SDS-PAGE電泳的原理和濃縮凝膠濃縮樣品的原理(甘氨酸的作用)SDS-PAGE (十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)是目前最常用的分離蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)。 簡要介紹了SDS-PAGE的基本原理。SDS-PAGE電泳的基本原理是什么？SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引入SDS，SDS破壞分子內(nèi)與分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑破壞半胱氨酸間的二硫鍵，蛋白質(zhì)在含有一定濃度強(qiáng)還原劑的SDS溶液中與SDS分子成比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體該復(fù)合體通過結(jié)合大量的SDS，形成在蛋白質(zhì)失去本來電荷的狀態(tài)下僅保持本來分子大小的負(fù)離子團(tuán)塊，減少或消除各種蛋白質(zhì)分子間的自然電荷差異，SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合分子量在15KD到200KD之間，蛋白質(zhì)遷移率與分子量的對數(shù)具有線性關(guān)系，如果將logMW=K-bX，式中： MW為分子量，x為遷移率，k，b為常數(shù)，已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率繪制成分子量對數(shù)，則未知蛋白質(zhì)在相同條件下電泳，其電泳遷移率為15KD到200KDSDS-PAGE電泳成功的關(guān)鍵是什么？溶液中SDS單體的濃度SDS以單體和SDS-多肽膠束的混合形態(tài)存在于水溶液中，能夠與蛋白質(zhì)分子結(jié)合的是單體。 為了保證蛋白質(zhì)和SDS的充分結(jié)合，它們的重量比必須是1:4或1:3。 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度，SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合量僅依賴于平衡時(shí)SDS單體的濃度，不僅僅在總濃度，而且在低離子強(qiáng)度的溶液中，SDS單體具有較高的平衡濃度。 因此，SDS電泳樣品緩沖液離子強(qiáng)度低，常為10-100 mM。 二硫鍵是否被完全還原，在二硫鍵被完全還原后，蛋白質(zhì)分子被分解，SDS定量結(jié)合亞基給出相對遷移率和分子質(zhì)量對數(shù)的線性關(guān)系。 樣品緩沖劑中-巰基乙醇的濃度始終為4-5%，二硫蘇糖醇的濃度始終為2-3%。 前者具有揮發(fā)性，最好在使用前加入。SDS-PAGE緩沖液系統(tǒng)的選擇、Tris-Glycine、Tris-Tricine、Tris-硼酸鹽等？一般可以使用分析蛋白質(zhì)在穩(wěn)定pH范圍內(nèi)與SDS不相互作用的緩沖液，但緩沖液的選擇對蛋白質(zhì)帶的分離和電泳速度非常重要。 Tris-甘氨酸系統(tǒng)是目前使用最多的緩沖系統(tǒng)。 為了測定糖蛋白質(zhì)的分子量，優(yōu)選采用Tris-硼酸鹽緩沖系統(tǒng)，但分子量小于15 kDa的蛋白質(zhì)樣品可以采用SDS-尿素系統(tǒng)，也可以采用Tris-tricine緩沖系統(tǒng)。層壓橡膠(或濃縮橡膠)的作用原理是什么？緩沖系統(tǒng)中的弱酸，如甘氨酸在pH6.7下解離少，其有效游泳速度低，但氯離子具有高游泳速度，蛋白質(zhì)游泳速度介于兩者之間。 施加電壓后，作為先導(dǎo)離子的氯離子和作為后續(xù)離子的甘氨酸離子分離，之后殘留有電導(dǎo)率低的區(qū)域。 由于導(dǎo)電性與電場強(qiáng)度成反比，在該地區(qū)可獲得高電壓梯度，加速甘氨酸離子的游泳，追趕氯離子，確立甘氨酸與氯離子的電壓梯度與游泳速度之積相等的穩(wěn)定狀態(tài)，使這些帶電粒子以相同的速度游泳，兩離子之間有明顯的邊界甘氨酸與氯離子的界面通過樣品進(jìn)入濃縮凝膠，在界面移動前有較低的電壓梯度，界面后有較高的電壓梯度。 