從基因表達(dá)譜到蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫通路的解析上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文從基因表達(dá)譜到蛋白質(zhì)相互作用系統(tǒng)性紅斑狼瘡免疫通路的解析姓名葉霜申請學(xué)位級別博士專業(yè)內(nèi)科學(xué)風(fēng)濕病學(xué)指導(dǎo)教師顧越英200351上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文摘要第一部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡的基因表達(dá)譜及其免疫調(diào)控通路的研究目的通過基因表達(dá)譜勾畫系統(tǒng)性紅斑狼瘡,發(fā)病機(jī)制中可能的免疫調(diào)控通路。方法用寡核苷酸基因芯片研究了例包括例同胞對和份正常對照的外周血白細(xì)胞基因表達(dá)譜。進(jìn)行了基因表達(dá)譜和臨床免疫表型的聚類分析和比較篩選統(tǒng)計學(xué)顯著性差異表達(dá)的相關(guān)基因,并在轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證芯片表達(dá)譜結(jié)果。結(jié)果聚類分析揭示臨床免疫表型與基因表達(dá)譜特征存在關(guān)聯(lián)。獲得個顯著性差異表達(dá)的相關(guān)基因,其中大部分未經(jīng)報道。應(yīng)用熒光實(shí)時定量在轉(zhuǎn)錄水平用較大樣本獨(dú)立驗(yàn)證了其中/,在中的表達(dá)上調(diào)蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證了/的高表達(dá)。結(jié)論基因表達(dá)譜可能是其臨床免疫表型的分子基礎(chǔ),結(jié)合一例以淋巴增殖為主要表現(xiàn)的特殊類型的個案分析,探討了通過基因表達(dá)譜進(jìn)行分型乃至鑒別診斷的可能性。通過顯著性差異表達(dá)的相關(guān)基因,推測干擾素及其免疫調(diào)控通路在發(fā)病中可能扮演重要角色。第二部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用目的干擾素誘導(dǎo)蛋白為第一部分基因表達(dá)譜研究中首次報道的相關(guān)基因。試圖運(yùn)用蛋白組學(xué)的策略研究的蛋白質(zhì)相互作用,以揭示其可能的功能。方法熒光實(shí)時定量進(jìn)一步驗(yàn)證外周血白細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平基因的表達(dá)應(yīng)用分子克隆技術(shù)在大腸桿菌克隆并表達(dá)融合蛋白利用表達(dá)標(biāo)簽,以為餌蛋白捕獲外周血白細(xì)胞蛋白裂解物中與存在相互作用的蛋白質(zhì),肽指紋圖譜進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。結(jié)果熒光實(shí)時定量證實(shí)基因確在例較正常對照例表達(dá)上調(diào)。克隆表達(dá)了,土鋈苤三匿型丕堂整主堂堡婆至融合蛋白,并捕獲到一個與存在相互作用的蛋白質(zhì),經(jīng)肽指紋圖譜初步鑒定。結(jié)為/鳥瞟呤核苷交換因子/論是新的相關(guān)基因。運(yùn)用蛋白組學(xué)的策略研究蛋白質(zhì)水平的相互作用顯示,與/鳥嘌呤核苷交換因子存在相互作用,可能通過該途徑影響蛋白的活化,參與的發(fā)病。第三部分對小鼠自發(fā)性的免疫調(diào)節(jié)作用目的觀察新型免疫抑制劑對自發(fā)性動物模型小鼠的治療作用,并用芯片從基因表達(dá)調(diào)控角度考察可能作用的免疫通路。方法小鼠給與每次/灌胃,每周次從周齡起點(diǎn)動態(tài)評估血清滴度和腎臟組織病理學(xué)改變。用芯片檢測脾臟單個核細(xì)胞基因表達(dá)譜。結(jié)果能夠降低處理組模型血清的滴度,對模型小鼠免疫復(fù)合物性腎小球腎炎有明顯的抑制作用。脾臟單個核細(xì)胞基因表達(dá)譜篩選到差異表達(dá)基因個,包括一批與細(xì)胞移行相關(guān)的、參與細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)的基因。結(jié)論能夠?qū)钳從Ｐ推鸬揭种谱饔?。表達(dá)譜數(shù)據(jù)支持主要是通過激活鞘氨醇一一磷酸卜,受體從而加速淋巴細(xì)胞重新分布的免疫調(diào)節(jié)作用機(jī)制,并提示該通路可能需要蛋白和鈣調(diào)蛋白參與?？赡艹蔀閰^(qū)別于細(xì)胞毒免疫抑制劑的新的治療藥物。