密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 博士 學(xué)位論文 熒光假單孢菌 脂肪酶 基因的克隆、改造及 其 在畢赤酵母中 的 表達(dá) of a of a 要 脂肪酶（ 一種 廣泛存在的水解酶，能夠催化甘油三酯酯鍵的斷裂。除此之外，脂肪酶還具有多種酶活性。因其催化功能的多樣性及 作為一種生物催化劑的優(yōu)越性，脂肪酶在許多領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。 在動物體內(nèi)，胰腺 分泌脂肪酶用于消化食物中的脂肪。將脂肪酶作為飼料 添加劑應(yīng)用于動物養(yǎng)殖中具有廣闊的應(yīng)用前景，首先脂肪酶可以消除植物性飼料原料中的脂質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)可以彌補(bǔ)幼禽幼畜消化道內(nèi)脂肪酶的不足。但是已實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的脂肪酶產(chǎn)品中， 定性多在中性偏堿范圍內(nèi)，對酸的耐受性較差， 適合于飼料用的品種 很少 ，目前國內(nèi)外也尚未見有對適合于飼料用的耐酸性脂肪酶的表達(dá)研究。本論文以畢赤酵母表達(dá)適合于飼料用脂肪酶為研究目標(biāo)， 對熒光假單孢菌脂肪酶基因進(jìn)行了克隆、改造并分別將原始基因和改造基因在畢赤酵母中進(jìn)行了表達(dá)， 主要工作包括 以下內(nèi)容： 1對 發(fā)表的熒光假單孢菌脂 肪酶基因序列進(jìn)行比對，根據(jù)兩個(gè)同源性高的區(qū)域序列設(shè)計(jì) 簡并 引物，以基因組 模板 增到基因內(nèi)部的一段序列，然后應(yīng)用反向 得了完整的基因序列，已在 冊，登錄號： 2根據(jù)畢赤酵母密碼子的偏愛性， 同時(shí)綜合真核基因表達(dá)中影響表達(dá)調(diào)控的因素， 在不改變氨基酸序列的基礎(chǔ)上對熒光假單孢菌脂肪酶基因進(jìn)行了密碼子改造。通過 合酶反應(yīng)，獲得了改造的熒光假單孢菌脂肪酶基因。 3將熒光假單孢菌脂肪酶原始基因和改造基因在畢赤酵母 進(jìn)行了分泌表達(dá)，搖瓶水平 誘導(dǎo)液 酶活力分別 為 91U/密碼子改造后表達(dá)量提 高 了 2 倍以上 。 4 重組脂肪酶具有優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)： 最適 10 范圍內(nèi)，脂肪酶的相對活力都在 60以上； 12 處理 30 仍然保留了較高的酶活力，均在 70以上，說明該酶具有較強(qiáng)的酸堿耐受性；最適作用溫度為 50 ，在 35 60 酶相對活力在 60以上；該酶具有較強(qiáng)的耐熱性， 60 保溫 30 余酶活力依然達(dá)到 70；金屬離子對脂肪酶酶活力影響不大；重組脂肪酶能夠抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的水解。 綜合以上情況，重 組熒光假單孢菌脂肪酶 能夠耐受胃液 圍內(nèi)的酸性和胃蛋白酶的作用，在消化道特別是消化的主要部位小腸的 圍內(nèi)具有較高的酶活力；具有較高的熱穩(wěn)定性，在消化道溫度范圍內(nèi)具有約 80的酶活力； 重組脂肪酶能夠抗 胰蛋白酶的水解， 因此， 熒光假單孢菌脂肪酶非常適合于應(yīng)用為飼料添加劑 。 關(guān)鍵詞：熒光假單孢菌 ， 脂肪酶 ， 基因改造 ， 畢赤酵母 ， 表達(dá) of of at a of of as In of by in an as in of in As pH is t as of In we of is to as 1. on of A CR to of 2. to in in NA a 3. . of in mL 1U/of 4. pH of 10, 0%. in .2 2, 0%, 0 . In 5 0 , 0%. It 0 0 0%. on of It pH of of In of 0%. of to . as 縮略表 縮寫 英文 中文 基對 六烷基三甲基溴化銨 d ，天 二胺四乙酸 g h 時(shí) D- 丙基 D硫代半乳糖苷 道爾頓 鐘 克酰胺腺嘌呤二核苷酸 放閱讀框 丙烯酰胺凝膠電泳 堿度 硝基苯酚 酸對硝基苯酯 分鐘轉(zhuǎn)數(shù) s 二烷基磺酸鈉 D- 溴 4氯 3吲哚 D半乳糖苷 目 錄 第一章 緒 論 . 