I 密級(jí)： 論文編號(hào)： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 增強(qiáng)番茄果實(shí)顏色基因的精細(xì)定位及相關(guān) 基因的差異表達(dá) o. 錄 中英文摘要 第一章 引言 1 2 茄果實(shí)顏色的遺傳 2 茄果實(shí)顏色有關(guān)基因的功能機(jī)制 2 3 茄 究概況 5 茄果實(shí)顏色 究進(jìn)展 5 6 7 析的目的及 析方法 8 析的目的 8 析方法 8 析群體 9 傳圖譜的建 9 6. 從轉(zhuǎn)錄角度研究基因及基因表達(dá)的方法 10 接分析 10 接分析基于核苷酸序列測(cè)定的方法 10 接分析：基于片段長(zhǎng)度的方法 11 接分析 12 13 第二章 番茄第 4 染色體底端長(zhǎng) 50色體片段的分子 遺傳圖譜構(gòu)建 14 1. 材料與方法 15 驗(yàn)材料 15 記序列的獲得及引物合成 16 析 16 析 16 據(jù)整理和連鎖分析 19 2. 結(jié)果與分析 19 析結(jié)果 19 記的序列分析及 物設(shè)計(jì) 19 記的 化結(jié)果 20 用 記對(duì) 其近等基因系的分析結(jié)果 25 茄第 4 染色體底端長(zhǎng) 50色體片段 記的建立以及對(duì) 其近等基因系的分析結(jié)果 30 鎖圖譜的構(gòu)建 32 33 于 標(biāo)記的轉(zhuǎn)化 33 于制作番茄精密分子遺傳圖譜 33 于 析 34 三章 增強(qiáng)番茄果實(shí)顏色 精細(xì)定位 35 35 果實(shí)顏色的表現(xiàn)型分析 35 析 35 36 其近等基因系的果實(shí)顏色表現(xiàn)型分析 36 強(qiáng)果實(shí)顏色 精細(xì)定位 37 38 第四章 利用 析方法鑒定與果實(shí)顏色有關(guān)的基因 39 39 料 39 提取 40 1.3 合成 40 析 41 再擴(kuò)增、純化和序列分析 41 列同源性比較 41 2. 結(jié)果與分析 41 5 個(gè)番茄品種在不同生育階段的 析結(jié)果 41 對(duì)特異 次 增結(jié)果 44 序列分析結(jié)果 45 同源序列比較 45 47 第五章 術(shù)及其在番茄遺傳鑒定中的應(yīng) 用 49 1. 材料與方法 49 料 49 測(cè) 49 實(shí)驗(yàn)步驟的優(yōu)化 49 入 2 對(duì)引物和 3 對(duì)引物的 驗(yàn)及對(duì) 12 個(gè)近等基因系的 析 50 2. 結(jié)果與討論 50 術(shù)的建立 50 術(shù)對(duì)番茄 其近等基因系的遺傳鑒定 52 第六章 綜合討論和結(jié)論 55 1. 關(guān)于增強(qiáng)番茄果實(shí)顏色 精細(xì)定位 55 2. 關(guān)于增強(qiáng)果實(shí)顏色 功能 56 3. 其近等基因系的在番茄育種中的應(yīng)用 57 4. 結(jié)論 58 參考文獻(xiàn) 59 致謝 66 作者簡(jiǎn)介 67 表 目錄 圖 茄的類胡蘿卜素合成途徑 4 表 究的引物和接頭序列 17 圖 帶 記的質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶消化后的電泳結(jié)果 19 表 據(jù) 記設(shè)計(jì)的 物序列 20 表 記轉(zhuǎn)化為 結(jié)果 22 表 1 個(gè) 記轉(zhuǎn)化為 記后的多態(tài)性 25 圖 用引物 其近等基因系的 析結(jié)果 26 圖 用引物 其近等基因系的 析結(jié)果 27 圖 用引物 其近等基因系的 析結(jié)果 28 圖 用引物 