關(guān)鍵詞紅斑狼瘡,系統(tǒng)性基因表達(dá)譜免疫通路干擾素蛋白質(zhì)相互作用治療三塑蔓三墮型塞堂堡主堂堡堡墨主要創(chuàng)新點(diǎn),應(yīng)用研究人類系統(tǒng)性紅斑狼瘡?fù)庵苎虮磉_(dá)譜,篩選到一批未經(jīng)報道的相關(guān)基因,提示通路在發(fā)病中的重要作用并初步提示基因表達(dá)譜和臨床免疫表型譜存在關(guān)聯(lián)。文章發(fā)表于中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,月”。國外最早的同類工作見于,月【】,整合并發(fā)展了一套實(shí)用的大規(guī)模表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析方法,以及轉(zhuǎn)錄組下游的功能基因組學(xué)研究策略。將一個表達(dá)譜分析篩選到的功能尚不清楚的誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)基因,通過表達(dá)純化標(biāo)簽捕獲、并經(jīng)質(zhì)譜初步鑒定了,與/存在相互作用。該部分研究內(nèi)容被接收【】,方法學(xué)內(nèi)容部分發(fā)表于中華醫(yī)學(xué)雜志,第期【】,用新型的免疫抑制/調(diào)節(jié)劑治療自發(fā)性狼瘡模型國外同類工作第一篇文獻(xiàn)見于年,用于治療小鼠】。通過小鼠脾臟單個核細(xì)胞基因表達(dá)譜的分析,支持主要是通過激活受體從而加速淋巴細(xì)胞重新分布的作用機(jī)制,并提示該通路可能需要蛋白和鈣調(diào)蛋白參與?？赡艹蔀閰^(qū)別于細(xì)胞毒免疫抑制劑的新的治療藥物。,研究了一例以淋巴增殖為突出表現(xiàn)的狼瘡樣綜合征的基因表達(dá)譜,可能是首例用協(xié)助臨床診斷和鑒別診斷的案例。上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文,/,/,/,上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文,/,/上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文,/,一,上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文第部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡的基因表達(dá)譜及其免疫調(diào)控通路的研究前言系統(tǒng)性紅斑狼瘡,是具有代表性的多系統(tǒng)受累的自身免疫病。其病因和發(fā)病機(jī)理未明。人類和狼瘡鼠動物模型的全基因組掃描和易感基因精細(xì)定位的工作提示,的發(fā)病是多基因相互作用的結(jié)果。其免疫表型可能為個不同層次的病理途徑的綜合效應(yīng)】對核抗原免疫耐受的喪失,參與基因位點(diǎn)如鼠,免疫調(diào)節(jié)紊亂,參與基因位點(diǎn)如,免疫效應(yīng)階段的終末器官損傷,參與基因位點(diǎn)如,圖,涉及上述個層次的基因型的組合,構(gòu)成了臨床免疫表型的多樣性。隨著人類基因組計劃的草圖完成,生命科學(xué)的研究已經(jīng)進(jìn)入了后基因組時代。因此,進(jìn)一步從基因表達(dá)調(diào)控全局性的考察的發(fā)病機(jī)制成為必須。堂。薰。一糍蛩慧苫墨翟?！?。器鬻搿。自。電蠱圖的免疫通路異常,土塑蔓三墮型丕堂堡圭堂堡造基基因芯片,又稱為微陣列技術(shù),為該研究需要提供了合適的高通量工具】。直到晚近,才有收錄的人類基因表達(dá)譜的研究報道【。我們的研究策略是試圖通過外周血白細(xì)胞基因表達(dá)譜,揭示臨床免疫表型的多樣性與基因表達(dá)譜特征的關(guān)聯(lián)并篩選統(tǒng)計學(xué)顯著性差異表達(dá)的相關(guān)基因,在獨(dú)立驗(yàn)證上述結(jié)果的基礎(chǔ)上,勾畫可能的免疫調(diào)控通路和潛在的藥物作用靶點(diǎn)以期最終干預(yù)的自身免疫過程研究策略路線圖見。患者鞲正常對照外周血白細(xì)胞。脾臟單強(qiáng)個核細(xì)胞氣一逆轉(zhuǎn)錄,夠/、四脅,燕憾古硪拈艄飆徽。圖基于表達(dá)譜的免疫通路和免疫調(diào)節(jié)研究策略材料與方法研究對象和標(biāo)本來源來自上海第二醫(yī)科大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院風(fēng)濕病學(xué)科病房及門診的中國漢族患者共例,均符合年推薦的分類標(biāo)準(zhǔn)【。其中男性例,女性例以字母編號/,其中為治療后再次進(jìn)行基因芯片檢測,和為同胞對,平均年齡歲,另肴例以土塑蔓三匿型丕堂型主室焦堡塞淋巴增生為主要表現(xiàn)的狼瘡樣綜合征患者,也進(jìn)行了治療前后的基因芯片檢測/。