第十二章DNA、RNA和蛋白質(zhì),DNA的基本操作：DNA（線狀雙鏈DNA）、ocDNA（開環(huán)雙鏈DNA）、cccDNA（閉環(huán)雙鏈DNA）。DNA是相當(dāng)穩(wěn)定的，但是使用時也不能太隨意，DNA的污染來源主要是其他DNA分子。DNA保存：DNA在中性PH，低溫，暗處，合適的鹽濃度和無物理剪切的條件下較穩(wěn)定，適宜保存。用于存放DNA的緩沖液有三種,TE，0.1TE(適宜酶促反應(yīng))，T50E（適宜溶解PH不穩(wěn)定的DNA）。DNA檢測：1.紫外吸收2.溴化乙錠（EBa）DNA濃縮：1.DNA不溶于乙醇，所以一般用乙醇沉淀DNA來達(dá)到純化的目的;2.異丙醇沉淀；3.有機(jī)溶劑濃縮DNA，如正丁醇。DNA純化：1.酚抽提（適宜樣品DNA中混有蛋白質(zhì)污染）；2.苯酚/氯仿/異戊醇抽提;3.DEAE/纖維素交換樹脂(其他雜質(zhì));4.凝膠過濾(適宜除去樣品中含有鹽、緩沖液組分、小分子雜質(zhì)等)。,DNA篇,1.DNA的分離：,質(zhì)粒DNA的提取基本步驟：1）質(zhì)粒載體的選擇；2）培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增；3）收集和裂解細(xì)胞。溶菌酶破壞細(xì)菌細(xì)胞壁，再同SDS和tritonX-100可使細(xì)胞膜裂解，用強(qiáng)熱或酸、堿處理后中和、復(fù)性就可以提取到質(zhì)粒DNA。有煮沸裂解法、堿裂解法等。噬菌體DNA的提取基本步驟：1）感染力的測定，一般用噬菌體裂解物感染大腸桿菌來計算感染力；2）從噬菌斑中回收噬菌體；3）增殖噬菌體；4）平板裂解液法；5）提取噬菌體DNA。真核生物基因組DNA的提取基本步驟：1）破碎細(xì)胞；2）取出蛋白質(zhì)、多糖、脂類等生物分子；3）取出鹽類、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)；4）濃縮和溶解DNA。,2.DNA的轉(zhuǎn)化,制備感受態(tài)細(xì)胞：有CaCl2法和電轉(zhuǎn)化法。轉(zhuǎn)化主要步驟：化凍、質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞接觸、熱激，驟冷和目的基因的表達(dá)。,3.DNA的擴(kuò)增：主要是PCR技術(shù),4.DNA的重組：指將目的基因從這一載體插入到另一載體的過程。,目的DNA的準(zhǔn)備。載體準(zhǔn)備對目的DNA片段和載體磷酸化處理。酶切完畢的DNA和載體連接。連接DNA轉(zhuǎn)入合適宿主菌，獲取重組體。篩選，檢測重組體。,DNA重組過程中的注意點：,對于僅用限制酶處理的載體，與目的DNA連接的同時也能進(jìn)行自我連接，因此有必要將載體DNA末端進(jìn)行脫磷酸化處理，以防止載體自連。如果載體和目的DNA不存在合適切點，這時候就需要對目的DNA或者載體進(jìn)行修飾與改造。,RNA篇,RNA是單鏈分子，由A、U、C、G四個堿基串聯(lián)在核糖-磷酸骨架上。由于核糖2是-OH，遇水易發(fā)生變構(gòu)，其結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。這種不穩(wěn)定的變構(gòu)反應(yīng)在堿性條件下被加快。因此，RNA的長期保存是件令人頭痛的工作。細(xì)胞內(nèi)外存在大量的RNase，對RNase產(chǎn)生降解反應(yīng)，且該酶極穩(wěn)定，因此試驗中如何避免RNase污染時意見非常重要的工作。RNA在合適的條件下易出現(xiàn)分子內(nèi)局部配對，這種配對導(dǎo)致RNA分子形狀發(fā)生改變，因此在普通電泳中不能正確顯示其大小，所以應(yīng)用變性膠電泳，利用變性劑破壞其內(nèi)部配對，使RNA表現(xiàn)為完整的單鏈狀態(tài)。在PH6.0的微酸性環(huán)境下RNA相對穩(wěn)定，堿性環(huán)境下易分解。,RNase無處不在。細(xì)胞內(nèi)存在大量的RNase，裂解細(xì)胞時應(yīng)特別注意。