關(guān)于強(qiáng)制降解試驗(yàn)的決策樹(shù) 降解試驗(yàn)?zāi)康摹癝tability testing of New Drug Substances and Products” ICH Q1A (R2)要求，原料藥需進(jìn)行強(qiáng)制降解試驗(yàn)以闡明其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，同時(shí)有助于識(shí)別其可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物。2015年，CFDA發(fā)布的化學(xué)藥物(原料藥和制劑)穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則(修訂)中指出，原料藥的穩(wěn)定性研究需進(jìn)行影響因素試驗(yàn)，即“通過(guò)給予原料藥較為劇烈的試驗(yàn)條件，如高溫、高濕、光照、酸、堿、氧化等，考察其在相應(yīng)條件下的降解情況，以了解試驗(yàn)原料藥對(duì)光、濕、熱、酸、堿、氧化等的敏感性、可能的降解途徑及產(chǎn)生的降解產(chǎn)物，并為包裝材料的選擇提供參考信息。”下面是ANDAs中的部分關(guān)于強(qiáng)制降解試驗(yàn)的缺陷：a. Your drug substance does not show any degradation under any of the stress conditions. Please repeat stress studies to obtain adequate degradation. If degradation is not achievable, please provide your rationale.b. Please note that the conditions employed for stress study are too harsh and that most of your drug substance has degraded. Please repeat your stress studies using milder conditions or shorter exposure time to generate relevant degradation products.c. It is noted that you have analyzed your stressed samples as per the assay method conditions. For the related substances method to be stability indicating, the stressed samples should be analyzed using related substances method conditions.d. Please state the attempts you have made to ensure that all the impurities including the degradation products of the unstressed and the stressed samples are captured by your analytical method.e. Please provide a list summarizing the amount of degradation products (known and unknown) in your stressed samples.f. Please verify the peak height requirement of your software for the peak purity determination.g. Please explain the mass imbalance ofthe stressed samples.h. Please identify the degradation products that are formed due to drug-excipient interactions.i. Your photostability study shows that the drug product is very sensitive to light. Please explain how this is reflected in the analytical method, manufacturingprocess, product handling, etc.強(qiáng)制降解實(shí)際情況然而，指南中僅建議了溫度(如50度、60度)、濕度(如75%RH或更高)、光(參見(jiàn)ICH Q1B)的降解試驗(yàn)條件，對(duì)于酸、堿、氧化試驗(yàn)沒(méi)有做過(guò)多的描述。因此，在具體試驗(yàn)過(guò)程中，我們常常會(huì)有這樣的困惑：1)什么樣的反應(yīng)物能有助于降解試驗(yàn)？2)在進(jìn)行氧化降解時(shí)，什么樣的氧化劑最佳？3)進(jìn)行酸降解時(shí)，能否使用硫酸代替鹽酸？4)如果前一次的降解試驗(yàn)沒(méi)有得到足夠的降解產(chǎn)物，那么，我們?cè)摬捎檬裁礃O端的條件以獲得足夠用于分離鑒別的降解產(chǎn)物？5)是否有這樣或那樣的條件，我們滿足后就可停止或不需再進(jìn)一步的試驗(yàn)？