每例病人均記錄臨床資料見表,并按量表【】進(jìn)行病情評估例的積分范圍,平均,在原量表基礎(chǔ)上增加,低補(bǔ)體血癥等項(xiàng),共計項(xiàng)稱之為,其中抗體滴度按,一,/分別記分為,。其余增加項(xiàng)目均按或記錄無或有。以細(xì)胞為底物,記為分。另選取性別、年齡相匹配的正常對照完成張對照芯片。例臨床表現(xiàn)分類表臨床表現(xiàn)木系統(tǒng)癥狀疲勞、發(fā)熱、消瘦等女女面部紅斑或口鼻潰瘍或光敏感皮膚血管炎關(guān)節(jié)痛/關(guān)節(jié)炎女廣泛淋巴結(jié)病/肝脾腫大漿膜炎女肺臟累及胃腸道血管炎木腎炎貧血白細(xì)胞減少血小板減少女血沉增快術(shù)/減低本表根據(jù)積分表簡并,并增加了有關(guān)自身抗體譜內(nèi)容。病人排列順序參照聚類分析結(jié)果圖。為例以淋巴增生為主要表現(xiàn)的狼瘡樣綜合征患者。示治療后好轉(zhuǎn)上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文主要試劑和儀器基因芯片采用“寡核苷酸芯片,點(diǎn)陣共點(diǎn)見圖,包括點(diǎn)空白對照、點(diǎn)陰性對照、點(diǎn)看家基因陽性對照,涵蓋多數(shù)已知免疫相關(guān)基因見/。,、“、鹽酸胍華美生物工程公司羊抗兔二抗同上兔抗/多抗兔抗人多抗作為內(nèi)參照武漢博士德公司化學(xué)發(fā)光試劑液和液上海普飛生物技術(shù)有限公司熒光定量儀。、垂直/水平電泳槽同上分光光度計凝膠成像系統(tǒng)超聲細(xì)胞粉碎機(jī)寧波新芝雙頭水浴搖床雜交箱同上/離心機(jī)上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文同上探針的合成和芯片雜交基本流程為用提取患者或健康對照者外周血自細(xì)胞總,進(jìn)而用完成逆轉(zhuǎn)錄,引物為帶啟動子的,并合成第二鏈。再利用啟動子完成雙鏈的體外轉(zhuǎn)錄,合成生物素標(biāo)記的探針后與芯片雜交。具體步驟如下總的提取及質(zhì)量檢測抽取患者或健康對照者外周血均抗凝待檢。用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞。提取白細(xì)胞的總按說明書操作。瓊脂糖電泳檢驗(yàn)質(zhì)量。,分光光度計測總的濃度和純度,濃度需達(dá)到要求的量,其/比值。生物素標(biāo)記探針的合成逆轉(zhuǎn)錄合成單鏈解凍必需的試劑盒成分,混勻后放在冰上。加入下列成分成分體積總體積。孵育分鐘,然后立即放在冰中。上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文加入下列成分成分體積最后濃度總體積為輕輕混合,。孵育分鐘。將反應(yīng)管放在冰上終止反應(yīng)。立即進(jìn)行第二鏈的合成。合成第二鏈解凍必需的試劑盒成分,混勻后放在冰上。在冰上,將下列成分加入第一鏈反應(yīng)管。成分體積“無酶水一一一最后體積輕輕混合,。孵育。加入的聚合酶。孵育。加入。上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文消化在上述反應(yīng)管中加入,消化。加入蛋白酶,消化。雙鏈的純化加入。劇烈振蕩。離心,將上清轉(zhuǎn)移入一新離心管。加入/。劇烈振蕩。離心,將上清轉(zhuǎn)移入一新離心管。加入。劇烈振蕩。離心,將上清轉(zhuǎn)移入一新離心管。加入/體積的和的溶液/倍體積的預(yù)冷至一。的。劇烈振蕩后,放入一冰箱至少。,離心。小心去除上清液,加入,離心。小心去除上清液,室溫下空氣干燥。加入,水溶解。放入一。冰箱保存,或立即進(jìn)行下列操作。體外轉(zhuǎn)錄合成生物素標(biāo)記的探針在上述合成的中加入下列成分成分體積最后濃度枷占望墨三墾型丕堂熊主堂焦婆塞孵育。加入無酶水和,完全混合。加入等體積的/。劇烈振蕩。離心,將上清轉(zhuǎn)移入一新離心管。加入等體積的。劇烈振蕩。離心,將上清轉(zhuǎn)移入一新離心管。加入等體積的,混勻。一四分鐘。,離心。加入水。除非立即雜交,一。保存。標(biāo)記生物素探針的檢測】將生物素標(biāo)記的標(biāo)本點(diǎn)到醛基化玻璃片上,室溫干燥。在。上紫外光交聯(lián),室溫下,加入的,緩沖液孵育。室溫下,加入的孵育。將玻片放入錐形管中,加入,緩沖液洗滌。重復(fù)兩次。加入。,室溫孵育上鎏簍三蜃型盔堂墮主塑造塞一二二將玻片放入錐形管中,加入緩沖液洗滌。重復(fù)兩次。洗滌干燥后使用掃描,得出圖像。標(biāo)記的探針與基因表達(dá)芯片雜交至。,懸浮所有沉積的物質(zhì)。加熱加入到生物素標(biāo)記的探針管中,。加熱,將探針裂解成。立即放入冰中,簡要離心將樣本收集到管底。加入的,混勻后加入雜交艙中,封閉后,在雜交箱。搖動雜交過夜。去除雜交艙,將芷片浸入裝有洗液一,簡單沖洗,轉(zhuǎn)移入一新的裝有洗液一的錐形管中。