密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 河南和山西野生大豆耐鹽鑒定及耐鹽 相關(guān)基因分析 I 摘 要 土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的主要非生物逆境之一。隨著人口的增加和耕地的減少，如何 開發(fā)利用鹽漬化土壤 己成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境生態(tài)亟待解決的問題。利用生物技術(shù) 深入開展種質(zhì)資源的耐鹽性研究，挖掘其中優(yōu)異耐鹽相關(guān)基因，培育耐鹽作物新品種，是改良和利用鹽漬化土地，增加糧食產(chǎn)量和維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展最為經(jīng)濟有效的策略。 野生大豆（ 栽培大豆（ 原始種，是大豆遺傳改良的寶貴資源。本實驗旨在通過對 284 份來自河南和山西的野生大豆進行芽期，苗期和全生育期的耐鹽性鑒定，篩選高耐鹽力的野生大豆種質(zhì)；利用 析，尋找耐鹽相關(guān)基因的 用序列分析技術(shù)克隆與抗逆相關(guān)的基因，并通過原核表達體系和轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行功能驗證。 本研究取得了以下研究進展： 1. 野生大豆芽期、苗期和全生育期耐鹽鑒定 對 284 份河南和山西野生大豆進行芽期和苗期耐鹽鑒定 。 共鑒定出芽期一級種質(zhì) 8 份，二級種質(zhì) 31 份，三級種質(zhì) 68 份，四級種質(zhì) 98 份，五級種質(zhì) 79 份；苗期一級種質(zhì) 19 份，二級種質(zhì)20 份，三級種質(zhì) 26 份，四級種質(zhì) 80 份，五級種質(zhì) 127 份。在田間耐鹽鑒定中篩選出五份耐鹽力較好的材料，分別是 2. 野生大豆耐鹽相關(guān)基因的 析 根據(jù)在 找到的 8 個大豆耐鹽 相關(guān)基因的 列，分段設(shè)計引物， 物片段為 150300過對耐鹽鑒定芽期和苗期均為中級的野生大豆群體內(nèi)單株的 因在野生大豆群體 存在單堿基變化位點，將 體分為兩組。 3. 野生大豆 因的克隆 通過測定所克隆到的 全基因序列，發(fā)現(xiàn)此基因片段大小與 的 過序列比對，在帶型 2 中發(fā)現(xiàn)了 7 個變化的核苷酸位點，其中有 5 個位點為同義突變，只有位于 248 位和 536 位的變化位點 影響到氨基酸編碼順序。 4. 野生大豆 因的功能分析 將克隆到的 因片段構(gòu)建到原核表達載體 ，在 導(dǎo)下表達融合蛋白， 并對表達產(chǎn)物進行 析 。 結(jié)果發(fā)現(xiàn) 誘導(dǎo)出了一條新帶，并且 h 時表達量最大，具有較好的表達活性。同時 將克隆到的 因片段構(gòu)建到真核表達載體 ，在農(nóng)桿菌的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)入擬南芥中，根據(jù) 性篩選出轉(zhuǎn)基因植株。 關(guān)鍵詞： 野生大豆， 鹽相關(guān)基因，轉(zhuǎn)錄因子， is of of s of to to to G. is G. G. is . . 284 at of of to of A. 1. of at of of in 84 at of of At of 8 , 31 , 68 , 98 9 . at of 19 , 20 , 26 , 80 27 . on 2. of to in to of CR is 50bp 00of is in be to of 3. in he of it is to is no in 7 in . 5 248 36) . in of A 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文全稱 核苷酸多態(tài)性 鏈構(gòu)象多態(tài)性 六烷基三乙基溴化氨 脫落酸 霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 移 福平 芐氰霉素 bp 基對 血清白蛋白 甲基亞砜 硫蘇糖醇 化乙錠 二胺四乙酸 哚乙酸 胎發(fā)生晚期蛋白 發(fā)閱讀框 丙烯凝膠電泳 合酶鏈式反應(yīng) SA 楊酸 二脘基磺酸鈉 羥甲基氨基甲烷 43 V 目 錄 第一章 緒 論 . 