密級 ： 論文編號 ： 中 國 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué) 院 碩士學(xué)位論文 花生青枯病抗性的分子標(biāo)記研究 A .) I .) I 摘 要 花生 (.)是世界上重要的經(jīng)濟(jì)和油料作物之一，也是許多發(fā)展中國家植物油和蛋白質(zhì)的重要來源。我國是世界上最大的花生生產(chǎn)、消費和出口國，花生生產(chǎn)的發(fā)展對于增加農(nóng)民收入和保障國家食物安全具有重要意義。由 起的細(xì)菌性青枯病是花生生 產(chǎn)中重要的病害之一，我國常年有 40 萬 育和種植抗病品種是防治這一病害最為經(jīng)濟(jì)有效的途徑。國內(nèi)外在花生抗青枯病育種中已取得一定進(jìn)展，抗病品種的推廣起到了良好的防治作用。但是，我國的青枯病區(qū)普遍是花生低產(chǎn)區(qū)，抗青枯病品種在抗性水平、抗性穩(wěn)定性、產(chǎn)量潛力及品質(zhì)性狀等方面還存在諸多缺陷，其原因與已有育種研究中所選用抗病親本的遺傳基礎(chǔ)狹窄有關(guān)，同時現(xiàn)有抗性鑒定與篩選技術(shù)主要依靠田間試驗，受環(huán)境影響較大，且費時費力，使近十多年來抗病育種進(jìn)展緩慢。因此，有必要提高青枯病育種中親本選配的針對性，豐富親 本材料的遺傳背景，同時建立青枯病抗性篩選的新方法。在此背景下，本研究對抗青枯病花生種質(zhì)進(jìn)行了 態(tài)性分析，明確了它們在分子水平上的分化和多樣性，同時利用抗、感品種雜交獲得的近交重組系群體（ 過抗性鑒定和 態(tài)性分析，在國內(nèi)外首次獲得了與花生青枯病抗性連鎖的 要研究結(jié)論如下： 1、建立了 24 份不同類型抗青枯病花生種質(zhì)的 紋圖譜，僅用 6 對引物即可有效區(qū)分這些種質(zhì)材料（ 為抗病種質(zhì)的分子鑒別奠定了基礎(chǔ)。 2、在分子水平上明確了我國抗青枯病花生種質(zhì)的抗病種質(zhì)的遺傳多樣性。發(fā)現(xiàn)龍生型與珍珠豆型在分子水平上存在類型間的系統(tǒng)差異，篩選到兩個遺傳差異較大的珍珠豆型高抗種質(zhì)“遠(yuǎn)雜 9102”和“ 89可以作為抗青枯病育種的核心親本。 3、利用“中花 5號遠(yuǎn)雜 9102”雜交組合的 國內(nèi)外首次獲得了與花生青枯病抗性基因連鎖的兩個分子標(biāo)記“ “ 根據(jù)群體抗性鑒定結(jié)果，結(jié)合 析數(shù)據(jù)并經(jīng)兩點測驗，明確這兩個標(biāo)記與抗性基因間的交換值分別為 換算后，兩個標(biāo)記與抗性基因間的遺傳距離分別為 4、用 10 個抗青枯病花生種質(zhì)對上述兩個分子標(biāo)記的有效性進(jìn)行了驗證。在 7個抗病種質(zhì)中檢測到標(biāo)記 5個抗病種質(zhì)檢測到標(biāo)記 步明確了兩個標(biāo)記在多數(shù)抗青枯病花生種質(zhì)的鑒定和的應(yīng)用價值。 關(guān)鍵詞：花生， 枯病，分子標(biāo)記 .) is an in It is an of in is in of of is s is is 00,000 is to of to in to in on in in in is It is to of In of to of a 102”. as 1. 4 to of 4 be by 4 be by 12a at 2. In to on on in At is of in to “102” 89 be as 3. in to in 3by SA 102 ”. 