,在洗液一中搖動洗滌次。,在洗液二中搖動洗滌。,在洗液三中搖動洗滌。繼續(xù)立即進(jìn)行芯片的檢測步驟,避免芯片干燥。基因芯片的檢測和掃描芯片的檢測室溫下,首先將雜交芯片與在搖動下孵育。將芯片浸入充滿水的錐形管中簡要沖洗。室溫下,將雜交芯片與在搖動下孵育。將芯片放入裝有的錐形管中,室溫中在搖動下洗滌。上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文重復(fù)步驟兩次。室溫下,將雜交芯片與在搖動下孵育。將芯片浸入充滿水的錐形管中簡單沖洗。再將芯片放入裝有的錐形管中,室溫中在搖動下洗滌。重復(fù)步驟兩次。室溫下,將雜交芯片與“在搖動下孵育。將芯片浸入充滿水的錐形管中簡要沖洗。再將芯片放入裝有的錐形管中,室溫中在搖動下洗滌。重復(fù)步驟兩次。將芯片浸入充滿水的錐形管中簡要沖洗將芯片放入錐形管中,離心,使芯片干燥。準(zhǔn)備基因芯片掃描?；蛐酒膱D像掃描打開基因芯片激光共聚焦掃描儀主機(jī)。打開軟件,并連接主機(jī),預(yù)熱激光管。將基因芯片插入掃描器中。設(shè)定并調(diào)整激光器波長、刪、掃描區(qū)域、掃描象素等參數(shù),以獲得最佳的信噪比。圖像掃描。完成熒光信號數(shù)據(jù)的采集和輸出。土鎏簍三匿型丕蘭堡主堂堡堡塞生物信息學(xué)表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析商用主要應(yīng)用工具軟件完成表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析。具體包括數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化所有基因點(diǎn)的熒光信號強(qiáng)度均預(yù)先去除背景信號,然后以每張芯片信號中位數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化,即位于芯片的基因點(diǎn)的相對熒光強(qiáng)度基因點(diǎn)在芯片的熒光信號強(qiáng)度/在第張芯片上所有基因熒光信號強(qiáng)度的中位數(shù)。聚類分析采用相關(guān)。分析正常對照與患者組間比較使用/過程,并整合經(jīng)典的倍差異分析和方法。分析流程見結(jié)果部分圖表達(dá)譜數(shù)據(jù)的驗(yàn)證實(shí)時熒光定量轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證表達(dá)譜數(shù)據(jù)獨(dú)立驗(yàn)證了/,兩個基因在病人中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)/比較了和正常對照的表達(dá),比較了和正常對照的表達(dá)。引物、探針序列如下一一一一一一一一一一一土造蔓三匿型盔堂堂主雯堡鎏塞反應(yīng)體系在熒光定量儀上進(jìn)行,。,分鐘,分鐘然后個循環(huán),秒一,秒一,秒。熒光定量儀采集待測基因及內(nèi)參照擴(kuò)增各循環(huán)熒光信號,軟件完成。軟件分析其值,并計算。兩獨(dú)立樣本檢驗(yàn)由化學(xué)發(fā)光,驗(yàn)證/的蛋白質(zhì)表達(dá)抽提外周血白細(xì)胞用于芯片檢測后,繼續(xù)用鹽酸胍一乙醇抽提蛋白質(zhì)按說明書操作,溶解,經(jīng)超聲振蕩后/蛋白定量。加入等體積上樣緩沖液,煮沸分鐘,電泳。經(jīng)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上。羊血清封閉小時,加入兔抗/多抗,和兔抗人多抗作為內(nèi)參照。孵育小時。充分洗滌分鐘次,羊抗兔二抗,。孵育小時。充分洗滌分鐘次。至暗室中時混合的等體積化學(xué)發(fā)光試劑液和液,反應(yīng)分鐘后棄去,膠片曝光一秒,沖洗顯影。結(jié)果的基因表達(dá)譜分析結(jié)果基于基因表達(dá)譜的病人的聚類圖和基于臨床免疫表型的病人的聚類圖結(jié)果均顯示相同病人重復(fù)檢測,盡管經(jīng)過治療上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文病情獲得部分緩解,仍聚于一類遺傳背景相同的同胞對亦被聚于一類即/,和分別被聚在一起。而以皮膚黏膜損害、漿膜炎為主要表現(xiàn),內(nèi)臟受累較輕的患者、被聚在表達(dá)譜/或表型譜的一端特殊類型的以淋巴增殖為主要表現(xiàn)的狼瘡樣綜合征患者和有胃腸道血管炎表現(xiàn)的患者被聚在另一端居于中間的患者多有血液系統(tǒng)及狼瘡性腎炎等內(nèi)臟受累臨床資料見表?；虮磉_(dá)譜和臨床免疫表型聚類之間顯示了一定的一致性。換言之,的臨床免疫表型和基因表達(dá)譜之間存在某種關(guān)聯(lián)。圈回圖基于基因表達(dá)譜的病人的聚類?