016食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 016    前  012食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌的鑒定。012相比,主要變化如下:增加了雙歧桿菌的計(jì)數(shù)方法;增加了修改了標(biāo)準(zhǔn)的適用范圍;修改了附錄0161    食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌檢驗(yàn)1 范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了雙歧桿菌(鑒定及計(jì)數(shù)方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于雙歧桿菌純菌菌種的鑒定及計(jì)數(shù)。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中僅含有單一雙歧桿菌的菌種鑒定。本標(biāo)準(zhǔn)適用于食品中僅含有雙歧桿菌屬的計(jì)數(shù),即食品中可包含一個(gè)或多個(gè)不同的雙歧桿菌菌種。2 設(shè)備和材料除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:溫培養(yǎng)箱:361。箱:25。平:菌試管:1880500菌吸管:110微量移液器(200L1000L)及配套吸頭。菌培養(yǎng)皿:直徑90 歧桿菌培養(yǎng)基:醇:分析純。氯甲烷:分析純。酸:分析純。乙酸:分析純。酸:分析純。4 檢驗(yàn)程序雙歧桿菌的檢驗(yàn)程序見(jiàn)圖1。0162    圖1 雙歧桿菌的檢驗(yàn)程序5 菌要求全部操作過(guò)程均應(yīng)遵循無(wú)菌操作程序。0163    品處理:半固體或液體菌種直接接種在雙歧桿菌瓊脂平板或體菌種或真空冷凍干燥菌種,可先加適量滅菌生理鹽水或其他適宜稀釋液,溶解菌粉。種:接種于雙歧桿菌瓊脂平板或61厭氧培養(yǎng)48h2h,可延長(zhǎng)至72h2h。品處理:8000r/0000r/用拍擊式均質(zhì)器拍打1成110的樣品勻液。冷凍樣品可先使其在25條件下解凍,時(shí)間不超過(guò)18h;也可在溫度不超過(guò)45的條件解凍,時(shí)間不超過(guò)15種或涂布:將上述樣品勻液接種在雙歧桿菌瓊脂平板或61厭氧培養(yǎng)48h2h,可延長(zhǎng)至72h2h。培養(yǎng):挑取3個(gè)或以上的單個(gè)菌落接種于雙歧桿菌瓊脂平板或61厭氧培養(yǎng)48h2h,可延長(zhǎng)至72h2h。片鏡檢:挑取雙歧桿菌平板或歧桿菌為革蘭氏染色陽(yáng)性,呈短桿狀、纖細(xì)桿狀或球形,可形成各種分支或分叉等多形態(tài),不抗酸,無(wú)芽孢,無(wú)動(dòng)力?；b定:挑取雙歧桿菌平板或行生化反應(yīng)檢測(cè)。過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)為陰性。雙歧桿菌的主要生化反應(yīng)見(jiàn)表1。可選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)。表1 雙歧桿菌菌種主要生化反應(yīng)編號(hào)項(xiàng)目?jī)善珉p歧桿菌(兒雙歧桿菌(雙歧桿菌(春雙歧桿菌(物雙歧桿菌(雙歧桿菌(+3d+4+d+7+80164    表1(續(xù))編號(hào)項(xiàng)目?jī)善珉p歧桿菌(兒雙歧桿菌(雙歧桿菌(春雙歧桿菌(物雙歧桿菌(雙歧桿菌(14甘露醇8苦杏仁甙(扁桃甙)+醇)-+-+23+24+25+26糖)根粉)+30淀粉原)+33葡萄糖酸鈉表示90%以上菌株陽(yáng)性;上菌株陰性;89%以上菌株陽(yáng)性;機(jī)酸測(cè)定:測(cè)定雙歧桿菌的有機(jī)酸代謝產(chǎn)物(可選項(xiàng)),見(jiàn)附錄B。體和半固體樣品的制備:000r/0000r/拍擊式均質(zhì)器拍打1成1100的樣品勻液。0165    體樣品的制備:勻,制成110的樣品勻液。品處理:8000r/0000r/用拍擊式均質(zhì)器拍打1成110的樣品勻液。冷凍樣品可先使其在25條件下解凍,時(shí)間不超過(guò)18h;也可在溫度不超過(guò)45的條件解凍,時(shí)間不超過(guò)15 系列稀釋及培養(yǎng)用1備10倍系列稀釋樣品勻液,于8000r/0000r/用拍擊式均質(zhì)器拍打1遞增稀釋一次,即換用1次1據(jù)對(duì)樣品濃度的估計(jì),選擇2個(gè)3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液,在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí),個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí),時(shí)將150雙歧桿菌瓊脂培養(yǎng)基或放置于461恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿,并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。從樣品稀釋到平板傾注要求在15瓊脂凝固后,將平板翻轉(zhuǎn),361厭氧培養(yǎng)48h2h,可延長(zhǎng)至72h2h。培養(yǎng)后計(jì)數(shù)平板上的所有菌落數(shù)。