134. to to of 3 1 be in in 錄 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究背景 1 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 1 生產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀 1 生青枯病及其防治概述 2 青枯病種質(zhì)收集與鑒定 3 生青枯病的抗性遺傳 4 生青枯病的抗性機(jī)制 5 生抗青枯病育種研究現(xiàn)狀 5 生抗青枯病育種存在的問題 5 子標(biāo)記技術(shù)及其在作物育種中的應(yīng)用 6 究目的與意義 9 第二章 花生抗青枯病的遺傳多樣性 10 料與方法 10 青枯病花生材料 10 劑及儀器 10 法 11 驗設(shè)計 15 生種質(zhì)抗性鑒定 15 生抗青枯病種質(zhì)的 析 15 據(jù)統(tǒng)計與分析 16 果與分析 16 青枯病花生種質(zhì)的鑒定 16 青枯病花生種質(zhì)的 析 16 第三章 花生青枯病抗性的分子標(biāo)記 21 料與方法 21 體構(gòu)建材料 21 法 21 驗設(shè)計 21 本材料一致性的檢驗 21 組近交系抗性的鑒定 22 選顯示親本間多態(tài)性的 物 22 抗池和感池的構(gòu)建及抗感池間多態(tài)性引物的篩選 22 生青枯病抗性連鎖的分子標(biāo)記 22 據(jù)統(tǒng)計與分析 22 果與分析 22 本材料的一致性 22 本材料的抗性 23 組近交系的青枯病抗性鑒定結(jié)果 23 選 態(tài)性引物 29 池和感池的構(gòu)建及抗感池間多態(tài)性引物的篩選 29 生青枯病抗性連鎖的分子標(biāo)記 30 第四章 花生青枯病抗性分子標(biāo)記的驗證 32 料與方法 32 料 32 法 32 果與分析 32 第五章 結(jié)論與討論 34 于花生抗青枯病種質(zhì)的遺傳多樣性 34 生抗青枯病種質(zhì) 紋圖譜的構(gòu)建 34 生抗青枯病育種親本的選擇 34 于花生青枯病抗性的分子標(biāo)記 35 記及其在花生上的應(yīng)用潛力 35 記的轉(zhuǎn)化與應(yīng)用 35 于重組近交 系的構(gòu)建 36 論 36 參考文獻(xiàn) 37 致謝 43 作者簡歷 44 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究背景 1 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究背景 內(nèi)外研究現(xiàn)狀 生產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀 花生 (.)是世界范圍內(nèi)重要的 油料和經(jīng)濟(jì)作物之一，是發(fā)展中國家重要的食用植物油和蛋白質(zhì)來源。目前全球花生年種植面積 2400萬公頃，年總產(chǎn) 3400萬噸左右。花生起源于南美洲，目前在各大洲均有種植，尤其在熱帶和亞熱帶的干旱及半干旱地區(qū)種植相當(dāng)普遍，在全球北緯 40至南緯 40之間的廣大地區(qū)，只要熱量充足，均可種植花生。亞洲是 20世紀(jì)花生種植規(guī)模最大的地區(qū)，占全球花生種植面積的 70左右，其中中國和印度是主要的花生生產(chǎn)國，占本地區(qū)花生種植規(guī)模的 90，其他亞洲國家種植花生較多的有印度尼西亞、緬甸、孟加拉國和越南等。非洲的花生種植面積僅次于亞洲 ，尼日利亞、塞內(nèi)加爾、蘇丹和南非等是主要的花生生產(chǎn)國。美洲花生種植規(guī)模居各大洲第三位。在北美洲，美國是主要的花生生產(chǎn)國，在南美洲，阿根廷和巴西是花生主要生產(chǎn)國。歐洲多數(shù)地區(qū)不適合種植花生，僅在保加利亞、希臘、西班亞和南斯拉夫等南部地區(qū)有少量種植。澳大利亞是澳洲花生主要生產(chǎn)國。 我國是世界花生生產(chǎn)大國，也是花生消費大國，在全球花生生產(chǎn)中舉足輕重。據(jù)中國農(nóng)業(yè)年鑒（ 2004）和農(nóng)業(yè)部（ 2004）統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示， 2003 年世界年收獲面積為 公頃，年均總產(chǎn)為 噸，平均單產(chǎn)約為 斤 /公 頃，其中同期印度年均種植面積約為 830 萬公頃，占世界花生面積的 居首位；總產(chǎn) 750萬噸左右（占世界總產(chǎn) ，居第二位。