其近等基因系的 析結(jié)果 29 圖 用引物對(duì) 析結(jié)果 29 表 用 11 個(gè) 記和 8 個(gè) 記對(duì) 其近等基因系的分析結(jié)果 30 圖 用 8 個(gè) 記對(duì) 其近等基因系的分析結(jié)果 31 圖 茄第 4 染色體底端長(zhǎng) 50段的分子遺傳圖譜 32 表 實(shí)表面顏色和果實(shí)內(nèi)部顏色的方差分析 36 圖 強(qiáng)番茄果實(shí)顏色 精細(xì)定位 37 圖 個(gè)番茄在果實(shí)不同發(fā)育階段的 析結(jié)果（引物組合 59） 42 表 過 徑獲得的 5 個(gè)番茄在果實(shí)不同發(fā)育階段特異表達(dá)的 43 圖 用在 析中的相同引物組合對(duì)特異 再擴(kuò)增結(jié)果 44 圖 用在 析中的相同引物組合對(duì)特異 再擴(kuò)增結(jié)果 45 表 60同源性比較結(jié)果 46 表 60同源性比較結(jié)果 47 圖 物 增結(jié)果和利用限制性內(nèi)切酶 消化后的結(jié)果 50 圖 物 同時(shí)加入 2 個(gè)上述引物的 增結(jié)果 和利用限制性內(nèi)切酶 消化后的結(jié)果 51 圖 物 同時(shí)加入這 3 個(gè)引物的 增結(jié)果 和利用限制性內(nèi)切酶 消化后的結(jié)果 52 圖 用 12 個(gè)近等基因系的 析結(jié)果 53 圖 用 其 12 個(gè)近等基因系的 析結(jié)果 53 圖 用 其 12 個(gè)近等基因系的 析結(jié)果 54 V 摘 要 番茄果實(shí)顏色是重要的品質(zhì)性狀之一，利用野生番茄中增強(qiáng)果實(shí)顏色的 基因?qū)τ诠麑?shí)顏色品質(zhì)改良具有重要意義。為此國內(nèi)外研究者展開了廣泛的研究，已從野生番茄中鑒定了 54 個(gè)與果實(shí)顏色有關(guān)的 建立了主效 等基因系 (亞近等基因系 (例如 是野生多毛番茄 (一個(gè)漸參系，以普通番茄 遺傳背景含有 1 個(gè)長(zhǎng) 50 4 染色體底端的片段， 析表明該片段含有 2 個(gè)明顯增強(qiáng)果實(shí)顏色的 本研究在前人研究工作的基礎(chǔ)上，以 其近等基因系為主要材料，對(duì)其中的 2 個(gè)增 強(qiáng)果實(shí)顏色的 行了精細(xì)定位，并利用 法研究了含有增強(qiáng)果實(shí)顏色 材料在果實(shí)不同發(fā)育階段基因的差異性表達(dá)。目的在于：通過 細(xì)定位獲得與之緊密連鎖的分子標(biāo)記，增強(qiáng)育種家操作 力，并為 進(jìn)一步克隆提供理論依據(jù)；通過基因差異性表達(dá)鑒定和分離與果實(shí)顏色相關(guān)的基因，研究基因在果實(shí)不同發(fā)育階段的表達(dá)，并初步探討 響果實(shí)顏色的機(jī)制。主要結(jié)果如下： 1、 進(jìn)行了能否將潘那利番茄圖譜上的分子標(biāo)記應(yīng)用到多毛番茄進(jìn)行遺傳分析， 并將其轉(zhuǎn)化為易于操作的 記以 克服 記的 操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)、需要放射性步驟和成本高的缺點(diǎn)的嘗試，通過對(duì) 21 個(gè) 記的 化分析，獲得了 11 個(gè)可用于多毛番茄的 用 11 個(gè) 記對(duì) 其近等基因系進(jìn)行遺傳分析，獲得了與預(yù)期結(jié)果一致的多態(tài)性，表明 記可以轉(zhuǎn)化為易于操作、效率高成本低的 記。 