王麗娟南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院,第九講生物技術(shù)概論之基因工程,1.基因工程概念,基因工程：在生物體外，通過對DNA分子進(jìn)行人工“剪切”和“拼接”，對生物的基因進(jìn)行改造和重新組合，然后導(dǎo)入受體細(xì)胞進(jìn)行無性繁殖，使重組基因在受體細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生出所需要的基因產(chǎn)物。是有意識地將把一個生物體中有用的目的基因轉(zhuǎn)入另一個生物體中。,一、基因工程的基本過程,2、基因工程中常見的工具酶,（1）將目的基因片斷從細(xì)胞內(nèi)提取，需要基因的剪刀限制性內(nèi)切酶。（2）將目的基因與運(yùn)載體DNA連接，需要基因的針線DNA連接酶。（3）合成第二條cDNA鏈或用于標(biāo)記DNA大腸桿菌DNA聚合酶。,一、基因工程的基本過程,3、重組DNA（基因工程）的操作步驟基因工程是生物技術(shù)的核心部分。,基因工程的操作可以簡述如下：,一、基因工程的基本過程,基因工程的操作流程,基因工程的操作包含以下步驟：獲得目的基因構(gòu)造重組DNA分子轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染表達(dá)蛋白質(zhì)產(chǎn)物的分離純化,基因工程的基本操作：將外源基因（又稱目的基因，是一段DNA片斷）組合到載體DNA分子中去，再把它轉(zhuǎn)到受體細(xì)胞（亦稱寄主細(xì)胞）中去，使外源基因在寄主細(xì)胞中增殖和表達(dá)，從而得到期望的由這個外源基因所編碼的蛋白質(zhì)。,到哪里去找目的基因？一般來說，人的基因，要從人體的組織細(xì)胞中去找；小鼠的基因要從小鼠的組織細(xì)胞中去找。從組織細(xì)胞中可以分離得到人/小鼠的全套基因，稱為基因文庫。文庫中基因總數(shù)就人來說約有3萬個基因。如何從中把需要的基因找出來？采取“釣”的辦法。這個辦法通常稱為印跡法。,（1）獲得目的基因,返回,印跡法,內(nèi)切酶切開DNA,電泳分離DNA片段,印跡轉(zhuǎn)移,放射性探針雜交,膠片顯影,提取血液中的DNA,印跡法的主要步驟：（1）基因文庫DNA用限制性內(nèi)切酶處理。（2）DNA片斷混合物通過電泳分離。（3）電泳后，通過印跡技術(shù)轉(zhuǎn)到酯酰纖維薄膜上，以便操作。（4）用已知小片斷DNA作為探針，互補(bǔ)結(jié)合需要找的基因片斷。（5）探針DNA片斷已用放射性元素標(biāo)記，使膠片感光后可看出。,返回,返回,印跡法的關(guān)鍵是“分子雜交”：利用堿基配對的原則，用一段小的已知的DNA片斷去尋找（“釣”）大的未知的基因片斷。探針DNA片斷從何而來？根據(jù)目的蛋白的氨基酸序列，只要其中N端1520個氨基酸序列，按三聯(lián)密碼轉(zhuǎn)為40-60核苷酸序列，人工合成，即為探針DNA片斷。,（2）目的基因的擴(kuò)增,用上面的方法“釣”出的目的基因，數(shù)量極少，所以，接下來必須經(jīng)過擴(kuò)增，亦稱為基因克隆。獲得相當(dāng)數(shù)量的目的基因后，才能繼續(xù)下一步操作。,克隆生物分子，細(xì)胞，生物個體的無性增殖過程都稱為克隆。,返回,PCR把尋找目的基因和擴(kuò)增目的基因兩步操作并成一步。,PCR法，全稱多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是近年來開發(fā)出來的基因工程新技術(shù)，它的最大優(yōu)點(diǎn)是把目的基因的尋找和擴(kuò)增，放在一個步驟里完成。,PCR操作流程,900C,500C,700C,PCR反應(yīng)分三步完成：第一步900C高溫下，使混合物的DNA片斷因變性而成單鏈。第二步500C溫度下，引物DNA結(jié)合在適于配對的DNA片斷上。第三步700C溫度下，由合成酶（DNA高溫聚合酶）催化，從引物開始合成目的基因DNA。,FLASH：PCR,PCR的三個步驟為一次循環(huán)，約需510分鐘。