；谂R床免疫表型的病人的聚類。例病人編號/,/,其中,和分別為與經(jīng)治療后再次基因芯片檢測,為一例以淋巴增殖為主要表現(xiàn)的狼瘡樣綜合征和為同胞對。為正常對照。臨床免疫表型和基因表達(dá)譜聚類之間存在一定的關(guān)聯(lián)。銷二茹然占墼匿型態(tài)堂整圭堂照堡塞圖一張患者寡核替酸基因芯片。點(diǎn),表達(dá)譜信號匿圖寡核苷酸基因芯片實(shí)驗(yàn)重復(fù)性穩(wěn)閼采源靜蕊融合成探針與張芯片雜交鞠關(guān)系數(shù)鐋,毽仍有,豹基因鼗示倍以上的差異。上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文相關(guān)顯著性差異表達(dá)基因分析全部點(diǎn)均視作獨(dú)立基因數(shù)據(jù)處理,最后獲得的差異表達(dá)基因列表的有效性應(yīng)滿足以下基本條件空白對照點(diǎn)不應(yīng)出現(xiàn),陰性對照點(diǎn)不應(yīng)出現(xiàn),看家基因?qū)φ拯c(diǎn)不應(yīng)出現(xiàn),復(fù)點(diǎn)基因應(yīng)同時出現(xiàn)或同時不出現(xiàn)。,因/不具備代表性不含與正常對照芯片各基因點(diǎn)點(diǎn)/芯片經(jīng)每張芯片的信號中位數(shù)校正后用/過程組間比較,然后分別經(jīng)經(jīng)典的倍差異分析和方法軟件提供,獲得非冗余的個相關(guān)顯著性差異表達(dá)基因分析流程見圖,且滿足上述有效性基本條件個基因列表見表。圖表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析流程圖/倍差異表達(dá)和方法分析結(jié)果基本一致,即前一方法的點(diǎn)均包含于后一方法獲得的點(diǎn),而點(diǎn)中有個基因在芯片上足復(fù)點(diǎn)。整合重復(fù)基因后得到個非冗余基因。占婆箋三蜃型丕堂堡主里堡堡塞奏量星堅匡堂過盟星董堂蕉墨室鯊蕉旦注釋號通用名相對表達(dá)水平上述個基因?yàn)檎φ战y(tǒng)計顯著性,且較正常對照表達(dá)上調(diào)或下調(diào)倍以上的基因。為重復(fù)出現(xiàn)次基因,其值取次均數(shù)的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)的驗(yàn)證結(jié)果較大樣本獨(dú)立驗(yàn)證了/,兩個基因在病人中的轉(zhuǎn)錄表達(dá),結(jié)果顯示/在中較正常對照襲達(dá)上調(diào)在中亦較正常對照表達(dá)上調(diào)見圖。土鎏墨三堡型丕堂型主堂望篁圣圖表達(dá)譜數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)錄水平的獨(dú)立驗(yàn)證。熒光實(shí)時定量驗(yàn)證了/在中較正常對照表達(dá)上調(diào)在中亦較正常對照表達(dá)上調(diào)。負(fù)值越高表示該基因拷貝數(shù)越高。顯示/蛋白水平在較正常人表達(dá)增加。有趣的是在家系中,同胞對,的/表達(dá)上調(diào),未發(fā)病的正常姐妹,的/也有不同程度的增加。父母雙方該蛋白表達(dá)與正常人類似圖。圖,化學(xué)發(fā)光檢測中/蛋白質(zhì)表達(dá)。左分子量,考馬斯亮藍(lán)染色,中較正常人/表達(dá)增加。右在家系中,同胞對,的/表達(dá)上調(diào),正常姐妹,的/也有不同程度的增加。父母雙方/表達(dá)與正常人類似。正常對照一家系同胞父母。討論技術(shù)平臺的建立與評估技術(shù)為全局性的研究基因表達(dá)調(diào)控提供了高通量的工具,并土塑萋三匡型丕掌整主室堡婆塞較大程度上避免了研究上的主觀性偏差【。因是非組織特異性的系統(tǒng)性自身免疫病,故本研究采用了含有大量免疫效應(yīng)細(xì)胞的外周血細(xì)胞作為表達(dá)譜研究的材料。實(shí)驗(yàn)室的大規(guī)模芯片數(shù)據(jù)總結(jié)表明【“,外周血細(xì)胞的基因表達(dá)譜與相一致,疾病外周血細(xì)胞的表達(dá)譜特征能夠和正常人群區(qū)分開來盡管正常人群中表達(dá)譜也存在變異為我們的研究提供了可行性方面的佐證。本研究建立了基于寡核苷酸芯片基因表達(dá)譜分析的技術(shù)平臺包括探針合成、雜交一芯片掃描一大規(guī)模表達(dá)譜數(shù)據(jù)分析一表達(dá)譜數(shù)據(jù)在轉(zhuǎn)錄和蛋白水平的驗(yàn)證。寡核苷酸芯片使用端序列特異性基因片段作為靶基因,含量一致,退火溫度恒定,探針用單色熒光標(biāo)記,不存在雙色標(biāo)記效率差異等問題,特異性優(yōu)于芯片。重復(fù)性預(yù)試驗(yàn)表明,相同來源的總合成探針與張芯片雜交相關(guān)系數(shù)可達(dá),但仍有的基因顯示倍以上的差異圖。