人的體液中含有大量的RNase，應(yīng)盡量避免樣品和樣品管與體液的接觸，養(yǎng)成戴手套和口罩的習(xí)慣，勤更換?？諝庵械幕覊m和細(xì)菌中含有大量的RNase，應(yīng)建立干凈的操作環(huán)境。,RNase的穩(wěn)定性極高，即用蛋白質(zhì)變性劑SDS或苯酚不能使之完全失活；其活性不依賴于金屬離子，因此EDTA等螯合劑不能使之失活；熱穩(wěn)定，僅用煮沸方式也不能使之失活。,防止RNA酶污染一、防止RNA酶污染的措施1.所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤6h或更長時間。2.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。3.有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室溫10min，然后用0.1%DEPC水沖洗，晾干。4.配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1%DEPC，在37處理12h以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22m濾膜過濾除菌。5.操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實驗過程中手套要勤換。6.設(shè)置RNA操作專用實驗室，所有器械等應(yīng)為專用。,二、常用的RNA酶抑制劑1.焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA酶抑制劑，他通過和RNA酶的活性基因團(tuán)組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。2.異硫氰酸胍：它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。3.氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。4.RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。,RNA的分離,前面步驟所提取的是總RNA，其中80%85%是核糖體RNA（rRNA），10%20%是轉(zhuǎn)移RNA（tRNA），只有2%5%是基因克隆中非常重要的信使RNA（mRNA）。若想構(gòu)建出高質(zhì)量的cDNA文庫或者進(jìn)行Northern雜交、RT-PCR等實驗也需要純化的mRNA。與rRNA和tRNA不同的是，絕大部分mRNA的3端均有一個poly(A)尾，稱為polyRNA，可根據(jù)該結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離。,mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA3末端含有Poly（A+）的特點，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結(jié)合在柱上，當(dāng)逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。,測定與的值，根據(jù)二者的比值來估計制備樣品的純度，純凈的DNA比值為1.8，純凈的RNA比值為2.0，比值過大過過小則說明樣品中含有蛋白質(zhì)雜質(zhì)，需去除。,紫外分光光度計,首先，必須了解待純化樣品中目的蛋白及主要雜質(zhì)的性質(zhì)，盡可能多的收集有關(guān)蛋白質(zhì)來源、性質(zhì)和穩(wěn)定性等信息，有助于設(shè)計蛋白質(zhì)純化方案。其次，純化開始前必須了解最終產(chǎn)品的用途，要綜合考慮純化產(chǎn)品的質(zhì)量、數(shù)量和經(jīng)濟(jì)性等三方面的要求。最后，充分了解各分離純化技術(shù)操作單元的大量信息也很重要。,蛋白質(zhì)操作的原則,蛋白質(zhì),主要操作過程,細(xì)胞破碎和碎片分離,濃縮,進(jìn)一步純化,常用指標(biāo)分析,細(xì)胞的破碎,物理法：主要通過各種物理因素使組織細(xì)胞破碎的方法。