我國花生種植面積為 公頃，僅次于印度居世界第二位，占世界花生面積的 但年均總產(chǎn) 1342萬噸，居世界首位，占世界花生總產(chǎn)的 單產(chǎn)比世界平均水平高一倍并已整體趕上美國的花生生產(chǎn)水平。自 1993 年以來，我國花生總產(chǎn)一直穩(wěn)居世界第一位，因此就總產(chǎn)而言我國是世界最大的花生生產(chǎn)國。 花生在我國各省、市、自治區(qū)均有種植，但主要分布在山東、河南、河北、 安徽、廣東、廣西、四川、江蘇、湖北、湖南等各省，其中山東、河南兩省的種植面積在 90 萬公頃以上。自二十世紀(jì) 80年以來的 20 多年中，我國花生生產(chǎn)得到了穩(wěn)步發(fā)展。 隨著我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，我國花生種植規(guī)模將進(jìn)一步擴(kuò)大； 花生需求量的加大和經(jīng)濟(jì)效益的提高，這也是我國花生生產(chǎn)發(fā)展的主要原因。 花生在我國國民經(jīng)濟(jì)和社會發(fā)展中具有重要的地位和作用?；ㄉ侵匾氖秤弥参镉秃偷鞍踪|(zhì)來源，我國花生總產(chǎn)中有 50 于榨油（與全球花生榨油比率相近），是花生消費的首要用途，占我國植物油脂的比率為 17，僅次于菜籽油和大豆油， 居第三位。長期以來，我國植物油脂供應(yīng)缺口較大， 20 世紀(jì) 90 年代國內(nèi)油脂消費量的三分之一左右依賴進(jìn)口，并且隨著我國人民生活水平的不斷提高和食物結(jié)構(gòu)的改善，花生的消費比率將呈上升趨勢?；ㄉ鷮ξ覈秤玫鞍椎墓┙o同樣具有重要作用，花生仁蛋白質(zhì)含量為 28，我國花生總產(chǎn)中有 32左右用于直接食用和食品加工，平均年食用花生（仁）消費量在 400 萬噸以上，折合優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì) 80 萬噸，由于我國也是蛋白質(zhì)供給缺口很大的國家，油料蛋白質(zhì)進(jìn)口量也逐年上升?；ㄉa(chǎn)的發(fā)展對于增加我國蛋白質(zhì)供給也具有重要作用。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究背景 2 花生在增加農(nóng)民收入和出口創(chuàng) 匯中具有重要作用。近幾年來，隨著花生單產(chǎn)水平的提高，花生在大宗農(nóng)作物中的比較效益較高，同時受國內(nèi)油脂供應(yīng)短缺的影響，花生的市場價格一直較高且較為穩(wěn)定，使花生的生產(chǎn)效益普遍高于其他大田作物，在大宗作物中單位面積收益居首位，對增加農(nóng)民收入有重要意義?；ㄉ俏覈隹诹孔畲蟮挠土献魑?，近五年來，我國花生出口量保持在 30國內(nèi)花生總產(chǎn)的 5，占世界花生貿(mào)易量的 40以上，長期以來，我國食用型花生仁的國內(nèi)市場平均價格比美國花生價格和國際市場價格低 20以上，具有相對較強(qiáng)的國際競爭力，是我國加入 調(diào)整農(nóng) 業(yè)結(jié)構(gòu)、增加農(nóng)民收入和參與國際競爭的優(yōu)勢作物。 生青枯病及其防治概述 生青枯病的分布與流行 花生青枯病是由 起的細(xì)菌性枯萎病，在花生的細(xì)菌病害中，青枯病的經(jīng)濟(jì)重要性居首位。花生青枯病是一種典型土傳維管束病害，在自然條件下，病原菌從根部侵入花生植株，通過在根和莖部維管束木質(zhì)部增殖和一系列生化作用使導(dǎo)管喪失輸水功能而突發(fā)性死亡。剛發(fā)病的植株仍可保持綠色，根或莖基部橫切面可溢出白色菌液，這 是青枯病的一大診斷特征?；ㄉ嗫莶∮?1905 年在印度尼西亞首次報道，隨后在 20多個國家均有過發(fā)生和流行的報道。目前，主要以中國、印度尼西亞和越南危害較嚴(yán)重。 我國關(guān)于花生青枯病報道始見于 30年代后期。目前，我國廣東、廣西、海南、四川、湖北、江西、湖南、浙江等 17 個?。ㄗ灾螀^(qū)）均有該病發(fā)生，每年全國實際病地面積在 40 萬 要集中在廣東、廣西、海南、福建和長江流域。