因此,除嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件和加強(qiáng)驗(yàn)證工作外,增加樣本和必要的統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)是保證芯片數(shù)據(jù)可靠性的必要條件。在分析中我們引入了基于過程的檢驗(yàn)并聯(lián)合采用了經(jīng)典的倍差異篩選方法,并與方法對照,結(jié)果基本一致。值得一提的是,經(jīng)典的倍差異篩選方法的可靠性已經(jīng)受到質(zhì)疑【,我們并未摒棄該方法,但在分析和討論中結(jié)合了必要的統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)指標(biāo),以使結(jié)果更有說服力。上述方法獲得了非冗余的個相關(guān)顯著性差異表達(dá)基因。用熒光定量較大樣本對其中/,兩個基因進(jìn)行了獨(dú)立驗(yàn)證/更在蛋白質(zhì)水平驗(yàn)證了其在中的高表達(dá)。初步證實(shí)了上述方法獲得的表達(dá)譜數(shù)據(jù)的有效性。但是,嚴(yán)格的尺度固然減少了假陽性的結(jié)果,勢必同時增加了假陰性。從基因表達(dá)調(diào)控全局考慮,我們獲得的陽性結(jié)果可能是免疫調(diào)控通路“瀑布”式反應(yīng)下游的放大效應(yīng),而啟動自身免疫的關(guān)鍵性上游基因可能未被篩出。我們相應(yīng)的對策是從較為堅實(shí)的立足點(diǎn)出發(fā),“順藤摸瓜”式的推演可能的免疫調(diào)控通路而避免過多假陽性結(jié)果的誤導(dǎo)。上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文圖以淋巴增殖為主要表現(xiàn)的病人的基因表達(dá)顯示細(xì)胞凋亡活躍。上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文的表達(dá)譜和臨床免疫表型聚類分析及個案研究應(yīng)用基因表達(dá)譜對疾病亞型進(jìn)行分類的嘗試僅見于白血病和淋巴瘤的相關(guān)研究。素以臨床表現(xiàn)多樣性著稱,本研究初步提示外周血白細(xì)胞的基因表達(dá)譜的聚類與臨床免疫表型存在某種關(guān)聯(lián)。而前者可能是后者的分子基礎(chǔ)。由于樣本較小,遠(yuǎn)不能覆蓋臨床免疫表型的多樣性,因此探討通過基因表達(dá)譜特征進(jìn)行分子水平的疾病分類乃至診斷和鑒別診斷還為時尚早但作為一種嘗試,仍提示了未來風(fēng)濕病學(xué)可能的發(fā)展方向。對以淋巴增殖為主要表現(xiàn)的狼瘡樣綜合征的臨床和基因表達(dá)譜的個案分析,即為我們提供了有益的資料積累患者,女性,歲,全身淋巴結(jié)腫大年,并有肝脾腫大及肺內(nèi)多發(fā)結(jié)節(jié)影圖。年前出現(xiàn)面部蝶形紅斑,查,抗抗體,。先后次淋巴結(jié)活檢均提示“非特異性炎癥”,不支持病,血管性免疫母細(xì)胞性淋巴腺病病程長且呈良性經(jīng)過,可排除淋巴瘤免疫蛋白電泳無單株免疫球蛋白,不支持有關(guān)漿細(xì)胞病流式細(xì)胞儀細(xì)胞亞群無雙陰性細(xì)胞增多,不支持自身免疫性淋巴增殖綜合征】,】。在先天發(fā)病的狼瘡樣綜合征動物模型中/與品系就是以淋巴增殖為主要表現(xiàn),現(xiàn)已明確上述模型分別存在和基因的缺陷?；颊呤欠翊嬖?,或其他凋亡相關(guān)基因的表達(dá)異常表達(dá)譜分析結(jié)果顯示患者的凋亡基因表達(dá)活躍圖,包括/,等一系列加速細(xì)胞凋亡的基因均上調(diào)表達(dá),進(jìn)一步排除了類似凋亡基因缺陷綜合征的診斷。復(fù)習(xí)文獻(xiàn)僅有一例患者被確定存在突變”】,多數(shù)報道均提示人類不同于/和模型,即人類的淋巴細(xì)胞凋亡呈加速狀態(tài),并推測人類的自身免疫與凋亡導(dǎo)致大量核抗原暴露和遞呈有關(guān)”。該患者表達(dá)譜表達(dá)上調(diào)基因中已知與相關(guān)、或免疫相關(guān)的基因還包括,占塑蔓三匡型丕堂堡主蘭堡婆塞一一,等,下調(diào)基因有,一,等。在例中顯著性差異表達(dá)的,在本例中亦有升高。總之,結(jié)合該患者的臨床免疫表型和基因表達(dá)譜,該患者可能為的一種特殊類型,值得進(jìn)一步隨訪并積累類似病例,進(jìn)行深入研究。有趣的是位于類分子區(qū)域可能與凋亡產(chǎn)物的清除有關(guān)的基因博】在該患者呈下調(diào)。但是其凋亡亢進(jìn)究竟為始動因素還是繼發(fā)性改變,在個案中尚難以確定。相關(guān)的顯著性差異表達(dá)基因和免疫調(diào)控通路差異表達(dá)基因的聚類分析大致上顯示了三組相關(guān)基因誘導(dǎo)表達(dá)基因圖,急性時相反應(yīng)相關(guān)基因,下調(diào)基因。