常用的方法有：1.反復(fù)凍溶法：因突然冷凍，細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成及胞內(nèi)外溶劑濃度的突然改變而破壞細(xì)胞。特點：此法適用于組織細(xì)胞，多用于動物性材料，對微生物細(xì)胞作用較差。2.超聲波處理：用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，特點：操作簡單，重復(fù)性較好，節(jié)省時間；多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎。3.高速珠磨法。4.高壓勻漿法。,化學(xué)及生物化學(xué)法：酶溶法：利用各種水解酶，將細(xì)胞壁分解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。特點：a)此法適用多種微生物；b)具有作用條件溫和；c)內(nèi)含物成分不易受到破壞；d)細(xì)胞壁損壞的程度可以控制?；瘜W(xué)滲透法：某些有機(jī)溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來。特點：多用于破碎細(xì)菌，且作用比較溫和；提取核酸時，常用此法破碎細(xì)胞。存在的問題：時間長，效率低；化學(xué)試劑毒性較強(qiáng)；通用性差。,蛋白質(zhì)樣品的分離,聚沉：聚沉劑主要是無機(jī)鹽類（如氯化鋅、氯化鋁、硫酸鹽等）和聚合無機(jī)鹽（聚合鋁、聚合鐵等）。為促進(jìn)聚沉的產(chǎn)生，可以降溫至20以下進(jìn)行；調(diào)整pH至36；提高離子濃度；增加顆粒數(shù)量；增加多價金屬離子等方法。離心：對于低粘度介質(zhì)中的細(xì)菌，20003000g、1015min；對于高粘度的溶液，則需更高的速度和更長的時間，如細(xì)胞碎片，12000g、3045min；對于蛋白質(zhì)沉淀，5000g、30min或15000g、10min過濾：孔徑一般為0.2um或0.45um，常壓或減壓過濾。,蛋白質(zhì)濃縮法,吸附法原理：將干的惰性多孔基質(zhì)聚合物，如葡聚糖凝膠，加入到蛋白質(zhì)溶液中吸收水和其他小分子，當(dāng)凝膠完全膨脹后，沒用過濾或離心方法去除凝膠，分離出蛋白質(zhì)。優(yōu)缺點：簡單快速，儀器簡單，適應(yīng)于穩(wěn)定性較差的蛋白質(zhì)。但選擇性比較差，不能連續(xù)操作，濃縮倍數(shù)較低，蛋白質(zhì)回收率低，僅有80%90%。,超濾法原理：在常溫下以一定壓力和流量，利用不對稱微孔結(jié)構(gòu)和半透膜介質(zhì)，依靠膜兩側(cè)的壓力差作為推動力，以錯流方式進(jìn)行過濾，使溶劑及小分子物質(zhì)通過，大分子物質(zhì)和微粒子如蛋白質(zhì)、水溶性高聚物、細(xì)菌等被濾膜阻留，從而達(dá)到分離、分級、純化、濃縮目的的一種新型膜分離技術(shù)。優(yōu)缺點：1、超濾過程是在常溫下進(jìn)行，條件溫和無成分破壞，因而特別適宜對熱敏感的物質(zhì)，如藥物、酶、果汁等的分離、分級、濃縮與富集。2、超濾過程不發(fā)生相變化，無需加熱，能耗低，無需添加化學(xué)試劑，無污染，是一種節(jié)能環(huán)保的分離技術(shù)。3、超濾技術(shù)分離效率高，對稀溶液中的微量成分的回收、低濃度溶液的濃縮均非常有效。4、超濾過程僅采用壓力作為膜分離的動力，因此分離裝置簡單、流程短、操作簡便、易于控制和維護(hù)。5、超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到干粉制劑。對于蛋白質(zhì)溶液，一般只能得到1050%的濃度。,透析：是指溶質(zhì)從半透膜的一側(cè)透過膜至另一側(cè)的過程。任何天然的(如腹膜)或人造的半透膜，只要該膜含有使一定大小的溶質(zhì)通過的孔徑，那么這些溶質(zhì)就可以通過彌散和對流從膜的一側(cè)移動到膜的另一側(cè)。