在上述病區(qū)，種植感病品種時，一般發(fā)病率在10%減產(chǎn) 20%以上；重病區(qū)發(fā)病率可在 50%以上，嚴(yán)重病區(qū)可高達(dá) 100%，導(dǎo)致完全絕收。 從世界范圍來看，花生青枯病在地域分布上是相對孤立的，不如蕃茄、馬鈴薯等作物青枯病廣泛，該病在同一地區(qū)，病地與非病地相距甚近而分界明顯。 花生青枯病的流行與土質(zhì)、溫度、降雨等有很大關(guān)系。 1986)和 983)在溫室研究表明重粘土有利于病害發(fā)生； 候緒友（ 1990）等報道土壤容重與發(fā)病率呈顯著負(fù)相關(guān)，而土壤非毛管孔酸度 和土壤中的空氣量與發(fā)病率呈正相關(guān)。 在自然病區(qū)，氣溫日均穩(wěn)定在 2O以上、 5厘米土層溫度穩(wěn)定在 25以上約 5一 8天，田間花生植株上即開始出現(xiàn)病癥 。 旬平均氣溫在 25 以上、土溫在 3O左右，發(fā)病進(jìn)到高蜂。一般土溫比氣溫對發(fā)病的影響大。在土溫、氣溫均適于發(fā)病，又逢久旱降雨，雨后突然轉(zhuǎn)晴時，病害發(fā)生嚴(yán)重。相反，長期多雨則病害發(fā)生緩慢。 此外土壤含菌量、品種的抗性、地形地貌、種植制度、栽培措施等也對病害流行有一定影響。 枯菌特性與傳播 植物青枯菌寄主植物范圍極廣，是除土壤農(nóng)桿菌外侵染植物種類最多的一個病原細(xì)菌，可以侵染擬南芥、蕃茄、馬鈴薯、花生、辣椒等 200多種植物。目前青枯菌共劃分為 5個小種， 5個生物型。侵染花生的青枯菌均屬 1號小種，亞洲花生菌系為生物型 3和 生物型 4，美洲的花生菌系為生物型 1。李文溶等（ 1987）將全國各地收集到的 36個菌株分為 7個致病型，其中 和 型是優(yōu)勢致病型；陳曉敏（ 2000）研究表明福建花生青枯菌致病型為 和 型，其中 型是優(yōu)勢致病型。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究背景 3 但目前還沒有發(fā)現(xiàn)青枯菌株與花生品種間有明顯的專化性存在。 花生青枯菌在土壤中棲息，近距離由土壤、流水以及農(nóng)具、人畜、昆蟲等傳播（ 李文溶， 1990），遠(yuǎn)離疫區(qū)的新病區(qū)的病原菌來源有以下可能： (1)病原菌早已存在，只是以前因數(shù)量少或環(huán)境不適而未發(fā)病和檢測到； (2)病原菌發(fā)生自發(fā)突變或誘發(fā)突變，使其從無毒性變?yōu)?有毒性菌系； (3)外地傳入。 從病株上收獲的花生莢果，種皮甚至種子內(nèi)部都可分離到有活性的青桔菌。 據(jù) 1990)試驗，從病株上收獲的帶菌種子播種 (消毒土壤 )后，可在 2 4周內(nèi)出現(xiàn)青枯病病癥。 生青枯病防治 目前花生青枯病防治措施主要有以下幾種方法：化學(xué)防治、輪作、生物防治、培育和選用抗病品種。作為土傳病害花生青枯病很難用化學(xué)方法防治，同時化學(xué)方法容易造成環(huán)境污染；較長周期的輪作有一定效果，但受耕地面積的限制；生物防治也是重要的方法，并取得一定效果， 福建農(nóng)科院研究員劉波博士 （ 2003） 獲得了具有自主知識產(chǎn)權(quán)的植物青枯病生防菌株 8098 75 85 。由于花生青枯病在花生各個時期（苗期、初花期、盛花期等）均有發(fā)生，應(yīng)用化學(xué)防治和生物防治，增加費用。因此培育和選用抗青枯病花生品種仍是當(dāng)前最重要的防治方法。 青枯病種質(zhì)的收集與鑒定 生青枯病抗性的鑒定方法 目前花生青枯病鑒定方法主要有兩種：田間自然鑒定和人工接種鑒定。 1)田間自然鑒定：在自然病區(qū)選擇青枯病歷年感病品種發(fā)病率在 70以上的地塊作為病圃，同時病圃土壤質(zhì)地、肥 料和發(fā)病程度均勻一致。田間種植可以是單行區(qū)，也可以是多行區(qū)，一般單行區(qū)每隔 10行種植典型的抗病品種和感病品種作為對照，多行區(qū)每隔 10行設(shè)置雙對照（抗病品種和感病品種各一個）。將要鑒定的材料單粒播種，也可雙粒播種。