1 1 脂肪酶的研究進(jìn)展 . 1 脂肪酶的來源及產(chǎn)脂肪酶微生物的選育 . 2 脂肪酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理 . 4 脂肪酶的性質(zhì) . 6 脂肪酶的生產(chǎn) . 8 脂肪酶的應(yīng)用 . 11 2 假單孢菌脂肪酶研究進(jìn)展 . 15 假單孢菌脂肪酶生化性質(zhì) . 15 假單孢菌脂肪酶基因克隆 . 17 假單孢菌脂肪酶基因表達(dá)調(diào)控 . 18 假單孢菌脂肪酶分泌機(jī)制 . 19 3 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展 . 20 畢赤酵母表達(dá)宿主菌 . 20 畢赤酵母表達(dá)載體 . 21 外源基因的整合 . 22 外源基因在畢赤酵母中的表達(dá) . 22 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)化 . 23 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的局限性 . 25 4 本研究的意義與目的 . 25 本研究的意義 . 25 本研究的目的 . 28 第二章 熒光假單孢菌脂肪酶基因的克隆 . 29 1 材料與方法 . 29 菌種和載體 . 29 工具酶和生化試劑 . 29 試劑盒 . 29 培養(yǎng)基及溶液配制 . 29 常用儀器 . 31 熒光假單孢菌基因組 . 31 引物設(shè)計(jì) . 32 . 33 反向 . 33 目的基因片段的回收 . 34 . 35 受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化方法 . 35 . 36 重組單克隆的 . 37 2 結(jié)果與分析 . 37 3 討論與小結(jié) . 40 第三章 熒光假單孢菌脂肪酶基因的改造 . 41 1 材料與方法 . 41 菌種和載體 . 41 工具酶和生化試劑 . 41 試劑盒 . 41 培養(yǎng)基及溶液配制 . 41 常用儀器 . 41 基因合成示意圖 . 42 引物設(shè)計(jì) . 43 基因合成過程 . 43 鏈延伸反應(yīng) . 45 . 45 片段拼接反應(yīng) . 46 目的基因片段序列測定 . 46 2 結(jié)果與分析 . 46 脂肪酶改造基因 . 47 脂肪酶改造基因 . 49 3 討論與小結(jié) . 52 第四章 熒光假單孢菌脂肪酶原始基因和改造基因在畢赤酵母中的表達(dá) . 54 1 材料與方法 . 54 菌種和載體 . 54 工具酶和生化試劑 . 54 試劑盒 . 54 培養(yǎng)基及溶液配制 . 54 儀器 . 56 重組表達(dá)載體 . 56 重組表達(dá)載體 . 57 質(zhì)粒 . 58 重組表達(dá)載體的線性化 . 59 畢赤酵母感受態(tài)的制備 . 60 轉(zhuǎn)化畢赤酵母 . 60 重組畢赤酵母的篩選 . 60 重組畢赤酵母的 證 . 61 目的基因在畢赤酵母中的表達(dá) . 61 重組脂肪酶的活力檢測 . 62 重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 . 64 2 結(jié)果與分析 . 66 重組表達(dá)載體的構(gòu)建 . 66 重組畢赤酵母的篩選和鑒定 . 68 重組畢赤酵母的誘導(dǎo)表達(dá) . 70 重組脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì)研究 . 72 3 討論與小結(jié) . 77 關(guān)于脂肪酶在畢赤酵母中的表達(dá) . 