1、（6） 表達(dá)型質(zhì)粒載體主要用來(lái)使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。主要用來(lái)使外源基因表達(dá)出蛋白質(zhì)產(chǎn)物。如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆如果在大腸桿菌里表達(dá)，必須把所克隆的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)的真核生物的基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄錄翻譯信號(hào)控制之下。翻譯信號(hào)控制之下。注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始注意啟動(dòng)子的性質(zhì)，終止子、起始密碼、終止密碼的閱讀正確。密碼、終止密碼的閱讀正確。復(fù)制起始點(diǎn)ORI、 選擇標(biāo)記、 多克隆位點(diǎn)MCS2）大腸桿菌操縱子元件阻遏基因 I 操縱基因O 啟動(dòng)基因P 核糖體結(jié)合位點(diǎn)序列（SD） 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)區(qū)。1）普通載體元件 表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)大腸桿菌乳糖操縱子的調(diào)控操縱子與操縱子

2、模型 操縱子學(xué)說(shuō)/操縱子模型： F.Jacob J.Mond（1960）E.coli lac operon( 1965諾貝爾醫(yī)學(xué)生理學(xué)獎(jiǎng)) 操縱子：核酸分子上調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄活性的基本單元，由結(jié)構(gòu)基因、操作子（O）和啟動(dòng)子（P）組成。 轉(zhuǎn)錄、翻譯、合成蛋白 結(jié)合調(diào)節(jié)蛋白 結(jié)合RNA聚合酶 promoter structural genes operator啟動(dòng)基因 操縱基因 結(jié)構(gòu)基因操縱子操縱子(operon)(operon)模型模型調(diào)控（節(jié)）蛋白 操縱子RNARPO structural genesDNAProtein調(diào)控蛋白的作用機(jī)制注：注：R R：Regulator PRegulator P

3、：Promoter OPromoter O：OperatorOperator 正調(diào)控系統(tǒng)中的正調(diào)控蛋白又被稱為無(wú)輔基誘導(dǎo)蛋白（正調(diào)控系統(tǒng)中的正調(diào)控蛋白又被稱為無(wú)輔基誘導(dǎo)蛋白（apoinducer)apoinducer) 負(fù)調(diào)控系統(tǒng)中的負(fù)調(diào)控蛋白又被稱為阻遏蛋白（負(fù)調(diào)控系統(tǒng)中的負(fù)調(diào)控蛋白又被稱為阻遏蛋白（repressor)repressor)(四四)經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體1. pSC101第一個(gè)成功地用于克隆實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。（1）類型天然質(zhì)粒，屬低拷貝型。（2）長(zhǎng)度9.09 kb。（3）選擇標(biāo)記四環(huán)素抗性Tetr6個(gè)克隆位點(diǎn)： EcoR I、Xho I、Pvu I

4、、Hind III、BamH I、Sal I 主要使用EcoR I。（其中（其中Hind III、BamH I、Sal I 3個(gè)位個(gè)位于選擇標(biāo)記于選擇標(biāo)記Tetr的內(nèi)部）的內(nèi)部）（4 4）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)2. ColE1（1）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長(zhǎng)度6.3 kb。（3）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（colicin）E1對(duì)E1免疫的基因（immE1）特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞1000-30001000-3000拷貝拷貝之多！之多！ colicin E1基因的結(jié)構(gòu)ceaim

5、mkil結(jié)構(gòu)基因免疫基因溶菌基因 殺死不含有ColE1細(xì)菌的原因cea + kil基因產(chǎn)物 不被其他細(xì)菌的colicin E1所殺死的原因imm基因EcoR I位于E1內(nèi)部，插入外源DNA會(huì)導(dǎo)致E1失活，使受體菌不能合成E1（ColE1- -），但仍然表現(xiàn)出對(duì)E1免疫型（ImmE1+ +）。EcoR I（4 4）克隆位點(diǎn)）克隆位點(diǎn)Colicin E1外源DNA無(wú)Colicin3. pBR322：F. Bolivar和和R.L. Rodriguez人工構(gòu)建載體。人工構(gòu)建載體。 “P”表示是一種質(zhì)粒表示是一種質(zhì)粒(plasmid)； “BR”表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一表示兩位主要構(gòu)建者姓氏的頭一

6、個(gè)個(gè) 字母字母“F.Bilivar和和R.L.Rodriguez”; “322”表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。表示實(shí)驗(yàn)編號(hào)。pSP2124質(zhì)粒的Ampr基因（1）元件來(lái)源 復(fù)制起點(diǎn) oripMB1系列（來(lái)源于ColE1）的高拷貝高拷貝型復(fù)制起點(diǎn) Ampr基因 Tetr基因pSC101的Tetr 基因。（2）長(zhǎng)度4361bp（3）選擇標(biāo)記氨芐青霉素和四環(huán)素抗性。（4）克隆位點(diǎn)其中其中9個(gè)會(huì)導(dǎo)致個(gè)會(huì)導(dǎo)致Tetr基因失活（如基因失活（如BamH I、Hind 、Sal I）；）； 3個(gè)會(huì)導(dǎo)致個(gè)會(huì)導(dǎo)致Ampr基因失活（基因失活（Sca I、PvuI、Pst I）。）。24個(gè)克隆位點(diǎn)。（5）pBR322的優(yōu)點(diǎn) 雙抗菌素

