畢業(yè)論文（設(shè)計(jì)）題目酶促法制備茶黃素工藝初步研究指導(dǎo)老師專(zhuān)業(yè)班級(jí)生物技術(shù)及應(yīng)用0701姓名學(xué)號(hào)2010年5月30日I摘要研究利用綠茶鮮葉漿及梨汁為酶源，采用體外氧化中酶促法來(lái)制備茶黃素。方法采摘新鮮茶葉，陰涼干燥處攤放12H，18以下冰柜冷凍6H，組織搗碎機(jī)粉碎勻漿，添加新鮮梨汁，并檸檬酸調(diào)PH值至47；茶多酚40G，加入乙酸乙酯溶解。將上述兩部分液體，迅速混勻，加入發(fā)酵罐中，溫度25，PH值47，通入空氣流量06L/MIN，高速攪拌，發(fā)酵60MIN。再進(jìn)一步分離兩相，制備得到茶黃素。結(jié)論經(jīng)過(guò)液相檢測(cè)，本文酶促法制備茶黃素工藝可以制得茶黃素，茶黃素主要在乙酸乙酯相中，含量686。關(guān)鍵詞茶黃素；茶多酚；體外氧化；酶源；發(fā)酵A1A0A2A3A4A5A6A0A7A8A10A11A9A13II目錄引言11材料211實(shí)驗(yàn)材料212實(shí)驗(yàn)試G2070213實(shí)驗(yàn)G1214G313222方法221實(shí)驗(yàn)方法3211酶源制備3212G5225G10301處G107143213發(fā)酵G708酶促G2465G5224G7093214茶黃素G14807G24743215茶黃素G13443化422檢測(cè)方法43結(jié)G7536G994分G75245G22G17G20檢測(cè)結(jié)G75365G22G17G20G17G20茶黃素G4557G10043G2709G3282G16901G24G22G17G20G17G21酶促發(fā)酵茶黃素G8999度檢測(cè)G24G23G5647結(jié)G994G16764論G25G2454G13783文G104988A12A14A15A16A17A18A19A14A20A21A22A23A24A25A261A27引言茶G7171源G1122G6117G3281，G17953G5079G1002G11040G11352G7092G18214G12946G20290料G1055一，G20290茶G4557G1166體G7389G1457G1593G1328用，G457本G14621G13446G11458G458中G4613G7389茶葉G14659用G2163G14033G11352G16772G17745。G10628G1207G12197G4410研究G1075G15932G7138，茶葉G7171G1593G5259G20290G2709，含G7389茶多酚G451G2666G2869G11909G451茶多G12970G451茶G8700酸G451茶G14406素G12573G10995G10301G8975G5627G10301G17148，G1867G7389G6245G14752G451G6251G11161G8614G451G19462G11296G6251G11296G12573多G12193G1457G1593G2163G140331。茶G14406素G4658G8712溶G5627G14406素，分為茶黃素G451茶G13430素G2656茶G16100素G989G12879。G1866中茶G14406素中G2265含G11352茶黃素THEAFLAVINS,TFS，G10628G1207研究G15932G7138，茶黃素G993G1177G7171G13430茶G11352G18337要G2709G17148G6116分G1055一，G13792G1000G1867G7389G6245G14752G451G6251G11161G8614G451G6251氧化G451G6251G15940G13781G451G6251G12373G2476G451G6251G11296G19462G11296G451G19489G15892G12970G451G19489G15892G14038G451G19462G8847G5527G15892G12661G11154G11161G12573G2163G6940，并G1000G17836G4557G14418G9375G11161G8614G17882G17728G5417酶G2656多G12193DNAG13870合酶G7389特異G5627G6245制G1328用。自ROBERTSEAH1957年發(fā)G10628茶黃素以來(lái)，茶黃素一直G7171茶葉研究G11352熱點(diǎn)。茶黃素G738912G12193組分，G1866中茶黃素TF，茶黃素3沒(méi)食子酸酯TF2A，茶黃素3沒(méi)食子酸酯TF2BG2656茶黃素3,3雙沒(méi)食子酸酯TFDG，G71714G12193最主要G11352茶黃素。茶黃素G11352獨(dú)特G10995G10714G8975G5627使G1866G10995產(chǎn)G2656研究受到G3281內(nèi)外G11352廣泛關(guān)注，隨著G1166們G4557茶黃素結(jié)構(gòu)G2656G5627G17148G11352認(rèn)識(shí)越來(lái)越深入，制G2474茶黃素G11352方法研究G1075G2474得了很大G11352進(jìn)展，但由G1122G13430茶茶湯中茶黃素含量低02202，使茶黃素G11352利用受到很大限制，因此，G1166們G993斷探索新G11352茶黃素制備途徑，G13792兒茶素體外模擬氧化，被G1328為一條研究茶黃素形G6116機(jī)G10714及提高G1866制率行G1055G7389G6940G11352方法。