77 關(guān)于脂肪酶的活力測定 . 78 關(guān)于脂肪酶的酶學(xué)性質(zhì) . 79 第五章 結(jié)論與工作設(shè)想 . 82 1 主要研究結(jié)論 . 82 2 本研究的創(chuàng)新點(diǎn) . 83 3 下一步的工作設(shè) 想 . 83 參考文獻(xiàn) . 84 致 謝 . 97 附 錄 . 99 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒 論 二十世紀(jì) 50 年代人們已經(jīng)認(rèn)識到酶制劑在飼料中添加的作用， 但由于其生產(chǎn)成本昂貴 而進(jìn)展緩慢 ， 到 80 年代由于轉(zhuǎn)基因技術(shù)和微生物發(fā)酵工業(yè)的長足進(jìn)步，飼用酶 制劑 應(yīng)用進(jìn)入了迅猛發(fā)展的階段，不管是在學(xué)術(shù)研究方面還是在技術(shù)應(yīng)用方面，都取得了舉世矚目的成績。 酶制劑作為一種安全高效的生物催化劑可以提高畜禽和水產(chǎn)動物的生產(chǎn)性能 ； 通過消除飼料中的抗?fàn)I養(yǎng)因子，酶制劑能夠提高飼料原料特別是非常規(guī)飼料原料的利用率，開發(fā)新的飼料資源，對緩解飼料資源短缺具有巨大的 作用 ；同時(shí)，酶制劑通過提高營養(yǎng)物質(zhì)特別是氮和磷的消化 利 用，可以 有效的減少由于飼料中某些營養(yǎng) 成分大量排放造成的養(yǎng)殖業(yè)環(huán)境污染。 因此，飼料酶制劑一直是近 年來國內(nèi)外動物營養(yǎng)研究的熱點(diǎn)之一，也是生物技術(shù)在飼料工業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)用最活躍的領(lǐng)域。 飼用酶制劑的種類有很多，脂肪酶也是其中重要的一種。幼年動物分泌的內(nèi)源酶較少，成年動物處于病理、應(yīng)激狀態(tài)時(shí)內(nèi)源酶也會發(fā)生分泌障礙或分泌減少。在飼料中添加蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶等會增加消化道內(nèi)這些酶的濃度，從而加強(qiáng)相應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)的消化和利用速度，既保證了畜禽對飼料中營養(yǎng)物質(zhì)的充分利用，又有利于畜禽產(chǎn)品的整齊度。 相對于其它酶制劑而言，對于脂 肪酶的理論研究和應(yīng)用研究的投入要少的多， 其中的原因，筆者認(rèn)為， 主要 是由于脂肪酶的特殊性增加了對其進(jìn)行研究的難度，因此導(dǎo)致了對脂肪酶的研究和應(yīng)用要相對滯后。 基于這種現(xiàn)狀，對脂肪酶研究進(jìn)行一些探索性的工作，從而推動脂肪酶在飼料工業(yè)中的應(yīng)用，也是一件非常有意義的工作。 1 脂肪酶的研究進(jìn)展 脂肪酶（ 廣泛存在的一種酶，在脂質(zhì)代謝中發(fā)揮重要的作用。在油水界面上，脂肪酶催化三酰甘油的酯鍵水解，釋放更少酯鍵的甘油酯或甘油及脂肪酸。除此之外，還有 多種酶活性，例如催化多種酯的水解、合成及外消旋混合物的拆分（ ， 1991； ， 1999）。脂肪酶反應(yīng)條件溫和，具有優(yōu)良的立體選擇性，并且不會造成環(huán)境污染，因此，在食品、皮革、醫(yī)藥和洗滌中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 2 劑等許多工業(yè)領(lǐng)域中 均 有廣泛的應(yīng)用。近年來，非水相酶學(xué)的研究又進(jìn)一步拓展了脂肪酶的應(yīng)用領(lǐng)域，利用脂肪酶在有機(jī)相 中 催化的各種反應(yīng)可以合成許多高價(jià)值產(chǎn)品。脂肪酶的應(yīng)用研究正日益增加，采用它進(jìn)行新產(chǎn)品的開發(fā)也正成為眾多科學(xué)家的研究課題。 