,雙水相分離法原理：利用兩種多聚物，或多聚物與鹽在水相中的不相容性，可以從細(xì)胞破碎后的細(xì)胞碎片中直接分離、純化蛋白質(zhì)，同時起到濃縮蛋白質(zhì)的作用。該法較溫和，一般不會使蛋白質(zhì)變性失活，可在室溫下進(jìn)行，雙水相中聚合物還可提高蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性。最常用的多聚物是聚二乙醇和葡聚糖。影響因素：聚合物分子量及濃度、溶液pH、離子強(qiáng)度、鹽類型及濃度等的影響。接下來一般采用Bradford方法測定蛋白質(zhì)，以免PEG的影響,冷凍干燥法原理：這是濃縮蛋白質(zhì)的一種較好的辦法，它既使蛋白質(zhì)不易變性，又保持蛋白質(zhì)中固有的成分。它是在冰凍狀態(tài)下直接升華去除水分。具體做法是將蛋白液在低溫下冰凍，然后移置干燥器內(nèi)（干燥器內(nèi)裝有干燥劑，如NaOH、CaCl2和硅膠等）。密閉，迅速抽空，并維持在抽空狀態(tài)。數(shù)小時后即可獲得含有蛋白的干燥粉末。干燥后的蛋白質(zhì)保存方便，應(yīng)用時可配成任意濃度使用。也可采用凍干機(jī)進(jìn)行冷凍干燥。對于濾膜不能截留的低分子量多肽濃縮好。適應(yīng)于熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)和多肽的濃縮，但設(shè)備要求較高。,鹽析法原理：加入中性鹽蛋白質(zhì)溶液中，蛋白質(zhì)的溶解度開始增大（鹽溶），但隨著繼續(xù)加鹽，蛋白質(zhì)的溶解度卻逐步減小，并形成沉淀，即成為鹽析。影響因素：1蛋白質(zhì)濃度高濃度蛋白溶液可以節(jié)約鹽的用量，但若蛋白濃度過高，會發(fā)生嚴(yán)重的共沉淀作用；在低濃度蛋白質(zhì)溶液中鹽析，所用的鹽量較多，而共沉淀作用比較少，因此需要在兩者之間進(jìn)行適當(dāng)選擇。一般認(rèn)為2.5%-3.0%的蛋白質(zhì)濃度比較適中。2離子強(qiáng)度和類型一般說來，高價陰離子沉淀效果好，單價陽離子中，銨離子效果好于鉀、鈉離子。常用硫酸銨，因其價格便宜，溶解度高，對溫度敏感性低。3PH值與蛋白質(zhì)等電點有關(guān)，但必須注意在水中或稀鹽液中的蛋白質(zhì)等電點與高鹽濃度下所測的結(jié)果是不同的，需根據(jù)實際情況調(diào)整溶液PH值，以達(dá)到最好的鹽析效果。4溫度在一般情況下，蛋白質(zhì)對鹽析溫度無特殊要求，可在室溫下進(jìn)行，只有某些對溫度比較敏感的酶要求在0-4進(jìn)行。,有機(jī)溶劑沉淀法原理：有機(jī)溶劑破壞了蛋白質(zhì)分子之間的某些鍵該法，是蛋白質(zhì)分子的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，一些原先存在于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水集團(tuán)被暴露于表面，并與有機(jī)溶劑的疏水集團(tuán)結(jié)合，形成疏水層，使得蛋白質(zhì)沉淀。有機(jī)溶劑的選擇：有機(jī)溶劑的選擇首先是能和水混溶，使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇、丙酮，還有二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、乙腈和2-甲基-2,4戊二醇等。優(yōu)缺點：1）分辨能力比鹽析法高，即蛋白質(zhì)或其它溶劑只在一個比較窄的有機(jī)溶劑濃度下沉淀；2）沉淀不用脫鹽，過濾較為容易。其缺點是對具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作要求在低溫下進(jìn)行。影響因素：1）溫度低溫可保持生物大分子活性，同時降低其溶解度，提高提取效率；2）樣品濃度和PH；3）金屬離子一些多價陽離子如Zn2+和Ca2+在一定PH下能形成復(fù)合物，溶解度下降。4）離子強(qiáng)度鹽濃度太大或太低都對分離有不利影響，對蛋白質(zhì)和多糖而言鹽濃度不超過5%比較合適，使用的乙醇量不超過二倍體積為宜。