本文以新鮮茶葉為原料，并利用梨中所含G11352多酚氧化酶，酶促法體外氧化3制備茶黃素，著力尋求酶促法制備茶黃素G11352方法，G7171為更高G6940G451更綠G14406G451更節(jié)G14033G11352途徑。G11458前市場(chǎng)G7171直接購(gòu)買(mǎi)酶源來(lái)發(fā)酵G10995產(chǎn)，G6116本提高，綜合利用資源率G19489低。因此研究利用綠茶鮮葉汁做為酶源，適宜G2454數(shù)條件下，添加到干茶提G2474液中，發(fā)酵G10995產(chǎn)茶黃素4。如該項(xiàng)技術(shù)獲得G6116G2163，將意義G18337大G451前景廣泛。A12A14A15A16A17A18A19A14A20A21A22A23A24A25A262A271材料11實(shí)驗(yàn)材料新鮮茶葉G7081芽23葉，產(chǎn)G1122浙江杭州G709；梨G708購(gòu)G1122華聯(lián)超市G709；茶多酚G708浙江紹興東靈G1457G1593食G2709G7389限公司提供，TP98G70912實(shí)驗(yàn)試劑檸檬酸，乙酸乙酯，冰醋酸分G7524G13443食用乙醇乙腈G14406G16901G13443蒸餾G8712由G13443G8712G3132ULTRAPUREPLUS制得AB8大孔吸附樹(shù)G1403813實(shí)驗(yàn)儀器組織搗碎機(jī)G708878B上海正慧工貿(mào)G7389限公司G709電子天平G708JY10001上海華巖G1214G3132公司G709分G7524天平G708AR2140上海力衡G1214G3132G1214G15932G7389限公司G709低溫箱G708HF135U40G6116都市G10995G12197G1214G3132G7389限責(zé)任公司G709冷凍離G5527機(jī)G708SIGMA3K15上海基匯G10995G10301G12197技G7389限公司G709發(fā)酵罐G708SFV10L職G1006技術(shù)G4410G19510G10995G10301實(shí)驗(yàn)G4472G4462做G709超G3780G8886發(fā)G10995G1214G708KQ500DB上海G7982G4462分G7524G1214G3132G7389限公司G709G7071G17728蒸發(fā)G1214G708RE52AA上海G1134G14647G10995化G1214G3132G2390G709冷凍干燥G1214G708ALPHA12LDG8839G2347G1816G5363G1214G3132G16786備G7389限公司G709高G6940液相G708DIONEXG6152G4445中G3281G7389限公司G7092方法利用綠茶鮮葉漿及梨汁為酶源，采用體外氧化中酶促法來(lái)制備茶黃素G11352G6984A12A14A15A16A17A18A19A14A20A21A22A23A24A25A263A27體G6817G1328G17347G13459流G12255如下G328221所G12046。G3282G21G17G20酶促法制備茶黃素G6817G1328流G12255G328221制備方法211酶源制備58酶源G2265G6336來(lái)自茶葉G11352多酚氧化酶G2656來(lái)自梨G11352多酚氧化酶，酶源制備如下新鮮茶葉1000G，G3546放G13634陰涼干燥處12H，在18以下低溫箱G18336冷凍6H，G2474G1998冰凍G11352茶鮮葉，用組織搗碎機(jī)將G1866粉碎勻漿，所得茶漿液冷G15267備用；提供G17287G3827G11352梨，采用G13449G2011方G5347，要搗碎G1817分，勻G17148并冷凍離G5527，G2474上G4630G9177液，所得梨汁冷G15267備用；將G6365上述方法制備所得G11352茶漿液中添加梨汁至2000ML，并用檸檬酸溶液調(diào)節(jié)此混合液PH值至47，酶源制備G4448G6116。212底物處理G12228G2474茶多酚40G放入大G9915G7491中，G9994G2530再加入乙酸乙酯溶解至1000ML，G5465用。213發(fā)酵（酶促反應(yīng)）9將上述酶源G2656G5225G10301，迅速混勻，G16025入10L發(fā)酵罐體中，G6523制溫度25，PH值47G11352條件下，通入空氣流量為06L/MIN，高速攪拌，G6357G13505發(fā)酵60MIN。214茶黃素萃取發(fā)酵結(jié)G7475G2530，G1584G8502通入空氣，G12239G1998發(fā)酵液，G17728入分液G9443G7019中，G19757G13634分G4630，A28A29A30A31A32A33A34A35A36A37A38A39A40A41A32A33A42A43A44A45A44A46A47A48A37A44A45A44A46A49A50A51A30A52A3225A53A54PH47A5460MINA37A55A56A32A57A49A58A59A37A60A49A61A58A59A32AB8A37A62A63A64A65A48A49A66A67A68A69A70A71A72A73A74A69A75A76A32A77A78A37A794A80G12239G1998乙酸乙酯相備用；G8712相G2029迅速G2331溫至80，G1457G635730MIN，G6289G9400得G9400液，G9400G9207加入2000MLG8844G8712超G3780G8886G70880G709G8712G9032G9036提15MIN，G6289G9400，合并G9400液，70G11507空G8999G13565至原體G12227G113521/3，G12573G5465進(jìn)一步處G10714。