)果，產(chǎn)量很高（林啟訓(xùn)等， 2000）。但其花性復(fù)雜，種子繁殖后代的農(nóng)藝性狀，特別是果形、果肉、顏色等變異較大，雌性花結(jié)的果為卵形 ，果腔大，種子多，果肉薄，不耐貯運(yùn)，而兩性花結(jié)的果為長(zhǎng)橢圓形，果腔小，種子少，果肉厚，耐貯運(yùn)（葉長(zhǎng)明等，2003）。 番木瓜果肉鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，用途廣泛。果實(shí)中除含有人體所需的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類(lèi)和豐富的礦物質(zhì)、維生素外，還含有木瓜蛋白酶（ 營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，故其可以作為新鮮水果食用，又能入菜煲湯，重在益脾健胃和幫助消化，治療十二指腸胃潰瘍。木瓜凝乳蛋白酶（ 醫(yī)用價(jià)值更高，對(duì)人的腰脊椎盤(pán)突出癥療效顯著（朱利顯等， 1983）。目前已經(jīng)分離、純化出上述兩種酶類(lèi)，并獲得了其中含有的 “融 菌酶 ”，對(duì)促進(jìn)傷口愈合、防止感染、以及水果和食品保鮮都有重要的意義（朱西儒等， 2001）。近年來(lái)，番木瓜也因上述獨(dú)特的風(fēng)味和保健價(jià)值而躋身高檔水果行列，享有 “嶺南佳果 ”的美譽(yù)。 除此之外，番木瓜還可用于多種深加工，其果實(shí)本身及未成熟果實(shí)中富含的木瓜酶類(lèi)是食品、醫(yī)藥、飲料、飼料、化妝品和生化等工業(yè)領(lǐng)域的重要原料和輔料（葉長(zhǎng)明等， 2003），因此，發(fā)展番木瓜種植及相關(guān)產(chǎn)業(yè)都有廣闊的市場(chǎng)前景。 木瓜離體培養(yǎng)研究進(jìn)展 植物組織培養(yǎng)是 20 世紀(jì)發(fā)展起來(lái)的一門(mén)技術(shù)， 30 年代中期其技術(shù)體系基本建立。 1937 年 立起第一個(gè)植物組織培養(yǎng)的專(zhuān)用培養(yǎng)基，使這項(xiàng)技術(shù)在果樹(shù)學(xué) 2 上得到廣泛的應(yīng)用，特別是 于劃分快繁階段的理論和實(shí)踐，有力地推動(dòng)了木本果樹(shù)的快繁應(yīng)用。 林順權(quán)等（ 2005）總結(jié)了園藝植物離體培養(yǎng)再生植株的主要途徑： 萌發(fā)腋生枝 誘導(dǎo)根 完整植株（ 1）（莖尖） 外植體（脫分 產(chǎn)生體細(xì)胞胚 進(jìn)一步發(fā)育為完整植株（ 2） 化）或愈傷組織 同時(shí)有根莖原基 連接為植株（ 3） 產(chǎn)生不定器官 根上長(zhǎng)莖 植株（ 4） 單極原基 莖基長(zhǎng)根 植株（ 5） 在番木瓜離體再生中采用最多的是途徑（ 1）、（ 2）和（ 5）。 番木瓜生物技術(shù)研究始于 20世紀(jì) 70年代中期，早期主要是組織培養(yǎng)技術(shù)的探討。隨著研究的深入，番木瓜無(wú)性繁殖離體再生體系已經(jīng)建立。 1974 年， 首次報(bào)道從葉柄誘導(dǎo)形成愈傷組織獲得 成功。 （ 1978 ）采用番木瓜的莖尖和葉柄在 養(yǎng)基上成功地培養(yǎng)了試管植株。隨后，從莖尖或 頂芽、側(cè)芽（ 1983）、胚、花藥、子葉和子房（ 1982）等 培養(yǎng)中，相繼報(bào)道成功地再生植株。有關(guān)體細(xì)胞胚發(fā)生的報(bào)道也不少， （ 1977）從幼年實(shí)生苗莖部的愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的體細(xì)胞胚獲得成功； （ 1974）從葉柄來(lái)源的愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生了體細(xì)胞胚，但他們都未報(bào)道體細(xì)胞胚是否培養(yǎng)出小植株。直到 1982 年， 才從胚珠來(lái)源的愈傷組織誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞 胚，并再生植株獲得成功。此后， （ 1987）和 （ 1987）也成功地從根外植體誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞胚和再生植株。我國(guó)學(xué)者葉克難等（ 1991）、黃俊潮等（ 1993）以 雜種小苗的根、莖為外植體，通過(guò)懸浮培養(yǎng)途徑，經(jīng)愈傷組織誘導(dǎo)獲得大量體胚并再生植株。鄒韻霞等（ 1992）對(duì)番木瓜的受精胚珠進(jìn)行培養(yǎng)，獲得胚性愈傷組織、體胚和正常小植株。