聚于一類的相關(guān)基因包括一組誘導(dǎo)表達(dá)蛋白、。其中,即一一主要是由型誘導(dǎo)表達(dá),目前認(rèn)為其主要功能為抗病毒作用,并已有在患者血清中檢出該酶的報道】。型和型均可誘導(dǎo)表達(dá)、。有作者在對的小鼠模型基因芯片表達(dá)譜研究中發(fā)現(xiàn)。,誘導(dǎo)表達(dá)的可能是易感基因,并認(rèn)為有希望成為治療的候選藥物靶點(diǎn)。對人、和小鼠基因的序列比對未發(fā)現(xiàn)同源性,我們認(rèn)為更審慎的結(jié)論是家族特別是型及其免疫調(diào)控通路可能在發(fā)病中扮演重要角色,我們表達(dá)譜數(shù)據(jù)篩選到的個基因中,和均顯示上調(diào)趨勢,表達(dá)水平分別為,也存在上調(diào)趨勢,值。等【發(fā)現(xiàn)。病人血清可以誘導(dǎo)正常的單核細(xì)胞使之分化為樹突狀細(xì)胞,而在血清中發(fā)揮作用的正是,加入抗抗體可以使誘導(dǎo)作用消失。被誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞可捕獲凋亡細(xì)胞和核小體,行使抗原遞呈作用,最終導(dǎo)致免疫耐受的打破和自身免疫的發(fā)生。而抗/抗核小體的抗原抗體復(fù)合物本身又是強(qiáng)有力的誘導(dǎo)物,上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文從而構(gòu)成了一個以抗原遞呈細(xì)胞一一核抗原為軸心的相互作用的反饋環(huán)路。我們獲得的其他與相關(guān)的差異表達(dá)基因還包括,它也具有干擾素刺激反應(yīng)元件。該基因通常不表達(dá)。于外周血成熟的淋巴細(xì)胞表面,而可以作為淋巴細(xì)胞增生活化的標(biāo)志【。一調(diào)節(jié)的核因子在中表達(dá)上調(diào),可能在調(diào)控通路中發(fā)揮協(xié)同作用。已知在可以協(xié)同,使單核細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為樹突狀細(xì)胞的作用得到強(qiáng)化【。是一組參與胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子,及相互作用因子,上調(diào),可能也間接參與了通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控。晚近等【】發(fā)表了外周血表達(dá)譜的同類工作,同樣發(fā)現(xiàn)存在通路的異常亦有,等基因的上調(diào)。但是與該文研究對象主要為重型不同,我們的例主要為初發(fā)、輕中度活動、無終末臟器功能障礙的患者雖然樣本相對較少,但似更具代表性、更少醫(yī)源性干預(yù)因素的影響而在此情況下,兩個跨人種的獨(dú)立研究均指向通路的結(jié)果,更說明該通路在發(fā)病機(jī)制中的普遍性。圖個相關(guān)的顯著性差異表達(dá)基因的聚類分析,亮化顯示的起孬覆菜于一類的誘導(dǎo)表達(dá)的基因。土鎏釜三匡型盔堂搜主室堡婆墨我們還得到乳鐵蛋白,基質(zhì)金屬蛋白酶,粘附分子等基因在表達(dá)上調(diào),提示非特異的急性時相炎癥反應(yīng)的存在。同樣高表達(dá)的急性時,可能是重要的相反應(yīng)調(diào)節(jié)因子/調(diào)控環(huán)節(jié),分析/證實(shí)上述三個基因和其他多種急性時相反應(yīng)分子均有/的順式作用元件,可受到/的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。一可直接誘導(dǎo)的表達(dá),一又是已知的可能與相關(guān)的淋巴細(xì)胞增生活化的刺激因子我們的結(jié)果在中表達(dá)為,/在類細(xì)胞中的表達(dá)占優(yōu),與/同源的/則直接受到的調(diào)控,/和/之間、/和及等其他轉(zhuǎn)錄因子均存在相互作用【,因此/可能在免疫調(diào)控通路上發(fā)揮一定的作用。本研究中初發(fā)未用藥物的/仍呈高表達(dá),而家系中/蛋白表達(dá)除在例同胞中增高外,另例未發(fā)病姐妹無激素使用史也存在增高,初步排除了/在中的高表達(dá)是由糖皮質(zhì)激素引起的可能性【】。而/在家系中的表達(dá),又進(jìn)一步提示/并非發(fā)病的充分條件。急性時相反應(yīng)蛋白對外來抗原及抗原抗體復(fù)合物的清除起到重要作用,已經(jīng)證實(shí)急性時相反應(yīng)蛋白血清淀粉樣蛋白在自身核抗原的加工和清除中有重要意義,的缺陷可能導(dǎo)致對自身核抗原的免疫耐受喪失【。/與的關(guān)系尚不清楚,但分析顯示無/的調(diào)控元件。