215茶黃素純化乙酸乙酯相低溫G11507空G8999G13565，G6393發(fā)G1998G2447乙酸乙酯，加入70乙醇溶解G11507空G8999G13565，G17226G17220G2447乙酸乙酯，G8999G13565液冷凍干燥，干燥G7691G2709進(jìn)行HPLC檢測(cè)。G8712相G8999G13565液，AB8樹(shù)G14038分離。G1820用2G5214G4630G11352體G12227蒸餾G8712G19512G2447多G12970及G7446G10301；再用25乙醇2G1505G5214G4630體G12227G8939G14085G6922G19610G12544一餾分；最G2530用70乙醇15G1505G5214G4630體G12227G8939G14085G6922G19610G12544G1120餾分。G2520餾分70G11507空G8999G13565，G8999G13565液G11507空干燥，干燥G7691G2709進(jìn)行HPLC檢測(cè)。22檢測(cè)方法1G709G2345體G7643G7691G18209制分G2047G1946G11842G12228G2474TF124000MGG451TF2A32500MGG451TF2B13500MGG451TFDG46000MG，G1393G8437加入10MLG4493量G10954中，分G2047G18209G6116G8999度為T(mén)F10240MG/MLG451TF2A0325MG/MLG451TF2B0135MG/MLG451TFDG0460MG/MLG11352溶液為G7643G1946G2709溶液。2G709G7691液G18209制G1946G11842G12228G2474G19668要檢測(cè)G11352G10301G，用蒸餾G8712G4462溶至25ML，G18209制G61162MG/MLG11352G7691液，溶液過(guò)G5506孔G9400G14192，G12573G5465進(jìn)G19036。3G709HPLC檢測(cè)方法G14406G16901G7621G4719G8953VPODSG7085UM，250MMG10446MMG709；流G2172相A相05冰醋酸3乙腈G8712B相05冰醋酸30乙腈G8712；G7621溫28；流速1ML/MIN；檢測(cè)G8886G19283280NM；檢測(cè)G7114G1940060MIN。液相G7811度G8939G14085條件TIME0B0TIME5001B0TIME45B100TIME60B0TIME50B100TIME0STOP4G709茶黃素含量G16757G12651100A81A82A83A81A84A85A86A87A88A84A85A89A86A87A88A90G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16G16公G5347G708G21G17G20G709A68A69A70A71A72A73A74A69A75A76A32A77A78A37A795A803結(jié)果與分析31檢測(cè)結(jié)果311茶黃素的對(duì)照品圖譜G6365G1004322檢測(cè)方法，分G7524檢測(cè)茶黃素G2345體G4557G10043G2709，檢測(cè)HPLCG3282G16901G328231所G12046G3282G22G17G20茶黃素G23G12193G2345體G4557G10043G2709G43G51G47G38檢測(cè)G3282G16901由G3282G22G17G20G993G19602發(fā)G10628，G23G12193茶黃素G2345體G4557G10043G2709G1998G4804G7114G19400G1393G8437為30005G45142697G45153102G45157027MIN，G16826G13466G11352G7691G2709G8999度G994G4557G5224G1998G4804G12227分G19766G12227如G1593231所G12046。表31茶黃素單體對(duì)照品進(jìn)樣濃度及對(duì)應(yīng)峰面積G2345體G1457G11053G7114G19400G53G55G4804G19766G12227G68G85G72G68進(jìn)G7691G8999度G80G/G80LTF1G220G1700G24G230G2400G24G200G17G21G230TF2AG23G21G17G2597G23G23G24G21G24G2380G17G22G21G24TF2BG24G22G17G200G21G2007G20G20G2000G17G20G22G24TFDGG247G170G217G258G237G22700G17G23G250312酶促發(fā)酵茶黃素濃度檢測(cè)結(jié)果將G6365G10043G21G17G20G6817G1328方法制備茶黃素溶液冷凍干燥，獲得茶黃素粉末G7691G2709G6365G1004322G6817G1328方法進(jìn)行HPLC檢測(cè)，檢測(cè)茶黃素G8999度含量如G1593232。