糖原的顯色PAS反應(yīng)（periodicacidschiffreaction）,任子健,一、制片技術(shù),生物體的組織細(xì)胞大部分都是不透明的，不能直接在顯微鏡下觀察，需要切成薄片，必須采用各種特殊的方法對(duì)材料進(jìn)行處理，把材料制成薄片標(biāo)本，經(jīng)過(guò)染色后，置于顯微鏡下觀察它們的微細(xì)結(jié)構(gòu)。,石蠟切片,石蠟切片法是組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的一種方法，是以石蠟作包埋劑，用旋轉(zhuǎn)切片機(jī)將標(biāo)本切成薄片，經(jīng)一系列處理制成永久切片。制作過(guò)程：1.取材2.固定3.洗滌4.脫水5.透明6.浸蠟7.包埋8.切片9.貼片10.脫蠟復(fù)水11.染色12.脫水13.透明14.封片。,1.取材,從人或動(dòng)物體內(nèi)取下所需組織或器官，材料必須新鮮，組織塊不宜太大，以便固定劑穿透。,2.固定,目的：迅速凝固蛋白質(zhì)，終止細(xì)胞一切代謝過(guò)程，防止組織自溶，保持其活體時(shí)結(jié)構(gòu)。固定劑：10%甲醛、80%酒精、混合固定劑（Bouin氏液、FAA液、Carnoy氏液）。用量：必須充足，一般為材料塊的2030倍。固定時(shí)間：數(shù)小時(shí)至24小時(shí)。,3.洗滌,目的：除去留在組織內(nèi)的固定液及其結(jié)晶沉淀，以免影響后面的染色效果。方法：多數(shù)用流水沖洗，少數(shù)用酒精。,4.脫水,目的：固定或洗滌后的組織內(nèi)充滿水分，而水與石蠟不能互溶，所以必須將組織中的水分除去，才能進(jìn)行石蠟包埋。脫水劑：酒精方法：從低濃度到高濃度梯度酒精脫水：30%50%70%80%90%95%100%各級(jí)酒精中放置1數(shù)小時(shí)。水酒精石蠟,5.透明,目的：酒精與石蠟不相溶，還需用能與酒精和石蠟相溶的媒浸液，替換出組織內(nèi)的酒精。組織在這類媒浸液中浸漬，出現(xiàn)透明狀態(tài)，因此該過(guò)程稱透明。透明劑：二甲苯。方法：酒精二甲苯等量混合液（1：1）15分鐘，二甲苯30分鐘。水酒精二甲苯石蠟,6.浸蠟,目的：除去組織中的透明劑，使石蠟滲透到組織內(nèi)部，達(dá)到飽和程度以便包埋。方法：石蠟二甲苯等量混合15分鐘，石蠟、石蠟各30分鐘。浸蠟應(yīng)在高于石蠟熔點(diǎn)3左右的溫箱中進(jìn)行，以利石蠟浸入組織內(nèi)（石蠟的熔點(diǎn)在5060之間）。,7.包埋,目的：將浸蠟后的組織塊包埋于石蠟中。方法：取出組織塊，置于盛有融化石蠟的包埋框中，迅速放入冷水中冷卻，待石蠟完全凝固（約30min）后取出，即做成含有組織塊的蠟塊標(biāo)本。,8.切片,將蠟塊裝在切片機(jī)上，調(diào)整所需的切片厚度（410um），進(jìn)行切片，切出一片接一片的蠟帶，用刀片割開(kāi)蠟帶。,9.貼片,目的：借助粘附劑將展平的蠟片粘附于載玻片上，以免在以后的操作步驟中脫落。方法：在潔凈的載玻片上涂抹薄層粘附劑（如多聚賴氨酸），滴兩滴蒸餾水于載玻片上，把蠟片放于水滴上，略加溫使蠟片鋪展，將載玻片放入溫箱中干燥。,10.脫蠟復(fù)水,目的：染色液多數(shù)為水溶液，因此染色前必須將組織中的蠟脫去，才能進(jìn)行染色。方法：與脫水浸蠟過(guò)程正好相反：二甲苯、30min100%酒精90%酒精80%酒精70%酒精蒸餾水各2min。石蠟二甲苯酒精水,11.染色,目的：使細(xì)胞組織內(nèi)的不同結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)不同的顏色以便于觀察。經(jīng)典的HE染色法：蘇木精（Hematoxylin）伊紅（Eosin）堿性染料酸性染料細(xì)胞核中的DNA、RNA等細(xì)胞質(zhì)、膜性結(jié)構(gòu)等嗜堿性物質(zhì)（本身酸性）嗜酸性物質(zhì)（本身堿性）染成藍(lán)色染成紅色,12.