不除外如下可能/介導(dǎo)的急性時相反應(yīng)向不利于或類似物表達(dá)的方向偏移,增加了機(jī)體自身核抗原的負(fù)荷,形成另一個自身抗原清除障礙的反饋環(huán)路。上述假說只有在對相關(guān)候選靶分子在蛋白質(zhì)水平的相互作用和免疫調(diào)控通路的研究得到細(xì)化后,才有可能得到闡明?？傊?通過對的基因表達(dá)譜研究,初步揭示了臨床免疫表型與表達(dá)譜特征存在關(guān)聯(lián)篩選了顯著性差異表達(dá)的相關(guān)基因,在此基礎(chǔ)上勾畫了及其相關(guān)的免疫調(diào)控通路在可能扮演重要角色,為進(jìn)一步闡明的免疫調(diào)上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文控機(jī)制和尋找藥物作用靶點(diǎn)打下了基礎(chǔ)。上浸箋三蜃型丕堂型主堂焦查塞第二部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡相關(guān)基因的蛋白質(zhì)相互作用前言已有證據(jù)表明,干擾素,家族特別是型及其免疫調(diào)控通路可能在發(fā)病中扮演重要角色【?！俊Ｔ诘谝徊糠盅芯恐?我們用寡核苷酸芯片篩選到一批誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)基因,其中為首次報道的相關(guān)候選基因,但其功能未明。本部分研究試圖進(jìn)一步證實(shí)該基因在轉(zhuǎn)錄水平的高表達(dá),并運(yùn)用蛋白組學(xué)的策略研究蛋白質(zhì)水平的相互作用,以揭示其可能的功能。蛋白質(zhì)相互作用已經(jīng)成為晚近蛋白組學(xué)的研究熱點(diǎn)。新的研究策略大體是,將目的蛋白克隆表達(dá)并利用上游表位純化標(biāo)簽,捕獲相互作用的蛋白復(fù)合體,如等應(yīng)用串聯(lián)親和純化策略,用以純化并鑒定酵母蛋白質(zhì)復(fù)合物見示意圖等】則用進(jìn)行了類似的研究均繞開了二維凝膠電泳和酵母雙雜交等經(jīng)典而復(fù)雜的方法,宜接通過生物質(zhì)譜技術(shù)鑒定相互作用的蛋白質(zhì),甚至發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)?；|(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時間質(zhì)譜和電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜具有高分辨率和高質(zhì)量精度的特點(diǎn),可以滿足蛋白質(zhì)相互作用研究的技術(shù)需要,已成為蛋白組學(xué)重要的工具。圖串聯(lián)親和純化的蛋白質(zhì)相互作用研究策略示意圖,上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文我們采用上述研究策略,對既往用于研究已知蛋白質(zhì)之間相互作用的拉下方法【】進(jìn)行了改良,用以發(fā)現(xiàn)未知的作用蛋白。試驗(yàn)材料和方法材料,表達(dá)宿主菌質(zhì)粒,感受態(tài)克隆宿主菌菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存表實(shí)驗(yàn)主要儀器儀器名稱型號生產(chǎn)廠家超低溫冰箱公司制冰機(jī)同上旋渦混合器型江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器大容量恒溫振型江蘇太倉實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠高速離心機(jī)“一公司公司公司穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳,型北京六儀器廠垂直電泳儀公司凝膠成象系統(tǒng)刖精密恒溫儀北京冷翠技術(shù)開發(fā)有限公超聲細(xì)胞粉碎一寧波新芝科器研究所酸度計公司超純水儀,超濾器電子天平上海天平儀器廠紫外分光光度型,熱循環(huán)儀公司冷庫公司水平搖床通達(dá)科技超凈工作臺北京半導(dǎo)體設(shè)備一廠上海第二醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文表實(shí)驗(yàn)主要試劑盒生產(chǎn)廠家試劑名稱,同上逆轉(zhuǎn)錄試劑盒公司多聚酶內(nèi)切酶,內(nèi)切酶同上同上連接酶同上快速純化/回收試劑盒北京鼎國生物試劑公司瓊脂糖凝膠回收試劑盒,公司還原型谷胱甘肽分子量的蛋白質(zhì)濃縮管公司,上海生工生物工程有限公司分裝,上海生工生物工程有限公分裝考馬斯亮藍(lán)一,北京鼎國生物技術(shù)有限公司考馬斯亮蘭上海化學(xué)試劑公司分裝巰基乙醇,公司葡萄糖