2、利用 72 個(gè) 、 行了 析，結(jié)果每對(duì)引物可以擴(kuò)增出 60100 條分子量為 20600譜帶，一共發(fā)展了 8 個(gè) 記，其引物組合及其分子量分別為： 475948494738/59 60過連鎖分析將 8 個(gè)標(biāo)記定位于多毛番茄第 4 染色體底端長(zhǎng)度為 50片段內(nèi)。 3、利用 記構(gòu)建了番茄 第 4 染色體底端長(zhǎng) 50段的精密 分子遺傳圖譜， 該圖譜由 26 個(gè)標(biāo)記組成，其中包括新建立的 11 個(gè) 記和 8 個(gè) 記，是原有圖譜上的 10 個(gè)標(biāo)記的 。圖 譜覆蓋了番茄第 4 染色體底端長(zhǎng) 50片段，兩個(gè)標(biāo)記之間的平均距離 圖譜將為該染色體片段內(nèi)的質(zhì)量基因定位、基因組比較研究和重要農(nóng)藝性狀 精細(xì)定位奠定基礎(chǔ)。 4、對(duì)多毛番茄第 4 染色體底端長(zhǎng) 50段內(nèi)的 2 個(gè)增強(qiáng)果實(shí)顏色的 行了精細(xì)定位，強(qiáng)果實(shí)表面顏色， 強(qiáng)果實(shí)內(nèi)部顏色，結(jié)果將 位于標(biāo)記 59間，遺傳距離為 原有的距離 小了 位于標(biāo)記 間，遺傳 距離為 5、 研究番茄基因差異性表達(dá)較為理想的方法，利用該法檢測(cè)到 162 個(gè)在果實(shí) 的膨大期、綠熟期、轉(zhuǎn)色期和完全成熟期 特異表達(dá)的 利用在選擇性擴(kuò)增中相同的引物組合對(duì)分子量大于 180 90 個(gè) 行了再次擴(kuò)增、 純化、序列測(cè)定和同源性比較分析。 結(jié)果發(fā)現(xiàn) 2 個(gè)已克隆的基因序列相比同源性較高。 60自番茄 轉(zhuǎn)色期，利用引物組合 60 進(jìn)行選擇性擴(kuò)增后獲得，分子量為 460序列與番茄屬 (綠體 因序列的同源性高； 60序列與番茄的透性酶基因、生長(zhǎng)素生 促進(jìn)子蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)磷酸酶和 因的同源性高。其余 已知功能基因的序列相比同源性較差，只有 19堿基與已克隆的基因序列一致。在含有增強(qiáng)果實(shí)顏色 (和 ) 番茄 及 對(duì)照之間，同源性分析均未檢測(cè)到含有 (和 )番茄材料在果實(shí)發(fā)育各個(gè)階段特異表達(dá)的 類胡蘿卜素合成途徑有關(guān)的酶的基因有 較高的同源性，但與果實(shí)顏色密切相關(guān)的類胡蘿卜素合成途徑、乙烯代謝途徑、富含亮氨酸的蛋白質(zhì)合成途徑等高度相關(guān)，表明 屬于類胡蘿卜素代謝途徑有關(guān)的酶的基因，可能屬于調(diào)節(jié)和控制因子。 6、在 驗(yàn)中，基于一些 記分享同一種限制性內(nèi)切酶的事實(shí)，結(jié)合 用 理首次研究建立了 術(shù)。該技術(shù)能同時(shí)檢測(cè) 2 個(gè)、 3 個(gè)或多個(gè) 記的多態(tài)性， 其效果等同于各個(gè) 記的多態(tài)性的疊加，具有重復(fù)性好、分析效率高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，可廣泛用于番茄及其它作物快速的遺傳鑒定和分子育種中。 關(guān)鍵詞： 番茄 , 果實(shí)顏色、 細(xì)定位， is of in is to of 4 to in of to a a 50at of in it on to as of at of 1) TL 2)at as of by et)at of OS 11 1 in a 50 NA of is as by 1 OS be be 6203 2 . 