出苗后發(fā)病前調(diào)查清楚各區(qū)的基本苗數(shù)，并定期調(diào)查記載田間發(fā)病情況，注意辨別枯萎癥狀，剔除根腐、莖腐病造成的死苗，以成活植株百分率劃分抗性級別，抗性分級如下： 抗?。?R）：抗病率在 80以上； 中抗（ 抗病率在 65 間； 感?。?S）：抗病率在 35 間； 高感（ 抗病率在 35以下。 2）人工接種鑒定：從自然病圃采集新鮮的病株分離細(xì)菌，用三氯苯基四氮唑（ 養(yǎng)基挑選中心粉紅色、邊緣乳白色的菌落，再轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng) 48 小時（ 28）。用無菌水沖洗菌落配制成 6億 /毫升左右的菌液，浸種 20 分鐘后播入沙土，及時澆水保證濕度。設(shè)置典型抗病品種和感病品種作為對照。出苗后調(diào)查記載基本苗數(shù)，定期調(diào)查發(fā)病情況。在感病對照發(fā)病率在 80以上，抗病對照的發(fā)病率小于 20的情況下，以植株存活率劃分抗性級別，還可以根據(jù)癥狀分級來區(qū)分不同材料的抗性相對差異。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究背景 4 生青枯病 抗性種質(zhì) 自從 20 世紀(jì)初印度尼西亞首次發(fā)現(xiàn)抗青枯病花生種質(zhì)以來，印度尼西亞育成了 1并以此創(chuàng)造了一批抗病資源，國際半干旱所（ 保存的一些由世界各地收集來的地方品種在印度尼西亞進(jìn)行了抗性鑒定，并獲得了一些新的資源。我國花生抗青枯病篩選鑒定工作最早在 20 世紀(jì) 30年代進(jìn)行， 70年代中期（ 1974中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所組織全國協(xié)作攻關(guān)，對當(dāng)時收集到的花生品種進(jìn)行抗性鑒定，篩選到以“協(xié)抗青”為代表的幾個疏枝亞種抗源。到 2000 年，世界范圍內(nèi)鑒定出高抗青枯病的花生地方 品種超過 120 份，二倍體野生花生中也發(fā)現(xiàn) 20 多份抗青枯病材料。我國段乃雄（ 1993、 1994），姜慧芳（ 1998）先后 對 5700 份花生資源進(jìn)行抗青枯病篩選 ， 并 篩選出高抗青枯病資源 102 份 。唐榮華（ 2000）對 27 份野生花生進(jìn)行了抗性鑒定，篩選到 7份高抗青枯病的資源。但是迄今尚未發(fā)現(xiàn)對青枯病表現(xiàn)免疫的花生材料，所有抗性材料在高病害壓力下均出現(xiàn)植株枯死或局部病狀。 抗青枯病 種質(zhì)的創(chuàng)新 主要來源于現(xiàn)有的栽培品種和野生資源，一般利用現(xiàn)有的抗性資源與目前主栽品種雜交，轉(zhuǎn)移其抗性，從而獲得抗青枯病新材料；也可以將野生花生 抗病基因通過遠(yuǎn)緣雜交、組織培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)導(dǎo)入栽培品種，如河南省農(nóng)科院利用野生種 過遠(yuǎn)緣雜交育成了花生抗青枯病新品種遠(yuǎn)雜 9102和遠(yuǎn)雜 9307。 枯病的抗性遺傳 大量研究表明花生青枯病抗性是由寡基因控制，但存在微效基因的修飾作用。如珍珠豆型花生的抗性受 2 對主效基因控制（廖伯壽等）；珍珠豆型和多粒型花生抗源對青枯病的抗性表現(xiàn)為部分顯性（廖伯壽等， 1986）或隱性（王玉瑩等， 1985）；而龍生型花生的青枯病抗性也表現(xiàn)為部分顯性，其顯性程度比蔬枝亞種抗源高，并且龍生型存在明顯細(xì) 胞質(zhì)效應(yīng)（廖伯壽等， 1994），上述遺傳特性的產(chǎn)生可能與龍生型花生的生長習(xí)性有關(guān)，一般而言，蔓生、晚熟的花生材料發(fā)病潛伏期長，發(fā)病速度慢，容易只表現(xiàn)局部癥狀，而直立、早熟的珍珠豆型花生或多粒型花生則潛伏期短，發(fā)病速度快。雜交實驗表明，利用密枝亞種與蔬枝亞種的抗源雜交在 4代分離出感病家系，說明兩個亞種的抗病基因存在抗性基因或等位點的分化（廖伯壽， 1995）。