每經(jīng)一次循環(huán)，所找到的目的基因擴(kuò)充一倍。經(jīng)過20次循環(huán)，即可擴(kuò)增106倍，總共只需幾個小時。,FLASH：PCR,（3）構(gòu)造重組DNA分子,首先要有載體。載體有好幾種，常用的有：質(zhì)粒環(huán)狀雙鏈小分子DNA，適于做小片斷基因的載體。噬菌體DNA線狀雙鏈DNA，適于做大片斷基因的載體。,返回,用質(zhì)粒構(gòu)建重組DNA分子,返回,用噬菌體DNA構(gòu)建重組DNA分子,其次要把目的基因“裝”到載體中去?！鞍惭b”的過程，需要的關(guān)鍵酶叫限制性內(nèi)切酶。此酶識別一定堿基序列，有的還可切出“粘性”末端，使得目的基因和載體的連接非常容易。,圖,下圖,限制性內(nèi)切酶識別特定的堿基序列,返回,限制性內(nèi)切酶造成粘性末端有利于重組DNA分子的構(gòu)建,（4）轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染,把構(gòu)造好的重組DNA分子送進(jìn)寄主細(xì)胞，亦需要適當(dāng)?shù)募夹g(shù)方法。若受體細(xì)胞是細(xì)菌，通常稱轉(zhuǎn)化；若受體細(xì)胞是動/植物細(xì)胞，通常稱轉(zhuǎn)染。,細(xì)菌的接合轉(zhuǎn)化,（5）目的基因表達(dá)及蛋白質(zhì)分離,進(jìn)入到寄主細(xì)胞的目的基因還要能表達(dá)產(chǎn)生有活性的目的蛋白，這些目的蛋白可以是某種蛋白質(zhì)藥物，也可以表達(dá)某種抗性性狀（如植物的抗病性和抗旱性）。蛋白質(zhì)的分離純化生物分離技術(shù),重組DNA分子進(jìn)入寄主細(xì)胞后，其中的目的基因能否表達(dá)，表達(dá)效率高低，還有很大差別。表達(dá)通常是指目的基因編碼的蛋白質(zhì)合成。基因工程的最后一步，是把所獲得的蛋白質(zhì)分離純化，得到蛋白質(zhì)產(chǎn)品。,生產(chǎn)基因工程產(chǎn)品的,生物反應(yīng)器,二、基因工程技術(shù)及應(yīng)用,（1）在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用基因工程被用于大量生產(chǎn)過去難以得到或幾乎不可能得到的蛋白質(zhì)肽類藥物。,胰島素1000磅牛胰10克胰島素200升發(fā)酵液10克胰島素,干擾素1200升人血23萬美元/病人1升發(fā)酵液200300美元/病人,返回,（2）提高奶酪產(chǎn)量生產(chǎn)奶酪的凝乳酶傳統(tǒng)上來自哺乳小牛的胃?，F(xiàn)在可以通過基因工程辦法，用酵母生產(chǎn)凝乳酶，大量用于奶酪制造。,哺乳小牛凝乳酶基因胃轉(zhuǎn)入啤酒酵母凝乳酶凝乳酶制造奶酪,返回,（3）轉(zhuǎn)基因動物和植物轉(zhuǎn)基因動物首先在小鼠獲得成功?！叭橄俜磻?yīng)器”工程：轉(zhuǎn)基因動物技術(shù)已用于牛、羊，使得從牛/羊奶中可以生產(chǎn)蛋白質(zhì)藥物。轉(zhuǎn)基因植物亦已在大田中廣為播種。,轉(zhuǎn)基因植物獲得新的性狀,返回,返回,把大鼠生長因子轉(zhuǎn)入小鼠,得到巨大型的轉(zhuǎn)基因小鼠。,隨著轉(zhuǎn)基因作物的普及，目前世界已經(jīng)有很多食品中含有轉(zhuǎn)基因成分，如食用油、土豆泥、番茄醬、豆制品，海關(guān)檢測表明60%的進(jìn)口食品中含有轉(zhuǎn)基因成分。轉(zhuǎn)基因食品的安全性目前世界上尚未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因食品對人類健康的危害，但是安全性仍然需要長期監(jiān)測。各國制定了相關(guān)法規(guī)，中國農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例、農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)志管理辦法（包括大豆、玉米、油菜、番茄及其加工產(chǎn)品）,轉(zhuǎn)基因食品,（4）工程菌在環(huán)境工程中應(yīng)用美國GE公司構(gòu)造成功具有巨大烴類分解能力的工程菌，并獲專利，用于清除石油污染。