脫水13.透明14.封片,目的：去除水分，透明組織，便于觀察和長(zhǎng)期保存標(biāo)本。方法：脫水：95%酒精2分鐘100%酒精2分鐘透明：二甲苯I2分鐘二甲苯II2分鐘封片：將載玻片從二甲苯中取出放在吸水紙，迅速地在切片的中間滴一滴中性樹(shù)膠，拿起蓋玻片，緩慢傾斜放下，避免產(chǎn)生氣泡。,取材,固定,脫水、透明,浸蠟、包埋、切片、貼片,脫蠟復(fù)水,染色,脫水、透明,封片,smear,stretchedpreparation,groundsection,其他制片技術(shù)涂片(smear)鋪片(stretchedpreparation)磨片(groundsection),二、組織化學(xué)技術(shù)（histochemistry）,組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)技術(shù)是應(yīng)用化學(xué)反應(yīng)與物理反應(yīng)原理檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)某種化學(xué)成分，并進(jìn)行定位、定量及相關(guān)功能研究的一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)。例如糖類、脂類、酶、核酸等可與試劑發(fā)生化學(xué)、物理反應(yīng)，形成有色的終末產(chǎn)物。,過(guò)碘酸-Schiff反應(yīng)（periodicacidSchiffreaction,PAS反應(yīng)）,原理：PAS反應(yīng)是經(jīng)典的組織化學(xué)方法，用來(lái)顯示組織細(xì)胞中的多糖或糖蛋白。原理是含有乙二醇基的糖類，在過(guò)碘酸的作用下，經(jīng)氧化而產(chǎn)生雙醛基，醛基進(jìn)而與亞硫酸品紅（Schiff試劑）結(jié)合，使無(wú)色液體變成紫紅色染料，并沉著于含有多糖或糖蛋白的細(xì)胞或組織結(jié)構(gòu)上。,乙二醇,PA,氧化,醛基,Schiff試劑,紫紅色沉淀,（PAS陽(yáng)性反應(yīng)）,糖原的顯色PAS反應(yīng),應(yīng)用：可根據(jù)紫紅色的位置及深淺鑒定糖成分的分布及相對(duì)含量，用于心血管疾病、糖尿病以及某些腫瘤的診斷和研究。,腎小球,糖尿病腎病pas染色,小腸上皮,三、免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry）利用抗原（antigen,Ag），抗體（antibody）特異結(jié)合的原理，用已知抗體檢測(cè)未知抗原的一種方法。,標(biāo)記物為熒光素、過(guò)氧化物酶或金顆粒,糖原的顯色PAS反應(yīng),材料：標(biāo)本：成年小鼠肝和脾石蠟切片試劑：1%過(guò)碘酸，蒸餾水，亞硫酸品紅溶液（Schiff試劑），0.5%偏重亞硫酸鈉，蘇木精，二甲苯，梯度酒精，中性樹(shù)膠。器材：染色缸，燒杯，切片架，蓋玻片等。,方法：,3.過(guò)碘酸氧化10分鐘4.蒸餾水洗3分鐘5.Schiff試劑避光染色10分鐘6.0.5%偏重亞硫酸鈉溶液浸洗3次（I、II、III），每次2分鐘7.自來(lái)水洗3次，每次1分鐘，蒸餾水洗1分鐘8.蘇木精染色1分30秒9.自來(lái)水洗3次，每次1分鐘，蒸餾水洗1分鐘10.梯度脫水：95%酒精2分鐘100%酒精2分鐘，透明：二甲苯I2分鐘二甲苯II2分鐘11.中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察（低倍鏡高倍鏡）,*兩人一小組，分別觀察肝和脾切片,注意事項(xiàng)：,1.從前一個(gè)缸放入后一個(gè)缸之前，要盡量瀝干水。2.自來(lái)水洗滌方法：將切片架放入洗滌缸中，上下左右晃動(dòng)洗滌，切不可對(duì)著自來(lái)水沖洗。3.嚴(yán)格控