由于蛋白質(zhì)分子在遷移界面前的遷移速度低于氯離子，氯離子可以迅速越過。 在界面移動的蛋白質(zhì)處于高電壓梯度，其遷移速度比甘氨酸快。 因此，移動的界面堆積蛋白質(zhì)分子，形成狹窄的帶。 蛋白質(zhì)在移動界面的濃度作用僅依賴于樣品和濃縮凝膠中Tris-HCl的濃度(為什么？ 中所述情節(jié)，對概念設(shè)計(jì)中的量體體積進(jìn)行分析。 濃縮凝膠為大孔凝膠，因此蛋白樣品無分子篩作用。 移動界面到達(dá)濃縮凝膠和分離凝膠的界面時(shí)，凝膠的pH顯著增加，甘氨酸大量解離。 此時(shí)甘氨酸的有效遷移速度明顯增加，超過蛋白分子，直接轉(zhuǎn)移到氯離子后。 凝膠孔徑減小，蛋白質(zhì)分子遷移速度降低，后落蛋白質(zhì)在均勻的電壓梯度和pH環(huán)境下遷移，通過固有電荷與分子大小分離。可知甘氨酸不作為緩沖成分參與，而作為后續(xù)離子參與電泳。以上內(nèi)容主要摘自蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)第二版(郭堯君編著)。 需要了解更詳細(xì)內(nèi)容的學(xué)生可以查閱這本書。SDS-page電泳問題問： Q:SDS-PAGE電泳的基本原理是？答： SDS -聚丙烯酰胺凝膠電泳在聚丙烯酰胺凝膠體系中引入SDS (十二烷基硫酸鈉)，SDS破壞分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強(qiáng)還原劑破壞半胱氨酸間的二硫鍵，蛋白質(zhì)濃度一定與SDS分子成比例地結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合體，該復(fù)合體通過結(jié)合大量的SDS，形成在蛋白質(zhì)失去本來的電荷的狀態(tài)下僅保持本來的分子大小的負(fù)離子團(tuán)塊，減少或消除各種蛋白質(zhì)分子之間的自然電荷差異，SDS和蛋白質(zhì)的結(jié)合分子量在15KD到200KD之間，蛋白質(zhì)遷移率與分子量的對數(shù)具有線性關(guān)系，如果將logMW=K-bX，式中： MW為分子量，x為遷移率，k，b為常數(shù)，已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率繪制成分子量對數(shù)，則未知蛋白質(zhì)在相同條件下電泳，其電泳遷移率為15KD到200KD問：配合緩沖液系統(tǒng)對電泳的影響如何？在SDS-PAGE不連續(xù)電泳中，制膠緩沖液采用Tris-HCL緩沖系統(tǒng)，濃縮膠為pH6.7，分離膠pH8.9； 電泳緩沖液使用Tris-甘氨酸緩沖系統(tǒng)。 濃縮凝膠由于pH環(huán)境為弱酸性，甘氨酸的解離少，電場導(dǎo)致電泳效率低的CL離子高，兩者之間形成電導(dǎo)率低的區(qū)域，蛋白質(zhì)分子在兩者之間游動。 由于導(dǎo)電性與電場強(qiáng)度成反比，因此該帶形成高電壓整形度，按壓蛋白質(zhì)分子而聚集，濃縮成窄帶。 樣品進(jìn)入分離凝膠后，凝膠中的pH增加，變成堿性，甘氨酸大量解離，遷移速度增加，氯離子后，分離凝膠的孔徑縮小，在電場作用下蛋白質(zhì)分子根據(jù)其固有的帶電性和分子的大小分離。因此，pH對整個(gè)反應(yīng)體系的影響非常重要，在實(shí)驗(yàn)中排除其他因素后仍無法順利解決問題的情況下，必須首先考慮這個(gè)因素。問：樣品怎么處理？答：根據(jù)樣品的分離目的，主要有還原SDS處理、非還原SDS處理、具有烷基化作用的還原SDS處理三種處理方法。1、還原SDS處理：在還原劑中加入SDS和DTT (或Beta巰基乙醇)后，蛋白質(zhì)的構(gòu)象解離，電荷被中和，形成SDS和蛋白質(zhì)結(jié)合的分子，在電泳中只用分子量進(jìn)行分離。 一般的電泳是這樣處理的，樣品稀釋成適當(dāng)?shù)臐舛?，加入上型Buffer，離心，用沸水煮5min，離心后加入樣品。