周鵬等（ 1992）則用實(shí)生苗葉片為材料，通過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)獲得胚狀體和再生植株。 (1974)， （ 1975）， （ 1978）對(duì) （番）木瓜的組織培養(yǎng)進(jìn)行初步研究，并在探索適合番木瓜組織培養(yǎng)的外植體類(lèi)型、培養(yǎng)基配方及最佳培養(yǎng)條件方面取得了進(jìn)展與突破。 1993）通過(guò)番木瓜種子幼胚下胚軸愈傷組織分化建立了高頻體細(xì)胞胚胎發(fā)生與植株再生體系，提出了誘導(dǎo)下胚軸胚性愈傷組織發(fā)生 3 的激素和蔗糖水平，在誘根階段使用 固體培養(yǎng)基，時(shí)轉(zhuǎn)入 “蛭石培養(yǎng)基 ”（ 燥的蛭石與 體培養(yǎng)基等體積混合，高溫高壓滅菌），至根系發(fā)育良好后移入花盆培養(yǎng)。在外植體方面，（ 1994）做了更多的嘗試，他采用番木瓜葉片、小葉柄、莖段和根為外植體進(jìn)行愈傷組織的培養(yǎng)，試驗(yàn)結(jié)果指出，胚性愈傷組織的誘導(dǎo)，其發(fā)生率很大程度上與外植體的選擇有關(guān)。胚性愈傷組織誘導(dǎo)、生長(zhǎng)和其表現(xiàn)型的決定因素是外植體的來(lái)源，但培養(yǎng)基的激素成份也是一個(gè)重要的因素。通過(guò)愈傷組織可以分化出大量叢芽，繼而增殖培養(yǎng)，最后可在 1/2 的培養(yǎng)基上培養(yǎng)生根。 （ 1987）以根為外植體，在含 養(yǎng)基上培養(yǎng)三個(gè)月、 （ 1983）以胚珠為外植體，在附加 20%椰乳的 1/2養(yǎng)基上培養(yǎng)三個(gè)月，均獲得了體胚。另外，葉克難等（ 1991）以根、莖為材料，通過(guò)懸浮培養(yǎng)，獲得了大量體胚并再生植株；朱西儒等（ 2001）以葉為外植體，誘導(dǎo)胚性愈傷組織并實(shí)現(xiàn)了植株再生。 離體培養(yǎng)再生植株途徑中，莖尖培養(yǎng)可以直接誘導(dǎo)腋生枝萌發(fā)。對(duì)于離體快速繁殖而言，莖尖和側(cè)芽是最好的外植體選擇。關(guān)于番木瓜莖尖和側(cè)芽的組織培養(yǎng)已有較多的報(bào)道，基本技術(shù)體系已經(jīng)建立，其中 番木瓜頂芽與側(cè)芽的組織培養(yǎng)中有著杰出的貢獻(xiàn)，尤其是試管苗的生根階段，對(duì)根系的發(fā)生機(jī)理和根系的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行了深入的研究。 在對(duì)番木瓜莖尖、側(cè)芽組織培養(yǎng)的影響因素進(jìn)行研究時(shí)， （ 1997）以番木瓜莖尖為外植體，研究了莖尖培養(yǎng)中鐵螯合物（ 光照水平的交互作用。 （ 1986）也發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中的大量元素、微量元素、有機(jī)物和鐵螯合物對(duì)番木瓜頂芽側(cè)芽的誘導(dǎo)、增殖和生根有很大的影響， 大量試驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立起一種新型高效的基本培養(yǎng)基 養(yǎng)基。并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行了大量的生根研究。 大量研究表明，生長(zhǎng)素的種類(lèi)和濃度的組合是影響根系誘導(dǎo)發(fā)育的重要因素。 1987） 分別將 4 種不同濃度的生長(zhǎng)素 氯苯氧乙酸）、 獨(dú)加入培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn) 10 的 適合誘根，但高濃度的生長(zhǎng)素會(huì)產(chǎn)生粗短的根和矮化的植株。曾繼吾、易干軍等（ 2003）發(fā)現(xiàn)，番木瓜體胚發(fā)生的試管苗根系誘導(dǎo)和分化率低，最高生根率僅為 且生根根系質(zhì)量差，根多疏松或成水漬狀，含水量高，容易脫水，在后來(lái)的移栽過(guò)程中成活率不高。竇敏等（ 2003）在番木瓜組培快繁試驗(yàn)中也遇到了類(lèi)似的問(wèn)題，生根率 60 70%。這可能與 4 生長(zhǎng)素對(duì)根系誘導(dǎo)、根系發(fā)育的影響作用有關(guān)。 （ 1990）認(rèn)為發(fā)達(dá)的根系產(chǎn)生于無(wú)生長(zhǎng)素的培養(yǎng)基中， 1992）提出 番木瓜根的誘導(dǎo)階段是必要的，在伸長(zhǎng)階段卻起阻礙作用。因此采用兩步生