1、第一節(jié) 化妝品原料的微生物檢驗化妝品原料種類很多, 性能各異, 根據(jù)其性能和用途, 大體上可分為基質(zhì)原料和添加劑 (輔助原料 ?；|(zhì)原料是組成化妝品的主體或在該化妝品內(nèi)起主要功能的物質(zhì),主要包括 油脂、蠟類、粉類、膠質(zhì)類、表面活性劑、防腐劑、抗氧化劑等。添加劑是賦予色、香及其 他特定作用的物質(zhì), 大多為天然的含有營養(yǎng)成分或生物活性的物質(zhì), 這些成分又是微生物生 長繁殖的良好營養(yǎng)源, 在一定程度上成為微生物的培養(yǎng)基, 因此, 檢驗原料中的微生物很重 要。一、指標菌及特定菌的選擇一般原料的微生物指標菌同化妝品成品即:菌落總數(shù)、糞大腸菌群、綠膿桿菌、金黃色 葡萄球菌、 霉菌和酵母菌。 粉類原料大多數(shù)

2、是由土壤礦物質(zhì)加工而成, 而土壤受微生物污染 嚴重。 據(jù)資料報道, 土壤中的致病菌有需氧的炭疽桿菌和厭氧的破傷風(fēng)桿菌、 產(chǎn)氣莢膜桿菌 等,其檢出率很高,產(chǎn)氣莢膜桿菌幾乎達 100%,惡性水腫桿菌 64%,破傷風(fēng)桿菌 29%,肉 毒桿菌 6%。這些致病菌能在土壤中生存較長時間,例如炭疽桿菌的芽孢能生存 15年之久; 腸道致病菌可生存 100170d ;結(jié)核桿菌能生存 1年左右;破傷風(fēng)桿菌芽孢和產(chǎn)氣莢膜桿菌 也能長期在土壤中生存。在滑石粉、高嶺土、碳酸鈣等粉類原料中,經(jīng)常檢出枯草桿菌、真 菌等, 因此,在粉類原料中可增加需氧芽孢桿菌、 產(chǎn)氣莢膜桿菌和破傷風(fēng)桿菌指標。在某些 生物性原料如動物內(nèi)臟及其

3、提取物等可增加沙門氏菌指標。二、樣品的預(yù)處理根據(jù)原料性質(zhì)的不同, 選用相應(yīng)的預(yù)處理方法, 如油質(zhì)類原料可按油性或疏水性 (油包 水化妝品處理,粉類原料按粉劑化妝品樣品處理等。三、檢驗方法各種微生物的檢驗方法均與化妝品成品檢驗方法相同, 可參見 化妝品衛(wèi)生規(guī)范 中微 生物檢驗方法。 原料與成品微生物檢驗方法最根本的不同點是檢驗原料所用的稀釋液和培養(yǎng) 基中都不含有中和劑(卵磷脂和吐溫 -80 。如檢驗菌落總數(shù)用普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,綠膿桿 菌增菌培養(yǎng)液可用普通肉湯,金黃色葡萄球菌增菌培養(yǎng)液用含 7.5%氯化鈉肉湯,稀釋液均 用生理鹽水。四、培養(yǎng)基(1營養(yǎng)瓊脂成分:蛋白胨 20g瓊脂 1520g牛肉膏

4、 5g氯化鈉 5g蒸餾水 1000mL制法:將上述成分混合后,加熱溶解,調(diào) PH 值為 7.47.6,121、 20min 高壓滅菌, 儲存于冷暗處備用。(2 7.5%氯化鈉肉湯成分:肉湯 100mL氯化鈉 7.5g制法:將上述兩種成分混合均勻,分裝, 115、 20min 高壓滅菌。第二節(jié) 化妝品生產(chǎn)用水的微生物檢驗方法水在化妝品的生產(chǎn)中用量極大, 是化妝品的主要成分之一, 水的品質(zhì)對化妝品的質(zhì)量有 著重大影響?；瘖y品生產(chǎn)用水的處理一般采用過濾吸附法、電滲析法、 離子交換法等, 對生 產(chǎn)用水的微生物檢測指標有菌落總數(shù)、糞大腸菌群、霉菌和酵母菌、金黃色葡萄球菌、 綠膿 桿菌。一、菌落總數(shù)菌落總