A68A69A70A71A72A73A74A69A75A76A32A77A78A37A796A80表32酶促法制備所得茶黃素樣品HPLC檢測(cè)結(jié)果G7691G2709檢測(cè)G10301G17148G1457G11053G7114G19400G7691G2709G4804G19766G12227G4557G10043G2709G4804G19766G12227G4557G10043G2709G8999度G7691G2709G8999度茶黃素G5647G8999度G8712相25G8939G14085TF130532080094050051024000123300387TF2A432117586744525480325001284TF2B53586773810711100135000854TFDG57787402868473700460000497G8712相70G8939G14085TF130746532884050051024000387100804TF2A436427165544525480325001983TF2B541711031210711100135001390TFDG585011835568473700460000795乙酸乙酯相TF130388689024050051024000514901372TF2A430653251144525480325003887TF2B534120898710711100135002634TFDG576430575968473700460002054結(jié)合G1593232檢測(cè)結(jié)G7536，通過(guò)公G5347G70821G709G16757G12651可得茶黃素G11352含量分G2047G717125G8939G14085，194；70G8939G14085，202；乙酸乙酯相，686。由此可以發(fā)G10628茶黃素主要G19610中在乙酸乙酯相，這G1075G7171下一步想著G18337研究G11352關(guān)鍵環(huán)節(jié)。4總結(jié)與討論通過(guò)酶促法制備茶黃素工藝進(jìn)行試驗(yàn)，制得了茶黃素，說(shuō)G7138酶促法制備茶黃素這一工藝G7171可行G11352。檢測(cè)結(jié)G7536G15932G7138制備得到G11352茶黃素主要G19610中乙酸乙酯相中，含量可達(dá)686。G6984套酶促法制備茶黃素G11352工藝雖G9994只得了茶黃素，但G7171相G4557來(lái)說(shuō)，G1866含量G17836G7171較低，G17836G19668繼G13505研究調(diào)G6984G7389關(guān)G2454數(shù)，提高茶多酚向茶黃素G11352G17728G2476率，這G4613G7389G5465進(jìn)一步G11352研究下G2447。G10628G1207化G4410G451G10995G10301G4410G2656醫(yī)G4410實(shí)驗(yàn)提高技術(shù)G2656深入研究發(fā)G10628G993同G11352茶黃素G1867G7389G993同G11352化G4410結(jié)構(gòu)，鑒G1122綠茶中兒茶素G12879化合G10301G11352許多G10995G10301G8975G5627G10301G17148主要源G1122它們酚羥基結(jié)構(gòu)G11352G6251氧化G8975G5627；從化G4410結(jié)構(gòu)上看，茶黃素G12879G10301G17148含G7389較多G11352酚羥基團(tuán)，A68A69A70A71A72A73A74A69A75A76A32A77A78A37A797A80因此，茶黃素G12879G10301G17148相比兒茶素G12879可G14033G7389更強(qiáng)G11352G10995G10301G8975G562710。茶黃素制備方法G11458前G7389化G4410氧化G2656酶促氧化兩G12193，前者G993符合G10995態(tài)G1457護(hù)G11352要求，副產(chǎn)G2709復(fù)G7446，產(chǎn)G2709G13443度較低，G13792G2530者解決了上述問(wèn)題并G14033提高茶黃素G11352得率，因此今G2530酶促氧化法G7171制備茶黃素G11352G10714想方法。雖G9994本文中以綠茶鮮葉漿及梨汁做為酶源，采用體外氧化中酶促法來(lái)制備茶黃素G11352方法，制得G11352茶黃素G11352量G993大，但G7171從G19283久來(lái)看酶促法制備茶黃素今G2530必將G2656G4462向固G4462化酶技術(shù)G12573G6116為研究熱點(diǎn)，另外，利用G5506G10995G10301G4462向發(fā)酵產(chǎn)G10995茶黃素G1075將G7171G10995產(chǎn)茶黃素G11352趨勢(shì)。茶黃素G11352G13443化以SEPHADEXLH20G7621G4630G7524法G2656高