脂肪酶的來源及產(chǎn)脂肪酶微生物的選育 脂肪酶是最早被研究的酶類 之一，已有 170 多年的 研究 歷史。 1834 年報(bào)道兔胰脂肪酶； 1854 年報(bào)道胃脂肪酶 ； 1871 年報(bào)道植物種子脂肪酶；微生物脂肪酶則在二十世紀(jì)初才發(fā)現(xiàn)。 脂肪酶廣泛的存在于動植物和微生物中。植物中含脂肪酶較多的是油料作物的種子，如蓖麻子、油菜籽，當(dāng)油料種子發(fā)芽時(shí)，脂肪酶能與其他 的 酶協(xié)同發(fā)揮作用催化分解油脂類物質(zhì)生成糖類，提供種子生根發(fā)芽所必需的養(yǎng)料和能量；動物體內(nèi)含脂肪酶較多的是高等動物的胰臟和脂肪組織，在腸液中含有少量的脂肪酶，用于補(bǔ)充胰脂肪酶對脂肪消化的不足，在肉食動物的胃液中含有少量的丁酸甘油酯酶。在動物體 內(nèi)，各類脂肪酶控制著消化、吸收、脂肪重建和脂蛋白代謝等過程；細(xì)菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更為豐富（ ， 1999）。由于微生物種類多、繁殖快、易發(fā)生遺傳變異，具有比動植物更廣的作用 作用溫度范圍以及底物專一性，且微生物來源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，適合于工業(yè)化大生產(chǎn)和獲得高純度樣品，因此微生物脂肪酶是工業(yè)用脂肪酶的重要來源，并且在理論研究方面也具有重要的意義。 據(jù)估計(jì)，細(xì)菌有 28 個(gè)屬、放線菌 4 個(gè)屬、酵母菌 10 個(gè)屬、其他真菌 23 個(gè)屬共計(jì)達(dá) 65 個(gè)屬的微生物產(chǎn)脂肪酶（張樹政， 1998） 。 但 實(shí)際上，脂肪酶在微生物界的分布遠(yuǎn)超過這個(gè)數(shù)目，從脂肪酶的作用來看，更多的微生物中應(yīng)該有脂肪酶的合成，只是量多少的問題。高產(chǎn)脂肪酶菌株 多 來源于細(xì)菌、酵母和霉菌，其中假絲酵母屬、假單孢菌屬和曲霉屬 都 是重要的來源，褶皺假絲酵母最廣泛的用于脂肪酶的制備（ ， 1998）。表 1出了一些常見的產(chǎn)脂肪酶的微生物。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 3 表 1見的產(chǎn)脂肪酶的微生物 名 黑曲霉 米曲霉 白地霉 毛霉 戴 爾根霉 少根根霉 米根霉 綿毛狀腐質(zhì)霉 褶皺假絲酵母 解脂酵母 圓弧青霉 粘質(zhì)色桿菌 多球菌 熒光假單孢菌 自然界中存在的超過 99的微生物是不能培養(yǎng)的，因此從用傳統(tǒng)的培養(yǎng)技術(shù)分離到的微生物中篩選新的生物催化劑的方法是非常有局限性的。利用免培技術(shù)，直接從環(huán)境微生物中提取基因組 其克隆到不同的細(xì)菌載體中，構(gòu)建 “庫 ”， 再從中進(jìn)行篩選，是前景廣闊的篩選方法（ ， 2003； ， 2004；2004）。盡管在具體操作過程中可能存在一些困難，例 如需對基因片段進(jìn)行異源表達(dá)及篩選宿主等，但是運(yùn)用該策略已有成功的先例，如 人（ 2004）分離到一種新的淀粉分解酶， （ 2004）分離到一種新的脂肪酶。 對于可培養(yǎng)微生物，可以直接進(jìn)行菌種的篩選。篩選分離脂肪酶產(chǎn)生菌的方法因應(yīng)用對象、微生物種類、酶的特性而有所變化，應(yīng)力求準(zhǔn)確、迅速、選擇性強(qiáng)且易于自動化。常用的方法是用含有甘油三酯的瓊脂平板，酶催化水解產(chǎn)生清晰的環(huán)帶，也可利用生色底物或產(chǎn)脂肪酶微生物的某些特性。