,噴灑工程菌清除石油污染,下圖,無冰晶細(xì)菌幫助草莓抗霜凍,返回,三、人類基因組計劃,1、人類基因組計劃產(chǎn)生的背景2、人類基因組計劃任務(wù)和意義3、基因研究是把雙刃劍,現(xiàn)代自然科學(xué)的發(fā)展使人類成為地球上的主宰，但人類對自身的認(rèn)識和保護(hù)卻不盡如人意。全球約有20%-50%的人每天備受各種慢性疾病的折磨；我國11%的人患有高血壓；4.2%人有不同程度的殘疾；2.5%的人智力低下；腫瘤、心血管疾病等主要死因已成為驅(qū)除不掉的幽靈；艾滋病、瘋牛病等新的傳染病使人們對未知災(zāi)難又有了新的恐懼。人類對人體自身的奧秘知之甚少，有鑒于此，研究人類基因組，揭示人類基因的奧秘，認(rèn)識人類的遺傳信息并進(jìn)而了解人類各種疾病與基因的相互關(guān)系，從而達(dá)到從根本上預(yù)防人類疾病發(fā)生以及有效根治疾病。,1、人類基因組計劃產(chǎn)生的背景,如果把人類基因組比喻為一本有10億單詞的百科全書,這本書可分為23章，每章為一個染色體。而每一個染色體上又包含數(shù)千個被稱為基因的“故事”。這些故事由一系列3字母單詞組成，其中每個單詞是4個基本化學(xué)即字母即：G，C，A，T這4種堿基的任意排列組合。人類基因組計劃正是要讀出這30億個堿基，也就是測出人體所有染色體30億堿基對的排列順序。,何為基因組計劃？,人類基因組計劃的主要任務(wù)是：找出人體的約10萬個基因，確定30億個堿基對的排列順序，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，認(rèn)識人類的遺傳信息。其意義在于揭示人類基因的奧秘，并進(jìn)而了解人類各種疾病與基因的相互關(guān)系，從而達(dá)到從根本上預(yù)防人類疾病發(fā)生以及有效根治疾病，生命現(xiàn)象將在分子水平得到解釋。,2、人類基因組計劃任務(wù)與意義,人類基因組計劃發(fā)展過程:1986美Dulbecco首次提出了“人類基因組工程”。原計劃約10-15年完成，耗資30億美元，其宏偉的程度堪與Manhatto原子彈計劃和Appolo登月計劃相提并論。19904月美國宣布開始實(shí)施人類基因組測序工作。,1999破譯出人類第22號染色體的遺傳密碼。2000完成了人類第21號染色體的測序。預(yù)計從原定的2003年6月提前到2001年6月完成。2000年6月26日美，英,日，德，法，中六國共同宣布人類基因組工作草圖繪制成功。,2000年3月塞萊拉公司宣布完成了果蠅的基因組測序。12月14日英美等國科學(xué)家宣布繪出擬南芥基因組的完整圖譜。這是人類首次全部破譯一種植物的基因序列。,2001年:1、2月，HGP和美國塞萊拉（Sequencing）公司將各自測定的人類基因組工作框架圖分別發(fā)表在Nature和Science上，這表明人類基因組計劃（HGP）進(jìn)入了一個展新的階段。,2003年4月14日美，英日，德，法，中六國科學(xué)家完成了人類基因組序列圖的繪制，實(shí)現(xiàn)了人類基因組計劃的所有目標(biāo)。,2003年人類表觀基因組計劃(HumanEpigenomeProject)于10月7日正式啟動。這是世界上首項(xiàng)針對控制人類基因“開”和“關(guān)”的主要化學(xué)變化進(jìn)行的圖譜繪制工作，它將幫助科學(xué)家建立人類遺傳與疾病之間的關(guān)鍵聯(lián)系。,2004年10月國際人類基因組計劃合作組織在Nature雜志上宣布誤差小于10萬分之一的人類基因組完成圖已成功繪就。已將原來15萬個“缺隙”減少到341個。完成圖顯示人類基因組只含有22.5萬個基因，比原來的估計要少。,基因革命，未來讓人們看到具體的成果人類基因組研究所所長柯林斯認(rèn)為，圖譜的最大用途是可以用于醫(yī)療診斷。今后醫(yī)生可以把病灶告訴有遺傳傾向的人，讓他們設(shè)法避開日后發(fā)病的危險。