1、細胞污染及處理方法總結潔凈區(qū)，并不是沒有細菌，而是細菌的數(shù)量非常少， 國家標準100級的潔凈標準是浮游 菌數(shù)不得超過5個每立方米，沉降菌數(shù)不得超過 1個每培養(yǎng)皿.而國外的標準比我國的還要 高一點，要求的數(shù)量更少。所以在我們的潔凈操作臺里，并不是真正一個細菌都沒有的，所以在操作的時候還是要盡量利索迅速地完成操作。盡量減少進入培養(yǎng)體系細菌的數(shù)量。所以處理細菌污染的重要原則就是：無限地稀釋細菌的濃度，無限地減少細菌的數(shù)量！一、細菌污染培養(yǎng)基: 顏色發(fā)紅，液體清亮或渾濁；顯微鏡下：有黑點或桿狀物在到處游走，細胞部分脫落，出現(xiàn)細胞碎片;成像：圖一：桿菌污染圖二：白色鏈球菌以下是摘自丁香園的處理方法：1)

2、 .將污染的培養(yǎng)液倒掉，轉燒瓶口，加入 10mlPBS適當晃動清洗培養(yǎng)瓶，然 后倒掉。轉燒瓶口。2) .繼續(xù)加入10mlPBS同樣方法晃動，清洗培養(yǎng)瓶，然后倒掉。3) .繼續(xù)加入5mlPBS同樣方法洗瓶，主要是培養(yǎng)面，然后倒掉。4) .重復步驟3再洗。5) .重復步驟3再洗。6) .加入3-5ml雙抗，洗瓶,靜置3-5分鐘，然后吸出。7) .加入3ml雙抗，洗瓶，靜置3-5分鐘，然后吸出。8) .再加入5mlPBS光瓶，然后吸出。9) .加入10ml培養(yǎng)液，加入2ml雙抗，放置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5小時之后，倒掉培 養(yǎng)基，加入PBSfe瓶兩次，然后加入胰酶消化，吹打后置于離心機800-1000r/mi

3、n 離心，然后洗一次。置于新的培養(yǎng)瓶里培養(yǎng)，培養(yǎng)體系加入 2ml雙抗。10) .24h之后，視情況換液，若仍然污染嚴重，培養(yǎng)基渾濁，重復以上步驟， 若看不到污染物，則繼續(xù)步驟1)、3)、4)、6)、8),然后加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)體系加入2ml雙抗.11) .24h之后，若仍污染嚴重，可再重復一次，若還污染只能棄之（不過一般 沒有出現(xiàn)這種情況），若鏡下不見污染物，則換液PBS洗瓶，正常培養(yǎng)。（常見為金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）若細胞狀態(tài)極差，盡早處理掉細胞，并找出污染源，對培養(yǎng)箱，生物安全柜，細 胞房進行消毒處理。真菌污染培養(yǎng)基: 有的培養(yǎng)液清亮，不變色；顯微鏡下：有絲狀物，有些真菌開始很像死細胞

4、碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細胞碎片分不清，慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。真菌生長的比較慢，不象細菌那么容易被發(fā)現(xiàn)，但是一旦發(fā)現(xiàn)有它的存在細胞就被污染了，也很難救活了。成像：圖三：看上去像白色念珠菌污染處理方法：若為霉菌或者真菌污染，加入兩性霉素B清洗和培養(yǎng)，終濃度一般為 2.5g/ml（在30 g/ml時會有細胞毒性）。另外也可以選擇在培養(yǎng)基里加3ug/ml的制霉菌素或放線菌素D。其它操作同細菌。三、霉菌污染培養(yǎng)基: 培養(yǎng)液是清亮的；顯微鏡下：絮狀雜質，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物， 可看到明顯的菌絲，細胞仍可生長, 但時間長之后，細胞的活力狀態(tài)變差；成像：處理方法：預防

5、霉菌污染，可在培養(yǎng)基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗；（原來我們這里也有霉菌感染的，不過后面在培養(yǎng)基里加上了0.5 %的大?？担ㄔ瓉淼碾p抗各改為0.25%的青霉素和鏈霉素）摘自丁香園），效果還可以！你可以試試！ ！ ！但 細胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素D或雙抗都于事無補，建議舍棄該污染細胞。，將環(huán)境徹底消毒，如果所有細胞都污染，可能是系統(tǒng)污染，檢查一下培養(yǎng)基和器材， 如果只是個別污染，可能是操作問題，就要注意操作。霉菌污染多來自空氣，所以做實驗時說話聊天，或瓶口敞開時間太長，還有培養(yǎng)箱開關頻繁是 主要原因 還是多找自身原因.四、支原體污染支原體污染后，不會立即使

6、細胞死亡，可以與細胞長期共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生渾濁， 細胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺， 實則細胞收到多方面潛在影響， 如引起細胞變形， 影 響DNA合成，抑制細胞生長等。培養(yǎng)基: 可能無明顯表現(xiàn)；顯微鏡下：慢慢會使細胞狀態(tài)變差，生長變慢，在顯微鏡下觀察可能會有小黑點，但培養(yǎng)基一般不發(fā)生 渾濁。細胞傳代以后就出現(xiàn)細胞間黑點，細胞空泡化，很多類似凋亡、壞死的 細胞，最終細胞漂浮，完全死亡。細胞生長緩慢，或者出現(xiàn)無明顯誘因脫落，凋亡，細胞碎 片增多，有的甚至只表現(xiàn)為細胞狀態(tài)日漸不佳。成像：處理方法：采用支原體清除劑，有同學說用泰樂處理支原體污染效果比較好。用泰樂菌素，獸用支原體病的藥，但可用于

7、細胞培養(yǎng)，無任何不良反應。Sigma公司的使用時用 50ug/mlTylosin培養(yǎng)液培養(yǎng)6天或連續(xù)傳兩代即可清除支原體污染。 如果作為常用的抗生素的話 ，建 議用8ug/ml的濃度。一般處理起來比較復雜，因此多放棄細胞重新培養(yǎng)。五、黑膠蟲污染培養(yǎng)基：可能無明顯表現(xiàn)，或液體顏色異樣顯微鏡下：大量黑點原地震動，與細菌污染相鑒別，細胞狀態(tài)不佳。有的因細胞密度較高，或細胞增殖較快，細胞代謝產物增多，要注意鑒別。成像：處理方法：黑膠蟲在科研領域還是很未知的啊。所以沒有什么好的應對方法。預防為主！ ！ 還是要強調無菌操作??！ ！尤其注意血清的質量！這個是主要來源。一般建議用北美血清， 這個黑膠蟲污染會概

8、率小。六、原蟲污染培養(yǎng)基: 培養(yǎng)液可輕微渾濁顯微鏡下：細小的點狀物數(shù)量非常多， 輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢， 而且細胞狀態(tài)不好， 邊緣不清楚，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養(yǎng)。這 種共生是非常普遍的， 但他們的數(shù)量小，細胞占優(yōu)勢所以不會影響到細胞的正常生長，只有當他們到達一定的數(shù)量時就會影響到細胞的生長，最終形成惡性循環(huán)。成像：處理方法：在操作的過程中，一定要小心操作動作，輕柔緩慢，切忌大動作魯莽。防止細胞脫落。這個 拯救細胞還是主要針對無路可退的時候。污染還是重在預防！ ！ ！ ！ ！細胞房培養(yǎng)箱每兩周更換一次水（高壓過的雙蒸水），條件允許的每兩周可以用酒精擦洗一遍培養(yǎng)箱；地面每兩到三天用新潔爾滅拖洗