7、抗性選擇標(biāo)記 插入失活，分兩次先后選擇：沒(méi)有獲得載體的寄主細(xì)胞 在Amp或Tet中都死亡。獲得載體的寄主細(xì)胞 在Amp或Tet其中之一中死亡。外源基因BamH IAmp中存活但在Tet中死亡外源基因Pst ITet中存活但在Amp中死亡每個(gè)細(xì)胞可達(dá)10003000copy 安全失去了轉(zhuǎn)移蛋白基因mob（mobilization）。不能通過(guò)接合轉(zhuǎn)移。 高拷貝數(shù) 分子小，克隆能力大載體越小越好。載體越小越好。 10kb的的DNA在純化過(guò)程中容易斷裂。在純化過(guò)程中容易斷裂。保留了轉(zhuǎn)移蛋白（保留了轉(zhuǎn)移蛋白（mobmob）的作用位點(diǎn)。）的作用位點(diǎn)。（6 6）pBR322pBR322的缺點(diǎn)的缺點(diǎn)能夠被能夠

8、被ColKColK質(zhì)粒編碼的質(zhì)粒編碼的mobmob蛋白識(shí)別，蛋白識(shí)別，如果再有如果再有F F質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！質(zhì)粒的參與，就有可能轉(zhuǎn)移！ 刪除mobmob識(shí)別位點(diǎn)（如質(zhì)粒pBR327、pAT153等）。pAT153：從從pBR322pBR322上切去上切去HaeIIHaeII片斷，既除去片斷，既除去了了mobmob識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝識(shí)別位點(diǎn)，又增加質(zhì)粒的拷貝數(shù)。數(shù)。（7）PBR322的改進(jìn)pBR325：在在pBR322pBR322位點(diǎn)上接入一段來(lái)自噬菌體位點(diǎn)上接入一段來(lái)自噬菌體PICmPICm的的HaeIIHaeII酶切片斷（帶酶切片斷（帶有氯霉素抗性基因有氯霉素抗性基因cml

9、cmlr r）。）。 cmlcmlr r上也帶一個(gè)上也帶一個(gè)EcoRIEcoRI位點(diǎn)。位點(diǎn)。使EcoRI 也成為插入失活型位點(diǎn)。 改造EcoR I 位點(diǎn)4. pUC系列University of California的的J. Messing和和J. Vieria于于1978年，在年，在pBR322的基礎(chǔ)上改造的基礎(chǔ)上改造而成。屬正選擇載體。而成。屬正選擇載體。pUC7、pUC8、pUC9、pUC10、pUC11、pUC18、pUC19 復(fù)制起點(diǎn)pBR322的 ori但其上失去了克隆位點(diǎn)。但其上失去了克隆位點(diǎn)。 Ampr 基因（1）元件來(lái)源 lacZ的啟動(dòng)子大腸桿菌 lacZ基因大腸桿菌lacZ

10、的 -肽鏈序列， 是LacZ 的氨基端片斷。pBR322的Ampr基因（2）長(zhǎng)度約2.7kb（3）克隆位點(diǎn)10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于lacZ基因的5端。叫5-溴-4-氯-3-吲哚-B-D-半乳糖苷promoter structural genes operator啟動(dòng)基因 操縱基因 結(jié)構(gòu)基因操縱子操縱子(operon)(operon)模型模型調(diào)控（節(jié)）蛋白 操縱子RNARPO structural genesDNAProtein調(diào)控蛋白的作用機(jī)制注：注：R R：Regulator PRegulator P：Promoter OPromoter O：OperatorOperator 正調(diào)

11、控系統(tǒng)中的正調(diào)控蛋白又被稱為無(wú)輔基誘導(dǎo)蛋白（正調(diào)控系統(tǒng)中的正調(diào)控蛋白又被稱為無(wú)輔基誘導(dǎo)蛋白（apoinducer)apoinducer) 負(fù)調(diào)控系統(tǒng)中的負(fù)調(diào)控蛋白又被稱為阻遏蛋白（負(fù)調(diào)控系統(tǒng)中的負(fù)調(diào)控蛋白又被稱為阻遏蛋白（repressor)repressor)2. ColE1（1）類型天然質(zhì)粒，屬高拷貝型。（2）長(zhǎng)度6.3 kb。（3）選擇標(biāo)記大腸桿菌素（colicin）E1對(duì)E1免疫的基因（immE1）特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌特點(diǎn)是在培養(yǎng)基中加入氯霉素抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每蛋白質(zhì)合成后，質(zhì)粒仍然能復(fù)制達(dá)到每個(gè)細(xì)胞個(gè)細(xì)胞1000-30001000-3000拷貝拷貝之多！之多?。?