5、數(shù)是指水樣在一定條件下(營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基, 37 ,24h 需氧培養(yǎng)后 1mL 水樣 中所含菌落數(shù)。檢驗方法介紹如下。(1 以無菌操作滅菌吸管吸取 1mL 充分混勻的水樣, 加到滅菌的平皿內(nèi), 注入約 15mL 已融化并冷卻到 45左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,并立即旋轉(zhuǎn)平皿,使水樣與培養(yǎng)充分混勻。 每次檢驗時應(yīng)做一平行接種,同時另用一個平皿只傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基作為空白對照。 (2待冷卻凝固后,翻轉(zhuǎn)平皿,使其底面朝上,置于(36±1培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 24h, 進 行菌落計數(shù),即為 1mL 水樣中的菌落總數(shù),以(CFU/mL報告結(jié)果。二、糞大腸菌群糞大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出的,是指一群在 4

6、4.5培養(yǎng) 24h 能發(fā)酵乳糖產(chǎn) 酸產(chǎn)氣、 需氧和兼性厭氧的革蘭氏陰性無芽孢桿菌。 糞大腸菌群數(shù)的高低, 表明了糞便污染 程度, 也反映了對人體健康潛在危害性的大小, 是評價化妝品生產(chǎn)用水衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標 之一。 因生產(chǎn)用水的潔凈度較高, 可采用濾膜法檢測, 即將水樣通過孔徑為 0.45m 的濾膜 過濾,細菌被阻留在膜上,將濾膜貼在 MFC 培養(yǎng)基上, 44.5培養(yǎng)后,計數(shù)典型菌落。 MFC 培養(yǎng)基成分:胰胨 10g膽鹽 3號(Bile salt No.3或混合膽鹽 1.5g多胨 5g酵母浸膏 3g瓊脂 15g氯化鈉 5g苯胺藍 0.2g乳糖 12.5g蒸餾水 1000mL配制方法:在 10

7、00mL 蒸餾水中先加入玫紅酸 (10g/L 的氫氧化鈉溶液 c(NaOH=0.2mol/L10mL, 混勻后, 取 500mL 加入瓊脂煮沸溶解, 于另外 500mL 蒸餾水中, 加入除苯胺藍以外的其他試 劑, 加熱溶解, 倒入已溶解的瓊脂, 混勻調(diào)節(jié) PH 值為 7.4, 加入苯胺藍煮沸, 迅速離開熱源, 待冷卻至 60左右, 制成平板, 不可高壓滅菌。制好的培養(yǎng)基應(yīng)存放于 210環(huán)境下,不 超過 96h 。EC 培養(yǎng)基成分:胰蛋白胨 20g磷酸氫二鉀 4g乳糖 5g磷酸二氫鉀 1.5g膽鹽 3號(Bile salt No.3或混合膽鹽 1.5g氯化鈉 5g蒸餾水 1000mL配制方法將上

8、述成分溶解于蒸餾水中, 115高壓滅菌 20min, 冷卻至 60左右時, 傾注平皿, 備 用。檢驗方法:(1濾膜和濾器的滅菌 將濾膜放入燒杯中,加入蒸餾水,置于沸水浴中煮沸滅菌 3次,每次 15min, 前兩次煮沸后需更換水洗滌 23次,以除去殘留溶劑;濾器可用點燃的酒 精棉球火焰滅菌,也可用高壓滅菌。(2 水樣過濾 用無菌鑷子夾取滅菌濾膜的邊緣,貼放在濾床上,固定好濾器, 100mL 水樣,在負 0.5atm(1atm=101.325kPa下抽濾。(3將濾膜截留細菌面朝上,貼放在 MFC 培養(yǎng)基上(中間不得有氣泡 ,將平皿倒置于 44.5培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24h 。糞大腸菌群菌落為藍色,非糞大

9、腸菌群菌落為灰色至奶油色。(4將可疑菌落接種于 EC 培養(yǎng)基上, 44.5培養(yǎng) 24h, 如產(chǎn)氣則證實為糞大腸菌群。(5結(jié)果計算糞大腸菌群數(shù) (CFU/100mL =(經(jīng)證實糞大腸菌群菌落數(shù)×100 /過濾的水樣體積 (mL 三、霉菌和酵母菌霉菌和酵母菌廣泛分布于自然界中, 也可存在于水中, 可引起化妝品變質(zhì)發(fā)霉, 有些霉 菌還可產(chǎn)生有毒毒素,所以控制生產(chǎn)用水中的霉菌和酵母菌極為重要。在固體培養(yǎng)基上, 霉菌呈放射狀生長, 孢子有各種顏色; 酵母菌在培養(yǎng)基表面多呈圓形 凸起, 邊緣整齊, 表面光滑濕潤, 在培養(yǎng)基深部生長的酵母菌多呈鐵餅形、 三角形或多角形, 在虎紅培養(yǎng)基上呈粉紅色。檢