1 獻綜述 . 2 內(nèi)外植物耐鹽機制的研究進展 . 2 鹽脅迫對植物的危害 . 2 植物耐鹽機理 . 2 國內(nèi)外植物耐鹽相關(guān)基因的研究進展 . 3 植物在鹽脅迫下誘導(dǎo)表達的基因及其產(chǎn)物 . 3 植物對鹽脅迫應(yīng)答的信號傳導(dǎo)途徑 . 5 脅迫誘導(dǎo)基因的調(diào)控與表達 . 7 植物耐鹽基 因工程研究 . 8 豆耐鹽相關(guān)基因研究進展 . 9 豆在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的地位 . 9 國野 生大豆資源 . 10 生大豆在栽培大豆遺傳改良中的作用 . 11 豆分子標記研究現(xiàn)狀 . 11 豆耐鹽相關(guān)基因 . 13 究目的和實驗設(shè)計 . 14 究目的和意義 . 14 究內(nèi)容 . 14 術(shù)路線 . 15 第二章 河南和山西野生大豆資源耐鹽性鑒定評價 . 16 言 . 16 料和方法 . 17 料 . 17 法 . 17 期耐鹽性鑒定方法 . 17 期耐鹽性鑒定方法 . 17 株耐鹽性鑒定方法 . 18 生育期耐鹽性鑒定 . 18 計分析 . 19 果與分析 . 19 期耐鹽性鑒定結(jié)果 . 19 期耐鹽性鑒定結(jié)果 . 19 株耐鹽性鑒定結(jié)果 . 22 間鑒定結(jié)果 . 23 論 . 25 第三章 野生大豆耐鹽相關(guān)基因 析 . 26 言 . 26 料與方法 . 27 料 . 27 法 . 27 豆基因組 取 . 27 鹽相關(guān)基因分段引物設(shè)計 . 28 . 28 異片段測序 . 29 點分析 . 29 果與分析 . 30 物篩選結(jié)果 . 30 異片段的篩選 . 30 列測定結(jié)果 . 31 論 . 32 第四章 野生大豆 因的克隆 . 33 言 . 33 料和方 法 . 34 料 . 34 法 . 34 因組全長的獲得 . 34 物回收 . 34 隆技術(shù) . 35 列測定 . 36 物信息學(xué)分析 . 36 果分析 . 36 長基因的獲得 . 36 組體構(gòu)建及篩選 . 37 長基因分析 . 37 長基因核苷酸序列分析 . 37 長基因氨基酸序列分析 . 40 論 . 41 第五章 野生大豆 因的功能分析 . 42 言 . 42 料與方法 . 43 料 . 43 方法 . 43 生大豆 因在 的表達 . 43 的片段的獲得 . 43 核表達載體的構(gòu)建 . 44 導(dǎo)融合蛋白的表達及檢測 . 46 生大豆 因在擬南芥中的表達與功能驗證 . 48 的片段的獲得 . 48 核表達載體的構(gòu)建 . 48 化擬南芥植株 . 51 基因擬南芥的篩選 . 52 果分析 . 52 生大豆 的表達 . 52 核表達載體的構(gòu)建 . 52 化表達菌 . 54 合蛋白的誘導(dǎo)表達 . 54 生大豆 擬南芥中的表達 . 55 核表達載體的構(gòu)建 . 55 桿菌轉(zhuǎn)化 . 57 基因擬南芥植株的獲得 . 58 論 . 58 第六章 結(jié) 論 . 60 參考文獻 . 62 附錄 . 67 附錄一 河南野生大豆資源目錄 . 67 附錄二 山西野生大豆資源目錄 . 68 附錄三 河南野生大豆芽期和苗期耐鹽性鑒定結(jié)果 . 69 附錄四 山西野生大豆芽期和苗期耐鹽性鑒定結(jié)果 . 71 附錄五 河南和山西 野生大豆全生育期鑒定結(jié)果 . 72 附錄六 物列表 . 78 附錄七 部分試劑配方 . 79 致謝 . 83 作者簡介 . 84 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 土壤鹽漬化是影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的主要非生物逆境之一。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織 2000 年統(tǒng)計，全世界共有鹽漬化土地面積約 4 億多公頃，僅我國就有 7000 多萬公頃（不包括次生鹽漬化土壤面積）（ 2000），分布在西北、華北等糧食主產(chǎn)區(qū)，對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構(gòu)成了嚴重威脅。