0 00 of 04759484947625941/at 0at of by 6 1 0at of . a of TL of at of on 0at of of 41/ by 5. 162 at of at 90 is 80bp 60at 33/60 609of t of in it It be of in be on in at An by of in or in at of be in 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 第一章 引言 番茄 (世界人民喜愛的重要蔬菜，年種植面積 產(chǎn)量 噸 (002)。番茄在我國栽培歷史雖短，但已經(jīng)成為主要的蔬菜之一，目前栽培面積已達(dá) 1455 萬畝，產(chǎn)值超過 200 億元人民幣 ,需求量和種植面積都在逐年增加 (杜永臣等， 1999)。 番茄果實(shí)顏色是重要的品質(zhì)性狀。無論對(duì)于鮮食用，還是加工用品種，果實(shí)顏色深和色素含量高的品質(zhì)優(yōu)良，受生產(chǎn)者和消費(fèi)者歡迎。番茄紅 素和胡蘿卜素是構(gòu)成果實(shí)顏色的主要色素，番茄紅素是極好的抗氧化劑，可抑制前列腺癌、消化道疾病和心血管疾病等的發(fā)生， 的前體，在增強(qiáng)機(jī)體免疫力、抵抗疾病、抑制癌等方面起著重要作用（ et 1995;et 2000） ，因此培育果實(shí)顏色深、鮮艷、色素含量高的品種是番茄品質(zhì)育種的重要目標(biāo)之一。 番茄屬于自花授粉植物，經(jīng)過長(zhǎng)期的高選擇壓的篩選，普通栽培番茄種群的遺傳背景變得越來越狹窄，利用現(xiàn)有的遺傳育種資源和常規(guī)育種手段很 難在果實(shí)顏色育種改良上取得突破性進(jìn)展。因此利用野生番茄中增強(qiáng)果實(shí)顏色的基因?qū)τ诠麑?shí)顏色品質(zhì)改良具有重要意義。 為此國內(nèi)外研究者展開了廣泛的研究，結(jié)果表明，多毛番茄（ 潘那利（ 醋栗番茄（ 小花番茄（ 奇美留斯基番茄（ 野生番茄中存在增強(qiáng)果實(shí)顏色、提高番茄紅素和胡蘿卜素含量的 從野生番茄中鑒定了 54 個(gè)與番茄果實(shí)顏色有關(guān)的 建立了主效 近等基因系(亞近等基因系 ( 目前存在的難題之一是增強(qiáng)果實(shí)顏色 等基因系或亞近等基因系中所含有的野生番茄的染色體片段長(zhǎng)度在 550間，仍然比較長(zhǎng)， 低產(chǎn)量、小果實(shí)等不良基因間連鎖累贅的影響仍然較大，在育種實(shí)踐中直接應(yīng)用這些增強(qiáng)果實(shí)顏色、提高番茄紅素和胡蘿卜素的有很大的難度。 另一難題在于，果實(shí)顏色的深淺本身也是一個(gè)復(fù)雜性狀，其主要決定于番茄紅素、胡蘿卜素等類胡蘿卜素的種類、含量和比例，任何與類胡蘿卜素合成途徑有關(guān)的基因突變都影響其最終結(jié)果，而且影響果實(shí)顏 色深淺的 果實(shí)發(fā)育的不同階段（幼苗期、開花期、果實(shí)膨大期、青熟期、綠熟期、白熟期以及完全成熟期）如何影響番茄紅素、胡蘿卜素等類胡蘿卜素的合成、運(yùn)輸、積累等生理生化代謝過程具體機(jī)制尚不明確，因此急需進(jìn)行與類胡蘿卜素合成有關(guān)基因（包括 分離與克隆、基因的調(diào)節(jié)和控制、以及基因在不同階段的表達(dá)等方面的深入研究。 最近幾年隨著 析方法的發(fā)展以及從轉(zhuǎn)錄角度分離和鑒定基因技術(shù)的建立和不斷完善， 提供了解決上述兩大難題的關(guān)鍵技術(shù)。 析方法將 析和品種選育相結(jié)合，能鑒定野生或未馴化種質(zhì)中有用的 因），并將 入到現(xiàn)有栽培番茄的骨干系中 。