酸降解在進(jìn)行酸降解時(shí)常用0.1N 1.0N HCl，也有使用更濃的HCl；而除了使用鹽酸外，也有使用不同濃度硫酸作為酸降解試劑。同時(shí)，不同酸降解的反應(yīng)條件也是多種多樣，反應(yīng)溫度從40度到110度，甚者采用回流或沸騰條件，反應(yīng)時(shí)間也從1小時(shí)到2個(gè)月不等。有的藥物，如奧美拉唑，選用0.5N的硫酸回流5min即完全降解，而頭孢氨芐在同樣條件下一點(diǎn)沒(méi)有發(fā)生降解；有的藥物在0.1N鹽酸條件下回流1周也未發(fā)生降解。堿降解NaOH是常用的堿降解試劑，濃度從0.1N到1.0N不等，有時(shí)也使用KOH，但使用得比較少。與酸降解一樣，對(duì)于堿降解的反應(yīng)溫度變化也很大，從30度到100度甚至沸騰或回流。由于不同分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)的差異，有些分子在0.1N氫氧化鈉條件下沸騰一周未發(fā)生降解，而有些分子如三氟拉嗪在0.1N氫氧化鈉、30度溫度下放置24小時(shí)即可發(fā)生完全降解。同理，當(dāng)使用1N的NaOH時(shí)，有些分子如雷尼替丁，沸騰20min即可降解至84.4%，而諾氟沙星在100度下進(jìn)行15小時(shí)也未發(fā)生降解。氧破壞在進(jìn)行氧破壞的氧化劑中，常用的氧化劑為雙氧水，濃度為1%到30%。有些藥物比較容易發(fā)生氧降解，如鹽酸雷尼替丁和鹽酸西咪替丁，使用3%的濃度在室溫下即可較快完成降解試驗(yàn)；而有的藥物如鹽酸舍曲林，在濃度為10%條件下回流6個(gè)小時(shí)也未發(fā)生一點(diǎn)的降解。這表明，有些藥物是易被氧化的，而有的藥物則不易被氧化，甚至使用更高濃度的氧化劑也不會(huì)氧化降解。光降解很多光降解試驗(yàn)表明，在進(jìn)行光降解時(shí)，光降解條件也非一成不變的。根據(jù)藥物特點(diǎn)，藥物可暴露于長(zhǎng)波長(zhǎng)或短波長(zhǎng)的紫外燈下，也可暴露于400-1580fc的日光燈下，試驗(yàn)溫度一般為室溫或接近室溫，試驗(yàn)周期為幾個(gè)小時(shí)到幾個(gè)月不等，依賴于光源強(qiáng)度。鹽酸西咪替丁在UV下進(jìn)行幾個(gè)月也未發(fā)生降解；維生素A酸在UV下2h即降解了一半。決策樹(shù)藥物分類根據(jù)藥物的穩(wěn)定性情況，我們可以將它們分為六類：極不穩(wěn)定、很不穩(wěn)定、不穩(wěn)定、穩(wěn)定、非常穩(wěn)定、極度穩(wěn)定。光降解中，根據(jù)ICH光降解條件將藥物分為兩類：對(duì)光敏感和對(duì)光不敏感，即如果藥物在ICH推薦的光條件下(1.2*106 lux h)能充分分解或完全降解，那么該藥物為對(duì)光敏感類藥物；否則，將總照度改為6.0*106 lux h。當(dāng)我們拿到一個(gè)新藥物時(shí)，我們一般首先將它默認(rèn)為是第三類“不穩(wěn)定”藥物，然后根據(jù)反應(yīng)結(jié)果來(lái)判斷是否需要加大或弱化降解反應(yīng)條件。酸/堿降解為了研究藥物在酸/堿條件下的水解過(guò)程，我們可以先從0.1N HCl/NaOH回流8小時(shí)開(kāi)始，認(rèn)為藥物是不穩(wěn)定的，見(jiàn)下圖決策樹(shù)：如果能夠獲得足夠降解產(chǎn)物或者說(shuō)能達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康?，那么就可不必再進(jìn)行深究試驗(yàn)；如果藥物沒(méi)有發(fā)生降解，則可以增加酸/堿的濃度，同時(shí)增加反應(yīng)時(shí)間；依次類推。如果藥物在5N濃度下回流24小時(shí)(苛刻條件)還未發(fā)生降解，則該藥物為“極度穩(wěn)定”一類。另一方面，若藥物在初始條件下即完全降解，那么，則應(yīng)降低酸/堿濃度，同時(shí)降低反應(yīng)溫度；若濃度降低至0.01N、反應(yīng)時(shí)間降低至2h、反應(yīng)溫度降低至25度(接近室溫)，藥物仍能充分降解，則該藥物為“極不穩(wěn)定”一類，需探索更溫和的反應(yīng)溫度和反應(yīng)pH值。從上圖的酸/堿降解決策樹(shù)中可發(fā)現(xiàn)，推薦的起始降解條件為0.1N酸/堿，回流8小時(shí)；假如起始降解條件不滿足降解要求，則惡化降解條件。不推薦直接采用惡化條件進(jìn)行降解試驗(yàn)：1)直接采用更惡劣的降解條件，可能會(huì)改變藥物降解的路徑或反應(yīng)機(jī)制；2)濃度過(guò)高的酸或堿對(duì)HPLC柱子有損傷。在進(jìn)行降解試驗(yàn)前了解一下藥物分子的結(jié)構(gòu)信息有時(shí)也是有幫助的，如，藥物小分子上有一個(gè)酯基，酯基易于水解，那么我們可能使用低濃度的堿即可完成試驗(yàn)。氧破壞為了研究藥物氧破壞的難易程度，我們可以先將藥物放置于3% H2O2在室溫下反應(yīng)6小時(shí)作為起始條件，見(jiàn)下圖決策樹(shù)：如果能夠獲得足夠降解產(chǎn)物或者說(shuō)能達(dá)到試驗(yàn)?zāi)康?