由于 工業(yè)污染 、不合理的 灌溉 以及 化肥使用 不當?shù)?人 為因素的影響，次生鹽漬化土壤的面積 仍 以每年 3% 的速度遞增 ； 同時，隨著國民經(jīng)濟的發(fā)展、城市面積的擴大和人口的不斷增長，農(nóng)用耕地不斷被蠶食。因此 ， 開發(fā)利用鹽漬化土壤， 提高土地 利用率 是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境生態(tài)亟待解決的問題。 在二十世紀八十年代初期， 1980）等提出鹽漬化土壤開發(fā)利用的二種途徑：一是環(huán)境適應(yīng)作物，即用傳統(tǒng)水土工程改良鹽堿地；二是培育適應(yīng)逆境的品種。實踐證明，第一條途徑人力、物力、財力消耗巨大，成本昂貴，并耗費大量淡水資源，目前淡水資源匱乏，因而受到極大限制。因此，選育耐 鹽品種是緩解土壤鹽漬化、次生鹽漬化對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)影響的最經(jīng)濟有效的方法（翁躍進， 2002）。 選育優(yōu)良的耐鹽品種要依賴耐鹽基因的多樣性，而豐富的耐鹽基因資源存在于多種多樣的品種（包括古今中外的品種）及其野生近緣植物當中，這些被稱作是作物種質(zhì)資源的品種及其野生親緣植物是耐鹽基因多樣性的主要組成部分。農(nóng)業(yè)起源和發(fā)展的歷史表明，作物種質(zhì)資源及其多樣性，不僅為人類的衣、食等方面提供原料，為人類的健康提供營養(yǎng)品和藥物，而且為人類的生存提供了良好的環(huán)境，尤為重要的是，它還為人們選育所需求的優(yōu)良品種，開展生物技術(shù)研究提供取之不 盡，用之不竭的基因資源。作物種質(zhì)資源的多樣性越豐富，改良栽培品種或選育新品種的潛力就越大。因此多方面挖掘和收集耐鹽種質(zhì)資源，并利用生物技術(shù)深入開展種質(zhì)資源耐鹽性研究，進而挖掘其中優(yōu)異的耐鹽相關(guān)基因，培育耐鹽作物新品種，是改良和利用鹽漬化土地，增加糧食產(chǎn)量和維持農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的中心策略。 隨著植物生理學(xué)和分子生物學(xué)的相互滲透及其技術(shù)的蓬勃發(fā)展， 人們能夠在基因組成、表達調(diào)控及信號傳導(dǎo)等分子水平上認識植物對逆境脅迫的耐 （ 抗 ) 性機理。經(jīng)過大量研究 ， 現(xiàn)今人們已在植物抗逆的形態(tài)學(xué)、生理生化、生物物理、生態(tài)以及細胞遺傳 學(xué)方面取得了廣泛進展 ， 并已克隆分離了一些鹽脅迫誘導(dǎo)表達的基因。 基因組學(xué) （ 興起與發(fā)展把當今的生物學(xué)研究推向了一個新紀元，它是研究方法的革命與飛躍。 利用基因組學(xué)的方法不但可以挖掘大量的耐（抗）性基因 ， 對其功能進行詳細的研究 ， 而且還有助于全面理解植物的抗逆機理 ， 為利用遺傳工程提高植物抗性奠定了基礎(chǔ)。采用重組 已發(fā)展成為改良植物耐 （ 抗 ) 脅迫性的新途徑。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 獻綜述 內(nèi)外 植物耐鹽機制的研究進展 鹽脅迫對植物的危害 鹽脅迫是限制植物生長的重要因素之一，據(jù)報道鹽漬化的影響涉及到 40%的灌溉土地，對農(nóng)作物的減產(chǎn)應(yīng)負 70%的責任（ et 1982）。植物遭受鹽害時表現(xiàn)黃萎、葉片變小、生長受到抑制，鹽害較嚴重時，會造成農(nóng)作物大面積減產(chǎn)，甚至顆粒無收。 鹽脅迫對作物的傷害機制有兩種 ： 一是離子傷害。鹽脅迫下 ， 作物被迫吸收鹽離子，由于鹽離子的毒害作用，造成活性氧等自由基產(chǎn)生和修復(fù)系統(tǒng)的動態(tài)平衡被破壞，啟動了膜脂過氧化作用或膜蛋白過氧化作用，造成膜脂或膜蛋白損傷，從而破壞膜結(jié)構(gòu)，使質(zhì)膜 的透性增加，胞內(nèi)水溶性物質(zhì)外滲，作物表現(xiàn)出鹽害特征。二是滲透脅迫，土壤中的鹽分使土壤溶液的水勢降低，作物吸水困難造成“生理干旱”，從而表現(xiàn)出鹽害癥狀（趙可夫， 1999）。 植物耐鹽機理 為了適