由于我國龍生型花生中抗病基因型頻率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它三大類型，而且抗病的龍生型花生均來自病害重而病原菌分化較大的南方濕熱地區(qū)，因此龍生型花生存在青枯病抗 性遺傳基礎(chǔ)分化也是可能的。 而在擬南芥上發(fā)現(xiàn)了隱性單基因 制青枯病抗性（ 2001），同時也發(fā)現(xiàn)了擬南芥抗青枯病材料 青枯菌株 抗性為單一顯性位點（ 2002），這可能是研究材料不一樣造成的，不同材料對青枯病抗性不一樣。李海濤（ 2002）在茄子研究證明不同材料抗性不一樣，抗病材料 由 1基因控制，其中一對基因是主效基因，而抗病材料中 2對基因是主效基因。 封林林 （ 2003） 結(jié)果表明，茄子對青枯病的抗性遺傳規(guī)律 符合 “ 加性 顯性 ” 效應(yīng)模型。遺傳效應(yīng)中同時存在加性效應(yīng)、顯性效應(yīng)和 細(xì)胞質(zhì) 效應(yīng)，但以加性效應(yīng)為主。茄子對青枯病的抗病性表現(xiàn)隱性，感病性表現(xiàn)部分顯性。 迄今關(guān)于花生、擬南芥、 茄子 等作物青枯病抗性遺傳表現(xiàn)有較大差異，與所涉及試驗材料的遺傳背景有關(guān)，對青枯病抗性遺傳也還需進(jìn)一步深入研究。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究背景 5 生青枯病的抗性機(jī)制 關(guān)于花生青枯病抗性機(jī)制，國內(nèi)外尚缺乏較為系統(tǒng)的研究。單志慧對抗感花生品種接種青枯菌后，用 現(xiàn)抗感花生品種都能檢測到青枯菌，只是青枯菌的濃度不一樣，這也說明花生抗青枯 病機(jī)制存在“抗侵入”和“抗擴(kuò)展”兩種機(jī)制?！翱骨秩搿敝饕c花生根系的形態(tài)結(jié)構(gòu)和根系表皮的通透性有關(guān)，在疏枝亞種的抗病品種與感病品種已發(fā)現(xiàn)這種差異。 迄今尚未發(fā)現(xiàn)對青枯病表現(xiàn)免疫的花生材料，所有抗性材料在合適的病害處壓力下均出現(xiàn)植株枯死或局部病狀，這也說明花生抗病品種和感病品種受 青枯菌侵染是普遍的，“抗侵入”是一個只具相對差異的抗性成分，而“抗擴(kuò)展”應(yīng)是更重要的抗性成分。 植物對病原菌侵入的抗性是寄主在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化等方面在時間和空間上的綜合表現(xiàn)。寄主植物的抗病機(jī)制包括預(yù)存性被動機(jī)制以及被病原菌侵染后誘發(fā)產(chǎn) 生的主動防衛(wèi)機(jī)制。 抗病和感病的重要區(qū)別就在于寄主植物對病原侵入識別的時間性和激發(fā)寄主植物防衛(wèi)機(jī)制的速度和有效性，感病植物由于防衛(wèi)反應(yīng)慢且信號弱，最終導(dǎo)致病原的蔓延而使植物受到嚴(yán)重?fù)p害。 而這些防衛(wèi)反應(yīng)包括酚類化合物的增加、植保素的合成、某些酶活性的提高以及脯氨酸的積累等。 彭忠（ 1994）在研究花生青枯病抗性的生化機(jī)制中發(fā)現(xiàn)多酚類化合物、 化酶、 生接種青枯菌后，在抗病品種中多酚類化合物含量增加， 感病品種則相反。同功酶系統(tǒng)也有顯著變化。抗 病 品種的過氧化物酶帶數(shù)增多且活性增強(qiáng) ,酯酶帶則有部分消失和新帶出現(xiàn) ,而感病品種中過氧化物酶帶變化很小 , 單志慧 (1995)研究也表明 抗性品種酯酶帶有大量新帶出現(xiàn)。 廖伯壽（ 1997）研究表明花生中也遍存在不表現(xiàn)癥狀的潛伏侵染現(xiàn)象，不同品種抗性差異表現(xiàn)在對青枯菌在植物體內(nèi)由下向上運動的限制能力不同，這與 1994）、 1992）在存活率很高的蕃茄抗病品種中研究結(jié)果相似。 花生青枯病抗性基因的研究僅姜慧芳（ 2003）用 的研究。主要是由于先前的研究表明栽培種花生在分子水平上差異貧乏，從而延遲了分子標(biāo)記在花生上的應(yīng)用。 