，那么就可不必再進(jìn)行深究試驗(yàn)；如果藥物沒(méi)有發(fā)生降解，則可以先增加反應(yīng)時(shí)間，由原來(lái)的6小時(shí)提高至24小時(shí)；如果藥物仍未發(fā)生降解，則可以增加氧化劑濃度，由3%提高到10%；若還未降解，則氧化劑濃度可提高至30%；若藥物在30%H2O2濃度下反應(yīng)24小時(shí)仍不能發(fā)生降解，則該藥物為“極度穩(wěn)定”一類。另一方面，若藥物在初始條件下即完全降解，那么，則應(yīng)降低H2O2的濃度，從3%降低至1%，同時(shí)縮短反應(yīng)時(shí)間；若氧化劑濃度降低至1%、反應(yīng)時(shí)間降低至30min，藥物仍能完全降解，則需探索更低氧化劑濃度和更短的反應(yīng)時(shí)間。金屬離子有助于氧化反應(yīng)的進(jìn)行，是氧化反應(yīng)的催化劑，因此，有時(shí)額外補(bǔ)加一點(diǎn)金屬離子，氧降解反應(yīng)會(huì)增加幾千倍，如銅有助于將維生素C的氧降解提高1萬(wàn)倍。但并非所有的氧降解加金屬離子均可以，有時(shí)加入金屬離子會(huì)使原有的降解路線發(fā)生改變。光降解光降解與其它條件有所不同，藥物的起始反應(yīng)條件與ICH推薦的一致，即1.2*106 lux h，若在此條件下未發(fā)生降解，則可將總照度提高至5倍，即6.0*106 lux h；若此條件下藥物仍未發(fā)生降解，則該藥物為“對(duì)光不敏感”一類。對(duì)于光降解試驗(yàn)，建議主要還是遵從ICH Q1B指南，可采用任何輸出相似于D65/ID65發(fā)射標(biāo)準(zhǔn)的光源，如具有可見(jiàn)-紫外輸出的人造日光熒光燈、氙燈或金屬鹵化物燈，因此，可嘗試符合ICH要求的不同燈源。若采用氙燈，達(dá)到目標(biāo)總照度(1.2*106Lux hr)一般需要4小時(shí)左右，如果采用熒光燈或近UV燈，按輸出5000-10000lux算需要5-10天才能達(dá)到目標(biāo)總照度。有時(shí)，我們可以直接將樣品置于太陽(yáng)光照下進(jìn)行降解試驗(yàn)。在炎熱的夏天，樣品置于太陽(yáng)下光照4小時(shí)產(chǎn)生的降解程度與樣品置于氙燈或金屬鹵化物燈下光照8天降解程度差不多。但需要注意的是，一年中太陽(yáng)光的照度隨季節(jié)在變。需要注意的是，不管光降解反應(yīng)的現(xiàn)象如何，仿制藥的說(shuō)明書均應(yīng)與RLD的一致。降解試驗(yàn)注意事項(xiàng)樣品濃度與降解程度根據(jù)不同文獻(xiàn)報(bào)道，加上實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行強(qiáng)制降解時(shí)推薦的起始樣品研究濃度為1 mg/ml(后期可根據(jù)實(shí)際情況而決定是否需要調(diào)整)，如果樣品溶解性差而達(dá)不到這個(gè)濃度的，可在樣品中加入甲醇。樣品濃度若太小，則有可能部分降解產(chǎn)物因濃度太低而不能被檢測(cè)到。而對(duì)于溶液劑，推薦采用最終的處方濃度同時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)，因?yàn)橛行┧幬锶绨被嗝顾兀谝欢舛认聲?huì)發(fā)生聚集現(xiàn)象，低濃度下藥物很少發(fā)生聚集。對(duì)于小分子藥物而言，強(qiáng)制降解一般以主成分降解5% - 20%為宜；而對(duì)于要求含量為標(biāo)示量的90% - 110%的小分子而言，建議最大主成分降解為10%。過(guò)度的降解容易造成二次降解產(chǎn)物，而這些二級(jí)產(chǎn)物又可能不會(huì)出現(xiàn)在藥物貨架期穩(wěn)定性研究期間內(nèi)產(chǎn)生，即不符合降解試驗(yàn)的最終目的。樣品處理方式樣品經(jīng)過(guò)酸、堿、氧化劑降解后，一般含有較高濃度的殘留反應(yīng)劑，直接進(jìn)樣會(huì)有損液相及色譜柱。對(duì)于樣品的處理，可采用稀釋法或中和法，其中稀釋法更為推薦。對(duì)于稀釋法，即將樣品中殘留的反應(yīng)劑通過(guò)稀釋至能夠耐受的范圍內(nèi)：如果采用HPLC法，稀釋劑可使用流動(dòng)相；如果采用TLC法，稀釋劑可采用甲醇、乙醇等。對(duì)于酸堿中和法，即在樣品中加入酸或堿，使樣品溶液的pH將至耐受范圍內(nèi)。稀釋法操作更簡(jiǎn)單，而中合法難以把控終點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)建議對(duì)于強(qiáng)制降解試驗(yàn)，我們最好是能準(zhǔn)備四種樣品進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)：1)放置于常規(guī)條件下的空白溶液；2)放置于降解條件下的空白溶液；3)放置于常規(guī)條件下的樣品溶液；4)放置于降解條件下的樣品溶液。最終通過(guò)對(duì)這四種溶液的綜合判斷評(píng)估真實(shí)的降解產(chǎn)物。在進(jìn)行降解試驗(yàn)過(guò)程中，間隔取樣有時(shí)是有必要的，有利于闡明降解過(guò)程、從而識(shí)別降解產(chǎn)物到底是一級(jí)降解產(chǎn)物還是二級(jí)降解產(chǎn)物。在使用藥典和USP 中概述的限制使用的方法，降解試驗(yàn)是沒(méi)有必要研究的。同一個(gè)藥物的不同晶型可能具有不同的穩(wěn)定性特征，當(dāng)一