2、具有烷基化作用的還原SDS處理：碘乙酸胺的烷基化作用可以牢固保護(hù)SH基，得到狹窄的光譜帶，而碘乙酸胺還可以捕捉過剩的DTT，防止銀染時(shí)的紋理現(xiàn)象。 將100ul樣品緩沖液中碘乙酸胺的10ul 20%在室溫下保溫30min。3、非還原SDS處理：生理體液、血清、尿素等樣品通常只在1%SDS沸水中煮3min，未添加還原劑，蛋白折疊不受破壞，不能作為測定分子量使用。問： Q:SDS-PAGE電泳凝膠中各主要成分的作用是？A:聚丙烯酰胺的作用：為丙烯酰胺和蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳的成敗，與凝聚促進(jìn)劑和環(huán)境密切相關(guān)制糊緩沖液：濃縮糊為pH6.7，分離糊為pH8.9，tris-HCL系統(tǒng)，具體作用后述TEMED和AP :促進(jìn)凝聚，加速聚丙烯酰胺的凝固十二烷基硫酸鈉(SDS ) :陽離子去污劑具有去除蛋白質(zhì)電荷，解離蛋白質(zhì)之間的氫鍵，去除蛋白質(zhì)分子內(nèi)的疏水作用，折疊肽的作用。如何提高SDS-PAGE電泳的分辨率？A:1、聚丙烯酰胺的充分聚合可以提高凝膠的分辨率。 方法：凝膠在室溫凝固后，可在室溫放置一段時(shí)間使用。 禁忌立即或在冰箱中放置4度，前者容易導(dǎo)致凝固不足，后者可能引起SDS結(jié)晶。 一般凝膠可在室溫下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的染料有氨基黑、考斯布萊頓、銀染色3種，染色方法因染料而異。 具體可參照郭堯君編著的蛋白質(zhì)電泳技術(shù)手冊 P82-103。q :“笑臉”(兩側(cè)向中央凹陷)帶子的原因是？答：主要是由于凝膠中間部分凝固不均，多表現(xiàn)在厚凝膠中。處理方法：充分凝固后進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。問：“皺著眉頭”(兩側(cè)向下半部分鼓起)樂隊(duì)的原因是什么？答：主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳池中，一般不排除兩板之間的底部間隙氣泡。處理方法：在兩板之間加入適量緩沖液，可排除氣泡。問：為什么會發(fā)生拖尾現(xiàn)象？答：主要原因是樣品熔化效果差或分離膠濃度過高。處理方法：選擇加樣前離心的適當(dāng)樣品緩沖液，加適量樣品促進(jìn)劑電泳緩沖液時(shí)間過長，降低重制凝膠濃度。問：為什么會出現(xiàn)紋理現(xiàn)象？a :主要取決于樣品不溶性粒子。處理方法：加入樣品前離心適量樣品促進(jìn)溶劑。問：什么是鬼帶？ 我該怎么辦？答：“鬼帶”是指大分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)分子在游泳道前端出現(xiàn)的(濃縮膠中)大分子的未知帶或樣品孔的底部有沉淀，主要是由于還原劑在加熱過程中被氧化而失去活性，分離的蛋白質(zhì)分子再次被折疊結(jié)合，亞基聚集成大分子但是，它對目標(biāo)條紋具有相同的免疫學(xué)活性，在WB反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)了能夠?qū)?yīng)目標(biāo)條紋的抗體作用。處理方法：加熱煮沸后加入適量的DTT或Beta巰基乙醇，可以補(bǔ)充不足的還原劑，或者加入適量的EDTA阻止還原劑氧化。問：為什么溴酚藍(lán)不作指示？答：我們在實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常遇到溴酚藍(lán)從板底飛出，但蛋白質(zhì)還沒有掉落的現(xiàn)象。 主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。處理方法：降低更換正確pH的Buffer的分離橡膠的濃度。問：為什么電泳帶那么粗？答：電泳中帶粗是常見的，主要是不濃縮的原因。處理方法：適當(dāng)增加濃縮橡膠的長度，保證濃縮膠液的pH值正確(6.7)適當(dāng)降低電壓問：為什么電泳電壓高卻電流低？a :這種現(xiàn)象一般容易發(fā)生在初學(xué)者身上。 例如電壓為50v以上，電流為5mA以下。 主