生抗青枯病育種研究現(xiàn)狀 印度尼西亞育成世界上第一個花生抗青枯病品種 1，隨后又育出 花生品種（ 1986）。我國也在上個世紀(jì) 80 年代中后期、 90 年代前期先后育成魯花 3號（ 1984）、鄂花 5號（ 1985）、粵油 92（ 1986）、桂油 28（ 1987）、中花 2號（ 1990）、粵油 256（ 1991）。由于我國的花生青枯病面積比較大，分布 地域廣，這些適應(yīng)不同生態(tài)區(qū)的抗病品種的育成和利用顯著地克服了過去病區(qū)種植感病時的大面積枯死甚至絕收的問題，對當(dāng)時的花生發(fā)展起了決定性單株生產(chǎn)力作用。 90 年代后期也培育出許多抗青枯病的品種或品系，如中花 6號、粵油 200（天府 11號）、遠(yuǎn)雜 9102和遠(yuǎn)雜 9307等已經(jīng)在生產(chǎn)上大面積應(yīng)用。 生抗青枯病育種存在的問題 1）花生抗青枯病親本的遺傳基礎(chǔ)狹窄。世界范圍內(nèi)已經(jīng)鑒定出許多抗青枯病花生種質(zhì)，但是大多數(shù)未應(yīng)用到育種上，目前在我國應(yīng)用于育種主要親本是協(xié)抗青、臺山珍珠和臺山三粒肉等及它們衍生出來的材料，導(dǎo) 致花生抗青枯病的抗源遺傳基礎(chǔ)比較狹窄，國外也存在同樣的問題。中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究背景 6 抗性資源遺傳基礎(chǔ)狹窄，限制了抗病育種的產(chǎn)量的持續(xù)提高，已有的研究表明，花生在單株莢果數(shù)、莢果產(chǎn)量、籽仁大小和出仁率等經(jīng)濟(jì)性狀上都表現(xiàn)出雜種優(yōu)勢。從遺傳上來說，擴(kuò)大花生青枯病育種的遺傳基礎(chǔ)將有助于選擇差異較大的親本材料，提高花生產(chǎn)量。而僅從形態(tài)學(xué)選擇親本，由于形態(tài)學(xué)性狀是基因與環(huán)境的互作的結(jié)果，這樣選擇的親本遺傳異質(zhì)性不一定大。若從分子水平上選擇親本，將有助于減少環(huán)境因素的影響，從而更容易選擇到遺傳異質(zhì)性大的親本。 2）缺乏有效的抗性鑒定手段。田間自 然發(fā)病鑒定是以最后植株的存活率計算抗性。由于病圃的土壤質(zhì)地、肥料和發(fā)病率不可能均勻一致，同時不同年份間的發(fā)病率也不一致，這就導(dǎo)致了田間自然鑒定的誤差。印度尼西亞鑒定的抗青枯病材料，經(jīng)國際半干旱所（ 次在當(dāng)?shù)罔b定時表現(xiàn)不抗，在我國引進(jìn)的抗青枯病資源也存在這個問題。 多年多點試驗鑒定雖可以解決這個問題，但是花生繁殖系數(shù)比較低，雜交早代不可能有大量的花生種用來鑒定青枯病抗性。 常規(guī)的花生育種雖然可獲得帶有目標(biāo)基因的抗性材料，但同時也攜帶其它不必要的基因，許多抗病品種的產(chǎn)量并不高，這與抗病品種抗性基因 連鎖的其它基因與產(chǎn)量呈負(fù)相關(guān)有關(guān)；同時常規(guī)抗病育種周期長、工作量大和抗病鑒定不穩(wěn)定。隨著 生青枯病的抗性鑒定和遺傳改良研究正在向分子水平擴(kuò)展。分子標(biāo)記技術(shù)在花生抗青枯病育種上的應(yīng)用，將縮短育種周期、減少工作量和增加抗性鑒定的穩(wěn)定性。 子標(biāo)記技術(shù)及其在作物育種中的應(yīng)用 子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展 分子標(biāo)記是在分子生物學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新一代遺傳標(biāo)記，與原有的形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記、生化標(biāo)記不同，分子標(biāo)記是建立在對 基因的直接反應(yīng)。分子標(biāo)記能對各個發(fā) 育時期的生物體進(jìn)行檢測，不受基因表達(dá)與否及環(huán)境的影響。