10、驗方法:(1吸取 1mL 水樣、 1/10稀釋水樣各 1mL, 分別注入滅菌平皿中,每個稀釋度各用 2個 平皿, 注入融化并冷卻至 45的虎紅培養(yǎng)基, 充分搖勻, 凝固后倒置于 28培養(yǎng)箱培養(yǎng) 72h, 計數(shù)平板內(nèi)生長的霉菌和酵母菌數(shù),如有霉菌蔓延生長,可于 48h 時將此平板取出計數(shù)。 (2計數(shù)方法霉菌和酵母菌菌落數(shù)(CFU/mL :每個稀釋度的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)四、綠膿桿菌檢驗方法(1將過濾器和濾膜滅菌備用。(2 過濾 100mL 水樣, 將截留細菌的濾膜置 90mL 肉湯培養(yǎng)基中, 置 37培養(yǎng) 1824h, 如有綠膿桿菌生長,培養(yǎng)液多呈黃綠色或藍綠色,表面有一層薄菌膜。(3

11、分離培養(yǎng)、染色鏡檢、氧化酶試驗、綠膿菌素試驗、硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗、明膠液 化試驗、 42生長試驗操作過程可見化妝品綠膿桿菌檢驗方法。(4 結(jié)果報告被檢水樣經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后, 經(jīng)證實為革蘭氏陰性桿菌, 氧化酶及綠膿菌 素試驗陽性, 即可報告被檢水樣中每 100mL 中檢出綠膿桿菌; 或綠膿菌素試驗陰性而液化明 膠、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和 42生長試驗三者皆為陽性時,也可報告被檢水樣中檢出綠膿桿菌; 反之,可報告 100mL 水樣中未檢出綠膿桿菌。五、金黃色葡萄球菌檢驗方法(1將過濾器和濾膜滅菌備用。(2過濾 100mL 待檢水樣,將截留細菌的濾膜置于 90mL 7.5% 氯化鈉肉湯培養(yǎng)基中, 置于 3

12、7培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h 。(3 用接種環(huán)挑取增菌培養(yǎng)液, 劃線接種在 Baird-Parker 氏培養(yǎng)基或血瓊脂培養(yǎng)基上, 置 37培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2448h 。(4如有典型菌落生長,可進行染色鏡檢、甘露醇發(fā)酵試驗、血漿凝固酶試驗(詳見化 妝品中金黃色葡萄球菌的檢驗方法 。(5 結(jié)果報告凡在上述選擇平板上有可疑菌落生長, 經(jīng)染色鏡檢, 證明為革蘭氏陽性葡 萄球菌, 并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸, 血漿凝固酶試驗陽性, 可報告 100mL 水樣中檢出金黃色葡萄 球菌;否則報告 100mL 水樣中未檢出金黃色葡萄球菌。第三節(jié) 生產(chǎn)車間空氣中的微生物檢測化妝品生產(chǎn)車間的空氣潔凈度直接關(guān)系到化妝品的質(zhì)量, 所以建立常

13、規(guī)的車間空氣質(zhì)量 監(jiān)測系統(tǒng),及時進行空氣凈化,可有效保證化妝品達到衛(wèi)生要求?？諝庵屑毦倲?shù)是空氣微生物污染最主要的指標菌之一, 常用的檢測方法有撞擊法采樣 檢測和自然沉降法采樣檢測。一、撞擊法采用固體撞擊式空氣微生物采樣器采樣,通過抽氣動力,使空氣高速通過狹縫或小孔, 懸浮在空氣中的帶菌粒子因慣性作用而撞擊到培養(yǎng)基平板上, 經(jīng) 37、 48h 培養(yǎng)后, 計算出 每立方米空氣中所含的細菌菌落數(shù)。所需儀器和設(shè)備有撞擊式空氣微生物采樣器及其他檢驗微生物常用設(shè)備。所用培養(yǎng)基為普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。檢測步驟(1選用對空氣中細菌捕獲率大于 95%且性能穩(wěn)定、便于消毒的撞擊式空氣采樣器。(2 選擇有代表性的位