美國國家人類基因組研究所對未來25年做了預(yù)測：2-3年內(nèi)繪制出覆蓋率為100%的序列圖，同時制訂有關(guān)法律；2002-2010年，對癌癥、糖尿病等疾病將出現(xiàn)相關(guān)基因的檢測試驗(yàn)，對血友病將出現(xiàn)臨床基因治療方法；2015年，將研究出適應(yīng)個人基因組合的治療方法，可治療包括癌癥在內(nèi)的很多疾?。?025年，醫(yī)生將有能力修復(fù)基因缺陷，某些如貧血之類的先天性疾病從此將成為歷史。到2050年,許多病癥將會在癥發(fā)前就被消滅。,1999年5月，中國加入這一研究計劃，負(fù)責(zé)測定3號染色體上三千萬個堿基對，中國因此成為參與這一研究計劃的唯一發(fā)展中國家。中國科學(xué)家僅用半年時間就完成所承擔(dān)的任務(wù)。中國現(xiàn)在的測序能力排名第四，在美、英、日之后，在德、法之前。華大基因研究中心的測序能力在參與人類基因組計劃的全世界16個實(shí)驗(yàn)室中，排名第七。,中國科學(xué)家做了什么？,是否參與“計劃”的討論持續(xù)了十年兩種意見：大多數(shù)科學(xué)家主張把有限的基金投入到基因組的下游工程生物基因開發(fā)上。這是建立在上游工程基因測序當(dāng)選據(jù)公開、成果共享的基礎(chǔ)上。如果所有的基因圖譜都向外國買，中國買不起。21世紀(jì)兩大支柱產(chǎn)業(yè)信息產(chǎn)業(yè)的核心技術(shù)已被外國掌握，我們只能以市場以代價換技術(shù)。在21世紀(jì)，我們的健康需要人類基因組計劃，我們的醫(yī)藥工業(yè)需要它，我們的農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)都需要它。,對蝦病毒事例90年代中期我國對蝦受病毒侵害,造成慘重?fù)p失。為了對付這種病毒，需要對病毒的基因組進(jìn)行測定。然而當(dāng)時中國沒有這種能力做，只好委托外國公司做。這個工作量只相當(dāng)于這次1%的1%，只需花30萬元，而讓別人來做花掉180萬元不說，還要出讓1/3的知識產(chǎn)權(quán)。1998年8月，中科院遺傳所的“人類基因中心”掛牌，次年2月，中心決心搞基因組測序，創(chuàng)造加入國際人類基因組計劃的條件。,圖譜繪制僅是一小步對完全理解人體基因系統(tǒng)而言，繪制出基因草圖只是第一步。有了基因圖，研究人員可能需要幾十年時間才能破譯這些基因組。關(guān)鍵是破譯這些基因的作用！只有破譯才能利用！中國已經(jīng)開始把這一成果應(yīng)用于水稻作物的改良。關(guān)于開展中國超交水稻基因組研究協(xié)議，并正式啟動。積極籌劃對家豬進(jìn)行全基因組測序。目前已經(jīng)進(jìn)入后基因組時代基因工程蛋白質(zhì)工程應(yīng)用,基因保護(hù)比爾.蓋茨說，第二個“比爾.蓋茨”將出現(xiàn)在基因領(lǐng)域，為此他看好這一新領(lǐng)域，向幾個實(shí)驗(yàn)室投了不少錢。中科院“到2009年，全世界的基因產(chǎn)業(yè)帶來的銷售額將達(dá)450億美元?！薄盎蚓褪清X”，由于其孕育著巨大的商業(yè)利潤，爭奪基因資源的世界大戰(zhàn)已經(jīng)打響。中國基因資源為世界首富。覬覦中國基因資源的多了起來：賽萊拉公司在臺灣和上海登陸；日本的龍基因組公司在大連設(shè)立DNA模扳制備自動線；某國在中國采集健康老人血樣。,1997年我國遺傳學(xué)泰斗談家楨致函國家領(lǐng)導(dǎo)人：“我國人類基因資源流失情況已十分嚴(yán)重，如不采取有力措施，我國基因資源將被掠奪殆盡，很快變成外國公司的專利?！?998年科技部和衛(wèi)生部聯(lián)合出臺了有關(guān)人類遺傳資源的管理暫行辦法。只有建立我國強(qiáng)大的基因研究能力，并占有自己的基因?qū)＠?，才能有效防止外國對中國的資源掠奪。基因發(fā)現(xiàn)一個少一個，能搶一個是一個。誰占有較多的基因?qū)＠l就在人類基因的商業(yè)開發(fā)方面（包括基因藥品物、基因診斷、基因治療）搶得先機(jī)。,科學(xué)技術(shù)進(jìn)步從來