利用獲得的與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種，為克服常規(guī)抗性育種由于采用接種或自然脅迫進(jìn)行抗性鑒定而產(chǎn)生的實驗結(jié)果準(zhǔn)確性、重復(fù)性差，育種周期長等弱點提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。目前在多種作物上已經(jīng)獲得了大量的與作物抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，部分已開始應(yīng)用于分子輔助選擇育種。 目前，國內(nèi)外已經(jīng)開發(fā)出十幾種 據(jù)技術(shù)原理的不同，分子標(biāo)記可分為四大類： 1）基于 交的 限制性片段長度多態(tài)性（ 2）基于 3）基于 4）基于單核苷酸多態(tài)性的 記，如 下主要簡述在作物遺傳育種中廣泛應(yīng)用的 英文縮寫，由 974 年創(chuàng)立，是最早的分子標(biāo)記技術(shù)。 1980 年 1988年由 體間的核苷酸差別表現(xiàn)在對某種限制性核酸內(nèi)切酶的結(jié)合點和切點不同，酶切的結(jié)果表現(xiàn)在個體間的 段長短不同，電泳時即出現(xiàn)不同的譜帶。 失、易位、倒位、插入等多態(tài)性類型，多態(tài)性水平中等，共顯性遺傳，可靠性高。 英文縮寫。 1990年由 第一章 文獻(xiàn)綜述與研究背景 7 等提 出，是建立在 礎(chǔ)上的第一個分子標(biāo)記技術(shù)。 于雙引物在整個基因組結(jié)合位點間存在長度上的差異，經(jīng) 增后，可用電泳檢測到這種差異，表現(xiàn)為一種多態(tài)性。 術(shù)繼承了 優(yōu)點，同 比，具有操作簡單、 量少，靈敏度較高、檢測容易和不需放射性等特點，但 以區(qū)分雜合和純合基因型，易受反應(yīng)條件的影響，結(jié)果重復(fù)性差。 寫，又叫微衛(wèi)星 由 1991 年提出，其原理是根據(jù)真核生物基因組 廣泛存在著由 2每個重復(fù)單位的數(shù)量可能不完全相同，因此形成多態(tài)性，一般 過設(shè)計特異引物，進(jìn)行 以反映不同個體間的多態(tài)性。 基礎(chǔ)，兼具 寫， 1993年由 兩種限制性內(nèi)切酶切割基因組 到分子量大小不等的片段，然后在片段兩端接上特定的接頭，用與接頭相匹配的引物進(jìn)行 電泳，可檢測到分子量大小不等的擴(kuò)增產(chǎn)物，凝膠電泳檢測便可反映出多態(tài)性。與其他 有多態(tài)性豐富、 量少、無須預(yù)知基因組序列信息、多態(tài)性高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點，對于那些開展分子研究較少，基因序列未知的作物，尤其具有先進(jìn)性和實用性。 995 年問世以來，在研究生物的遺傳多樣性、圖譜構(gòu)建、基因定位、品種鑒定、分子輔助育種 等領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，涉及水稻、小麥、玉米、棉花、大豆、油菜等主要農(nóng)作物。 研究的范圍和深度遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于以上主要農(nóng)作物。 基因標(biāo)記中的應(yīng)用 利用獲得的與目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種，為克服常規(guī)抗性育種中因采用接種或自然脅迫進(jìn)行抗性鑒定而產(chǎn)生的實驗結(jié)果準(zhǔn)確性和重復(fù)性差、育種周期長等弱點提供了強(qiáng)有力的技術(shù)手段。近年來， 在大豆、大麥、馬鈴薯、水稻、小麥、玉米等重要農(nóng) 作物中開展研究外，在芥菜、黃瓜、羅卜、葡萄、向日葵等小作物中也有報道，涉及的抗性基因包括細(xì)菌、真菌、病毒等基因，針對抗逆性如耐酸性、耐澇性基因的研究也有報道。 目前，根據(jù)利用群體的不同，采用 離法和分離群體分組分析法（ 些近等基因系只有目的基因不同