14、置設(shè)置采樣點,將采樣器按操作說明安裝、 消毒,根據(jù)空氣污染 情況確定采樣量,進行采樣。(3采樣完畢后,將帶菌平板倒置于 37培養(yǎng)箱內(nèi) 48h, 計數(shù)菌落數(shù),根據(jù)采樣流量和 采樣時間,換算成每立方米空氣中的菌落數(shù),以(CFU/m3報告結(jié)果。二、自然沉降法自然沉降法是利用空氣微生物粒子的重力作用， 在一定時間內(nèi)將微生物粒子收集到帶有 培養(yǎng)基的平皿內(nèi)，在適宜的溫度下培養(yǎng)生長成為菌落并進行生物學(xué)觀察、計數(shù)和評價。 本方法較撞擊法經(jīng)濟簡便， 不需特殊采樣器， 但此方法的檢測結(jié)果受空氣氣流和帶菌顆 粒大小的影響較大，所收集的只是一部分較大的微生物粒子，采樣條件難以控制。 檢測步驟 （1） 根據(jù)待測空間大小

15、及通風(fēng)口的位置選擇有代表性的點采樣， 通常設(shè) 5 個或 3 個采樣 點，采樣高度為 1.21.5m,采樣點應(yīng)離墻 1m 以上，并避開空調(diào)、門窗等空氣流通處。 （2）將直徑 9cm 的營養(yǎng)瓊脂平板置于采樣點處，打開皿蓋，暴露 1030min（根據(jù)空氣 的潔凈度）后，蓋上皿蓋，翻轉(zhuǎn)平板，置于 37培養(yǎng)箱內(nèi) 48h,計數(shù)每皿的菌落數(shù)，計算出 3 平均菌落數(shù)，以（CFU/m ）報告結(jié)果。此結(jié)果不能同撞擊法結(jié)果換算。 第四節(jié) 化妝品生產(chǎn)設(shè)備及環(huán)境物體 表面微生物檢驗 一、生產(chǎn)設(shè)備的采樣 儲存罐、灌裝機、輸送管道等，用滅菌生理鹽水棉拭子，在上述設(shè)備內(nèi)側(cè)相對面各 25cm2(5cm×5cm面積范圍

16、，來回均勻涂抹，并轉(zhuǎn)動拭子，剪去手接觸部位后，將棉拭子放 入 10mL 生理鹽水試管內(nèi)振打 80 次，根據(jù)細菌的污染程度，可作適當稀釋，取 2mL 分別注 入兩塊平皿，每皿 1mL,傾注普通營養(yǎng)瓊脂，置 37培養(yǎng) 48h，進行活菌計數(shù)，計算被檢設(shè) 備表面污染細菌的數(shù)量，如檢驗機器的溝縫等處時，將機器拆卸，直接用棉拭子涂抹，涂抹 面積可因被檢物的形狀及大小而定。 2 生產(chǎn)設(shè)備表面污染細菌菌落總數(shù)（CFU/cm2）平均菌落數(shù)×稀釋度×采樣面積（cm ） ×10 凡接觸化妝品原料和半成品的設(shè)備、工具、管道必須用無毒、無害、抗腐蝕材料制作， 內(nèi)壁應(yīng)當光滑，便于清潔和消毒。所有生產(chǎn)設(shè)備、工具在使用前后應(yīng)當徹底清潔、消毒。 二、操作臺采樣 在臺面對角線高兩點（工人操作處） ，各 25 cm2 面積，用滅菌生理鹽水棉拭子，來回均 勻涂抹，并轉(zhuǎn)動拭子，剪去手接觸部位后，將棉拭子放入 10mL 生理鹽水試管內(nèi)振打 80 次， 根據(jù)細菌的污染程度，可作適當稀釋，取 2mL 分別注入兩塊平皿，每皿 1mL，傾注普通營 養(yǎng)瓊脂，置 37培養(yǎng) 48h，進行活菌計數(shù)，計算操作臺表面污染細菌的數(shù)量。 2 操作臺表面污染細菌菌落總數(shù)（CFU/cm2）平均菌落數(shù)×稀釋