從轉(zhuǎn)錄水平鑒定、分離、研究基因表達(dá)的技術(shù)（如 ）不僅能有效地發(fā)現(xiàn)新的基因，評(píng)價(jià)基因在不同組織、不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的表達(dá)水平，還能進(jìn)行基 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 因功能研究。 因此利用 析和基因表達(dá)研究技術(shù)的最新成果，將果實(shí)顏色 分離、精細(xì)定位和 種相結(jié)合，并從基因表達(dá)角度鑒定和分離影響果實(shí)顏色的基因、研究 響果實(shí)顏色、影響類胡蘿卜素合成過程的具體步驟，對(duì)于利用分子標(biāo)記輔助選擇加速番茄果實(shí)顏色育種進(jìn)程，對(duì) 于 進(jìn)一步克隆以及深入研究 響果實(shí)顏色的生化合成過程的具體機(jī)制，均有重要意義。 茄果實(shí)顏色的遺傳 番茄成熟果實(shí)顏色分紅色、粉紅色、黃色、綠色、紫紅、橙紅、白色等。 934); 953); 余誕年 (1957 967)等的研究表明果實(shí)顏色決定于果皮顏色和果肉顏色。果皮顏色分為黃色和透明兩種，由 1 對(duì)等位基因控制，黃色果皮基因 Y 相對(duì)于透明果皮基因 y 為顯性 。果肉顏色主要分為紅、黃、橙三種，分別由 2對(duì)等位基 控制，其中“ R”基因?qū)е录t色果肉表型的產(chǎn)生，基因“ r”則產(chǎn)生黃色果肉，基因“ T”決定非橙黃色果肉，“ t”基因產(chǎn)生橙黃色果肉；橙黃色果肉基因“ 紅色果肉基因“ “隱性”上位作用，因此當(dāng)黃色親本 橙色親本 交后，基因型和表現(xiàn)型的比例為： 9 ： 3： 3： 1 紅色 ： 3 黃色 ： 3 橙色 ： 1 橙色 這三對(duì)等位基因的不同組合使成熟番茄果實(shí)表現(xiàn)出不同顏色：紅色果肉與黃 色果皮組合果實(shí)表現(xiàn)為“紅色”；紅色果肉與透明果皮組合果實(shí)表現(xiàn)為“粉紅色”；黃皮黃果肉組合形成深黃色果實(shí)；黃皮橙黃果肉組合形成深橙黃色果實(shí)?；?y,r,t 分別定位于第 1， 3 和 10染色體上。 茄果實(shí)顏色有關(guān)基因的功能機(jī)制 除 y,r,t 基因外，涉及果實(shí)顏色的基因還有 B， 些基因均屬于單基因?；蜃饔脵C(jī)制在于控制類胡蘿卜素生化合成過程的不同環(huán)節(jié)，從而影響類胡蘿卜素的組成，最終使果實(shí)表現(xiàn)出不同顏色（圖 R r 紅色果肉基因 R 和黃色果肉基因 r 作用的實(shí)質(zhì)在 于： r 是在 氫番茄紅素合成酶）中喪失功能的突變，當(dāng)隱性 r 基因表達(dá)時(shí)，由于阻止了牻牛兒牻牛兒二磷酸酯（ 八氫番茄紅素轉(zhuǎn)變，不能合成番茄紅素，胡蘿卜素和其它類胡蘿卜素的含量減少，從而使果實(shí)表現(xiàn)為黃色 (圖 該基因已被克隆，在基因庫中的編號(hào)為 T t 異構(gòu)酶基因 克隆闡明了長(zhǎng)期以來困擾學(xué)術(shù)界的“類胡蘿卜素異構(gòu)化”難題 , 因編碼類胡蘿卜素異構(gòu)酶，在野生型番茄中全部合成反式番茄紅素(et 2002; et 2002; 002)。當(dāng) t 基因表達(dá)時(shí)，由于阻止了順式番茄紅素向反式番茄紅素的異構(gòu)作用，結(jié)果在突變體果實(shí)中積累7Z,9Z,7Z,9式番茄紅素，從而使果肉表現(xiàn)出橙色，該基因已利用依圖譜法克隆，在基因庫的編號(hào)為 茄突變體 有一個(gè)顯性基因 基因的表達(dá)導(dǎo)致 胡蘿卜素的積累，使果實(shí)顏色由正常的紅色變?yōu)槌赛S色， 被定位于第 12 染色體上。