,等電點沉淀法原理：兩性電解質(zhì)分子上的凈電荷為零時溶解度最低，不同的兩性電解質(zhì)具有不同的等電點，以此為基礎(chǔ)可進(jìn)行分離。此法常與鹽析法或有機(jī)溶劑法配合使用很多蛋白質(zhì)的等電點在偏酸性范圍之內(nèi)，調(diào)節(jié)pH所用的有機(jī)酸價格低，操作也比較方便。但是，對pH敏感的蛋白質(zhì)應(yīng)避免使用此法。,聚乙二醇沉淀法原理：PEG分子在溶液中形成了網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與溶液中的蛋白質(zhì)分子發(fā)生空間排斥作用，是蛋白質(zhì)分子聚集、沉淀。影響條件：蛋白質(zhì)的分子量、濃度、溶液的pH、溫度及PEG的平均分子量等因素的影響。蛋白質(zhì)濃度常小于10mmol/L。,選擇性沉淀法原理：不同蛋白質(zhì)在不同的條件下有不同的穩(wěn)定性，改變溫、pH或加入有機(jī)溶劑，許多雜蛋白發(fā)生變性沉淀，而目的蛋白不形成沉淀，就可以分離出比較純的目的蛋白。此方法可分為：1）利用表面活性劑(三氯乙酸)或有機(jī)溶劑（丙酮或乙醇等）引起變性；2）利用對熱的不穩(wěn)定性,加熱破壞某些組分，而保存另一些組分；3）酸堿變性。,蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化色譜法,色譜色譜分離技術(shù)又稱層析分離技術(shù)或色層分離技術(shù)，是一種分離復(fù)雜混合物中各個組分的有效方法。它是利用不同物質(zhì)在由固定相和流動相構(gòu)成的體系中具有不同的分配系數(shù)，當(dāng)兩相作相對運動時，這些物質(zhì)隨流動相一起運動，并在兩相間進(jìn)行反復(fù)多次的分配，從而使各物質(zhì)達(dá)到分離。,色譜分離技術(shù)-色譜種類色譜有多種，按固定相類型和分離原理可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、親和色譜、大孔吸附樹脂、凝膠色譜、聚焦色譜等。最常用的是吸附色譜分離技術(shù)。吸附色譜法是指混合物隨流動相通過吸附劑（固定相）時，由于吸附劑對不同物質(zhì)具有不同的吸附力而使混合物中各組分分離的方法。此法特別適用于脂溶性成分的分離。被分離的物質(zhì)與吸附劑、洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析的三要素，彼此緊密相連。,凝膠過濾的原理：以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯酰胺等）作固定相，依據(jù)樣品分子量大小達(dá)到分離目的。大分子不進(jìn)入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進(jìn)入大部分凝膠孔洞，在柱中被強(qiáng)滯留，后被洗脫。,通過DEAE-纖維素將兩種不同帶電性的蛋白質(zhì)分離開。圖中顯示的是帶正電的離子交換樹脂結(jié)合帶負(fù)電的蛋白。,離子交換層析：離子交換是利用蛋白質(zhì)表面的電荷與層析劑上的離子基團(tuán)的靜電作用。,親和色譜：在生物分子中有些分子的特定結(jié)構(gòu)部位能夠同其他分子相互識別并結(jié)合，如酶與底物的識別結(jié)合、受體與配體的識別結(jié)合、抗體與抗原的識別結(jié)合，這種結(jié)合既是特異的，又是可逆的，改變條件可以使這種結(jié)合解除。生物分子間的這種結(jié)合能力稱為親和力。親和層析就是根據(jù)這樣的原理設(shè)計的蛋白質(zhì)分離純化方法。常用的生物親和關(guān)系有酶-底物、底物類似物、抑制劑、激活劑、輔因子，抗體-抗原，激素-受體蛋白、載體蛋白，外源凝集素-多糖、糖蛋白、細(xì)胞表面受體，核酸-互補(bǔ)核苷酸序列、組蛋白、核酸結(jié)合蛋白等。,作用：具有分子篩作用的物質(zhì)很多，如浮石、瓊脂、瓊脂糖、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、葡聚糖凝膠等。