如宋欣等（ 2002）將采集到的土樣富集培養(yǎng)后涂布含有橄欖油的初篩平板，根據(jù)菌落周圍有無透 明圈及透明圈的大小篩選產(chǎn)脂肪酶菌株； 1986）利用生色底物 P 硝基苯辛酸鹽、 P 硝基苯肉蔻酸鹽和 P 硝基苯棕櫚酸鹽篩選對不同碳鏈長脂肪酸具有專一性的脂肪酶產(chǎn)生菌；我國研究者謝舜珍（ 1986）、王美英（ 1989）、陶文沂（ 1990）等采用油同化平板以油脂為唯一碳源進(jìn)行同化試驗(yàn)，分別篩選出較高酶活菌株；金其榮等（ 1995）以固態(tài)氫化油為唯一碳源， 40 培養(yǎng)，篩出一株分泌高溫脂肪酶的根霉菌；施巧琴（ 1981）采用脂肪酶水解脂肪后產(chǎn)生的脂肪酸與維多利亞藍(lán)反應(yīng)呈藍(lán)綠色透明圈平板法篩選出產(chǎn)堿性中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 4 脂肪酶的擴(kuò)展青霉 。 脂肪酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理 微生物脂肪酶 少數(shù)為脂蛋白 ， 大多 數(shù) 為糖蛋白，其糖基部分約占分子量的 2%15%，以甘露糖為主 。脂肪酶的一級結(jié)構(gòu)即氨基酸序列可以通過氨基酸序列測定得到，但是操作繁瑣，費(fèi)用昂貴。目前已知的脂肪酶蛋白的氨基酸序列大多是通過基因克隆、核苷酸序列測定，再通過核苷酸序列推導(dǎo)出來的。 脂肪酶氨基酸序列總體同源性不高。 2000）在收錄前人研究成果的基礎(chǔ)上，建立了一個(gè)脂肪酶蛋白質(zhì)工程數(shù)據(jù)庫 （ ，其網(wǎng)址是 數(shù)據(jù)庫迄今為止對多達(dá) 92種微生物脂肪酶及與其同源的絲氨酸水解酶的序列、結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了分類 、 總結(jié)和比較研究。通過多序列的比對，并根據(jù)其相似性程度的大小， 他們 把上述各種酶劃分為 15個(gè)超家族 （ 和 32個(gè)同源家族 （ 。同源家族內(nèi)，脂肪酶具有較高的序列相似性，而超家族之間序列相似性很低。所有脂肪酶一級結(jié)構(gòu)中在活性 10個(gè)氨基酸較為保守，活性 近的 ， 1988） ，但是 68脂肪酶中的保守五肽序列是 ， 1992）。五氨基酸保守序列根據(jù)來源不同有差別，其中 真菌脂肪酶而言，這一序列的保守性更強(qiáng)。例如，霉菌脂肪酶的序列為 母菌脂肪酶 為 敏辰， 2001）。普遍認(rèn)為保守五肽中的 與 水解機(jī)理 的一個(gè)過程，是催化 三聯(lián)體 的成員之一；而 測其作用為增加保守五肽的柔韌性和減少空間障礙以便底物能與催化中心更好地結(jié)合和催化水解。 三維結(jié)構(gòu)的研究是研究結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的基本點(diǎn)。二十世紀(jì)九十年代開始利用 X衍射晶體結(jié)構(gòu)研究技術(shù)研究脂肪酶的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，目前已有 10多種脂肪酶的三維結(jié)構(gòu)通過 X衍射進(jìn)行了研究。隨著越來越多脂肪酶晶體的立體結(jié)構(gòu)被闡明 （ ， 1990； ， 1990； ， 1994； ， 1999） ，人們發(fā)現(xiàn)這些脂肪酶在立體結(jié)構(gòu)上有相似之處，即都有 /水解酶折疊（ 1992），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 5 這一結(jié)構(gòu)與絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)非常相似。通常的 /水解酶折疊模式為： 由 8個(gè)平行的 折疊片層組成一個(gè)中心，第三到第八個(gè) 折疊之間有 螺旋相連，排列在 折疊片的兩側(cè)， 折疊片為左手超螺旋纏繞。 不同來源的脂肪酶的 /水解酶折疊在這個(gè)基本模式的基礎(chǔ)上有一些變化，其中高分子量脂肪酶和低分子 量脂肪酶有較大的差異。如 6個(gè) 折疊片（ ， 1997； ， 1998）； 269 9個(gè) 折疊片和 6個(gè) 螺旋（ ， 1990； ， 1992） ； 544 11個(gè) 折疊片和 17個(gè) 螺旋（ ， 1991）。