已克隆了將番茄紅素中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 引言 轉(zhuǎn)化為 胡蘿卜素的番茄紅素 （ 位點(diǎn)與 因共分離， 因的轉(zhuǎn)錄水平在果實(shí)的轉(zhuǎn)色期增加到 30 倍，而在野生型番茄中降低到幾乎檢測(cè)不到的水平，據(jù)此推測(cè) 一個(gè) 基因庫的編號(hào)為 et 1999)。 B 和 )突變含有一個(gè)增加果實(shí) 胡蘿卜素的顯性基因， 一個(gè)中止 胡蘿卜素合成而增加番茄紅素含量的隱性突變， B 和 通過依圖譜法克隆 (et 2000)。 B 編 碼番茄紅素 環(huán)化酶，在果實(shí)的轉(zhuǎn)色期，野生型番茄中 B 的表達(dá)水平極低，而在 變中其轉(zhuǎn)錄水平劇烈增加， 胡蘿卜素占總類胡蘿卜素的 45 50，如果該基因與修飾基因（ 合其含量可超過 90 (000)。兩個(gè)隱性等位基因突變 的果實(shí)均為深紅色， B 是等位基因，定位于第 6 染色體上 ,在基因庫的編號(hào)為 具有 因 型的番茄在果實(shí)發(fā)育階段番茄 紅素和 葉片和綠色果實(shí)中葉綠素的含量很高， 在生長(zhǎng)和發(fā)育過程中還表現(xiàn)出對(duì)光有調(diào)節(jié)反應(yīng)，該基因被定位于第 2 染色體上，相應(yīng)的 因被克隆 (et 1999;et 1997)。 在未成熟果實(shí)中該基因明顯增加葉綠素含量，在成熟果實(shí)中番茄紅素的含量比普通類型增加 100%， 50%，甚至比 高 50%(余誕年， 1999)。 上述基因的不同組合和基因間的相互作用使果實(shí)表現(xiàn)出不同顏色，并使果肉顏色 構(gòu)成一個(gè)多層次的變異系列。這些克隆和即將克隆的基因?qū)⑹谷藗兏油笍氐乩斫忸惡}卜素生化合成途徑及其調(diào)控機(jī)制，還為分子育種和通過遺傳操作途徑增強(qiáng)果實(shí)顏色、增加番茄紅素、胡蘿卜素及其它類胡蘿卜素含量來改良番茄品質(zhì)提供了理論基礎(chǔ)。 育成果實(shí)顏色深、鮮艷、富含番茄紅素和胡蘿卜素的番茄品種是未來育種的重點(diǎn)，需要對(duì)控制果肉和果皮顏色的質(zhì)量基因進(jìn)行選擇，但是其重點(diǎn)和難點(diǎn)在于如何采取行之有效的方法將增強(qiáng)果實(shí)顏色、提高番茄紅素和胡蘿卜素的多個(gè)基因聚合到栽培品種骨干系中，創(chuàng)造優(yōu)良的育種種質(zhì) 。 由于番茄果實(shí)顏色的深淺是數(shù)量性狀，由數(shù)量性狀位點(diǎn) 制，表現(xiàn)型與基因型之間沒有明確的關(guān)系， 環(huán)境影響較大，因此在常規(guī)育種實(shí)踐中很難對(duì)含有目的 單株材料進(jìn)行準(zhǔn)確的選擇（例如不同育種者對(duì)同一單株果實(shí)顏色深淺的評(píng)價(jià)結(jié)果可能完全不同，同一育種者對(duì)同一材料在不同的年份和不同栽培環(huán)境下（保護(hù)地和露地）的評(píng)價(jià)結(jié)果也可能完全不一致）。 直到 析技術(shù)產(chǎn)生以后，育種家操縱 愿望才開始得以實(shí)現(xiàn)。借助于 析方法未馴化和野生種質(zhì)中大量有益的 以鑒定和分離， 析方法的應(yīng)用還實(shí)現(xiàn)了析和品種選育的有機(jī)結(jié)合。根據(jù) 究成果，育種家可以利用與 密連鎖的分子標(biāo)記對(duì)目的 行高效地選擇，實(shí)現(xiàn)由常規(guī)育種對(duì)表現(xiàn)型的選擇到直接地選擇目的基因的巨大轉(zhuǎn)變。因此 析技術(shù)一經(jīng)產(chǎn)生就受到了極大的重視，人們深信該領(lǐng)域研究成果的運(yùn)用將為作物育種帶來重