以葡聚糖凝膠應(yīng)用最廣，商品名是sephadex型號很多，從G10到G200，它的主要應(yīng)用范圍是：分級分離各種抗原與抗體；去掉復(fù)合物中的小分子物質(zhì)。如除鹽、熒光素和游離的放射性同位素以及水解的蛋白質(zhì)碎片；分析血清中的免疫復(fù)合物；分子量的測定。優(yōu)缺點：1.凝膠層析操作簡便，所需設(shè)備簡單。2.分離效果較好，重復(fù)性高。最突出的是樣品回收率高，接近100。3.分離條件緩和。4.應(yīng)用廣泛。適用于各種生化物質(zhì)，如肽類、激素、蛋白質(zhì)、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。5.分辨率不高，分離操作較慢。,常用指標(biāo)分析,一、紫外分光光度法蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸。它們具有吸收紫外光的性質(zhì)，其吸收高峰在280nm波長處，且在此波長內(nèi)吸收峰的光密度值與其濃度成正比關(guān)系，故可作為蛋白質(zhì)定量測定的依據(jù)。另外，不少雜質(zhì)在280nm波長下也有定吸收能力，可能發(fā)生干擾。其中尤以核酸(嘌呤和嘧啶堿)的影響更為嚴(yán)重。然而核酸的最大吸收峰是在260nm。因此溶液中同時存在核酸時，必須同時測定OD260nm，與OD280nm。然后根據(jù)兩種波長的吸收度的比值，通過經(jīng)驗公式校正，以消除核酸的影響而推算出蛋白質(zhì)的真實含量。本法操作簡便迅速，且不消耗樣品(可以回收)，多用于純化之蛋白質(zhì)的微量測定。主要缺點：當(dāng)待測的蛋白質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸含量差異較大時，則產(chǎn)生定誤差，混有核酸時必須分別測定280nm和260nm兩處的OD值，再按公式推算蛋白質(zhì)含量。,蛋白質(zhì)含量的分析,樣品與濃硫酸共熱。含氮有機(jī)物即分解產(chǎn)生氨（消化），氨又與硫酸作用，變成硫酸氨。經(jīng)強(qiáng)堿堿化使之分解放出氨，借蒸汽將氨蒸至酸液中，根據(jù)此酸液被中和的程度可計算得樣品之氮含量。若以甘氨酸為例，其反應(yīng)式如下：CH2COOH|+3H2SO4=2CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)NH22NH3+H2SO4=(NH4)2SO4(2)(NH4)2SO4+2NaOH=2H2O+Na2SO4+2NH3(3)為了加速消化，可以加入CuSO4作催化劑，K2SO4以提高溶液的沸點。收集氨可用硼酸溶液，滴定則用強(qiáng)酸。實驗和計算方法這里從略。計算所得結(jié)果為樣品總氮量，如欲求得樣品中蛋白含量，應(yīng)將總氮量減去非蛋白氮即得。如欲進(jìn)一步求得樣品中蛋白質(zhì)的含量，即用樣品中蛋白氮乘以625即得。,二、微量凱氏（Kjeldahl）定氮法,三、雙縮脲法（Biuret法）雙縮脲（NH3CONHCONH3）是兩個分子脲經(jīng)180左右加熱，放出一個分子氨后得到的產(chǎn)物。在強(qiáng)堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4形成紫色絡(luò)合物，稱為雙縮脲反應(yīng)。凡具有兩個酰胺基或兩個直接連接的肽鍵，或能過一個中間碳原子相連的肽鍵，這類化合物都有雙縮脲反應(yīng)。紫色絡(luò)合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比，而與蛋白質(zhì)分子量及氨基酸成分無關(guān)，故可用來測定蛋白質(zhì)含量。測定范圍為110mg蛋白質(zhì)。干擾這一測定的物質(zhì)主要有：硫酸銨、Tris緩沖液和某些氨基酸等。此法的優(yōu)點是較快速，不同的蛋白質(zhì)產(chǎn)生顏色的深淺相近，以及干擾物質(zhì)少。主要的缺點是靈敏度差。因此雙縮脲法常用于需要快速，但并不需要十分精確的蛋白質(zhì)測定。,Folin酚試劑法（Lowry法）此法的顯色原理與雙縮脲方