用肉眼觀察,必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器,記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位(示。取菌落數(shù)在3000蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30于300個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí),則不宜采用,而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù);若片狀菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均勻,即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2,代表一個(gè)平板菌落數(shù)。平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí),則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi),計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值,再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù),作為每克或每毫升中菌落總數(shù)結(jié)果。有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí),按式(1)計(jì)算:N=C(d(1)式中:N樣品中菌落數(shù);C平板(含適宜范圍菌落數(shù)的平板)菌落數(shù)之和;第一稀釋度(低稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù);第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))平板個(gè)數(shù);d稀釋因子(第一稀釋度)。所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),0166    記錄為多不可計(jì),結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(zhǎng),則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在3000中一部分小于30以最接近30 落數(shù)小于100“四舍五入”原則修約,以整數(shù)報(bào)告。落數(shù)大于或等于1003位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數(shù)字,后面用0代替位數(shù);也可用10的指數(shù)形式來(lái)表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數(shù)字。重取樣以積取樣以告雙歧桿菌屬的種名。告單位以g(示。0167    附 錄 分蛋白胨                                         胱氨酸鹽溶液的配制:半胱氨酸全部溶解,配制成半胱氨酸鹽溶液。紅柿浸出液的制備:將新鮮的西紅柿洗凈后稱重切碎,加等量的蒸餾水在100水浴中加熱,攪拌90后用紗布過(guò)濾,浸出液分裝后,121高壓滅菌150法:熱溶解,然后加入半胱氨酸鹽溶液,裝后121高壓滅菌150分蛋白胨                          溶液的配制:0168    蒸餾水至1000化血紅素溶液(5mg/配制:蒸餾水至10021高壓滅菌150生素濾除菌,避光冷藏保存。法:除氯化血紅素溶液和維生素其余成分加入蒸餾水中,加熱溶解,入中性紅溶液。分裝后121高壓滅菌150用時(shí)加熱熔化瓊脂,加入氯化血紅素溶液和維生素至50使用。分蛋白胨                                      熱溶解,裝后121高壓滅菌1500169    附 錄 歧桿菌培養(yǎng)液制備挑取雙歧桿菌瓊脂平板或時(shí)用未接種菌的氧,361培養(yǎng)48h。酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:勻,進(jìn)行標(biāo)定,的乙酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)定方法為:酞指示液2滴,將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。 乙酸使用液:。酸標(biāo)準(zhǔn)溶液:勻,進(jìn)行標(biāo)定,的乳酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。標(biāo)定方法為:入1沸5入酚酞指示液2滴,將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。 乳酸使用液:。酸溶液(體積分?jǐn)?shù)),混勻,勻后加過(guò)量氯化鈉,劇烈振搖1搖13000r/上清液轉(zhuǎn)入另一試管中,并有機(jī)相,于40水浴中用氮?dú)獯抵帘M干,用20的磷酸二氫鈉溶液(乙腈(99+1)勻后備用。同樣操作步驟處理乙酸標(biāo)準(zhǔn)和空白培養(yǎng)液。00水浴10體積分?jǐn)?shù))硫酸溶液,混勻,58搖3000r/三氯甲烷層分析。同樣操作步驟處理乳酸標(biāo)準(zhǔn)和空白培養(yǎng)液。相色譜條件色譜柱:50m)或其他等效色譜柱;流動(dòng)相:20的磷酸二氫鈉溶液(乙腈(99+1),等度洗脫,流速1mL/溫箱:35