各種脂肪酶的 折疊片的彎曲度差別較大，相應(yīng)的 螺旋的空間位置也很不同。 脂肪酶的催化活性中心為 一個(gè)催化三 聯(lián) 體（絲氨酸組 氨酸天冬氨酸或谷氨酸），此催化 三聯(lián)體 的三個(gè)氨基酸在空間結(jié)構(gòu)上非常靠近，以高度保守的幾何取向位于中央 折疊一側(cè)的 “ 環(huán)（ ” 中。在非激活狀態(tài)下，脂肪酶的活性位點(diǎn)埋藏在一個(gè) “ 蓋子 ” 下，使得底物不能靠近活性位點(diǎn)。蓋子是由雙親性螺旋構(gòu)成，如 ， 1990）， ， 1991）， ， 1994）。而與抑 制劑結(jié)合的酶或者酶與微膠粒共結(jié)晶的立體結(jié)構(gòu)顯示，蓋子的位置發(fā)生了變化，使得酶可以結(jié)合底物（ ，1991； ， 1993； ， 1994； ， 2002） 。打開蓋子，暴露出一個(gè)大的疏水表面，而原先暴露的親水區(qū)被埋藏到了蛋白的內(nèi)部 （ ， 1993； ， 1994； ， 1993） 。 圖 1毛狀腐質(zhì)霉脂肪酶 在關(guān)閉狀態(tài)和激活狀態(tài)時(shí)的三維結(jié)構(gòu)，通過比較可以發(fā)現(xiàn)兩種狀態(tài)之間存在的變化。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 6 1毛狀腐質(zhì)霉脂肪酶（ 開放和關(guān)閉形式的三維結(jié)構(gòu) of A) of B) 羧基端的側(cè)鏈 96， 201， 254， 87， 210（紅色）位于外部的疏水區(qū)（黃色）外圍，打開蓋子后催化 三聯(lián)體 （綠色）變得可以接近。蓋子的旋轉(zhuǎn)暴露出位于酶外表面的兩性螺旋的疏水殘基 。 摘自 ： ， 2002 96, 201, 254, 87, 210 (in at of in in of of at of 脂肪酶的性質(zhì) 脂肪酶是一類具有多種催化能力的酶，可以催化三酰甘油酯及 其他 一些水不溶性酯類的水解、醇解、酯化、轉(zhuǎn)酯化及酯類的逆向合成反應(yīng)，除此之外還表現(xiàn)出 其他 一些酶 的活性，如磷脂酶、溶血磷脂酶、膽固醇酯酶、酰肽水解酶活性等（ 1997；1998）。脂肪酶不同活性的發(fā)揮依賴于反應(yīng)體系的特點(diǎn)，如在油水界面促進(jìn)酯水解，而在有機(jī)相中可以酶促合成和酯交換。 脂肪酶的性質(zhì)研究主要包括最適溫度與 溫度與 定性、底物特異性等幾個(gè)方面。迄今，已分離、純化了大量的微生物脂肪酶，并研究了其性質(zhì)，它們在分子量、最適 最適溫度、 熱 穩(wěn)定性、等電點(diǎn)和 其他 生化性質(zhì)方面存在不同（ ， 1990）?？傮w而言，微生物脂肪酶具有比動植物脂肪 酶更廣的作用 作用溫度范圍，高穩(wěn)定性和活性，對底物有特異性（ ， 1998； ， 1998） 。 微生物脂肪酶按其最適作用 分為酸性、中性和堿性脂肪酶三類。例如，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 肪酶的最適作用 酸性脂肪酶； 10，為堿性脂肪酶（鄔敏辰， 2000）。 微生物脂肪酶的最適作用溫度因來源不同也有很大的差異，例如 肪酶最適作用溫度為 80 ，超嗜 熱礦泉古生菌 1 脂肪酶 對硝基苯酚辛酸酯為底物確定最適溫度為 90 （高仁鈞等， 2001），為高溫脂肪酶。高溫脂肪酶均來源于細(xì)菌或古細(xì)菌，具有獨(dú)特的高熱穩(wěn)定性的特點(diǎn)，其最適溫度在 70 以上，有的甚至可以達(dá)到 110 。 肪酶的最適作用溫度為 25 ，為低溫脂肪酶。 脂肪酶的底物特異性主要表現(xiàn)在位置特異性、脂肪酸特異性和立體結(jié)構(gòu)特異性。 脂肪酶的天然底物是三酰甘油酯，有三個(gè)酯鍵，因此可以發(fā)生水解反應(yīng)的位置就有三個(gè)，根據(jù)脂肪酶對底物作用 的 酯鍵位置不同可以將其分為位置特異性脂肪酶和無位置特異性脂肪酶。顧名思義，無位置特異性脂肪酶