1、第24卷第12期蛋白質(zhì)分離純化與層析技術(shù)進(jìn)展鮑時(shí)翔 姚汝華(華南理工大學(xué)生物工程系)摘 要 蛋白質(zhì)分離純化是蛋白質(zhì)產(chǎn)品工業(yè)化生產(chǎn)的關(guān)鍵之一。文中分析了蛋白質(zhì)分離純化的特點(diǎn),指出了分離純化蛋白質(zhì)應(yīng)解決的一些問(wèn)題。層析技術(shù)是一種有效的蛋白質(zhì)純化方法,文中從層析方法、層析固定相、層析過(guò)程的數(shù)學(xué)模擬三方面評(píng)述了層析技術(shù)的新進(jìn)展。關(guān)鍵詞 蛋白質(zhì);純化;層析;分離中圖資料分類(lèi)號(hào) TQ201 21;O658 1近20年來(lái),生物技術(shù)的發(fā)展非常迅速。運(yùn)用基因工程、蛋白質(zhì)工程、發(fā)酵工程等生物技術(shù),已能設(shè)計(jì)、制造、生產(chǎn)人們急需的多種蛋白質(zhì)。和其它生物產(chǎn)品的生產(chǎn)過(guò)程一樣,蛋白質(zhì)的生產(chǎn)過(guò)程一般也分為上、中、下游過(guò)程。上

2、、中游過(guò)程是運(yùn)用生物技術(shù)生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物,下游過(guò)程是指對(duì)含有目標(biāo)產(chǎn)物的物料進(jìn)行處理、分離、純化、加工目標(biāo)產(chǎn)物。目前,生產(chǎn)蛋白質(zhì)的上、中游技術(shù)如基因突變、基因重組與表達(dá)、基因工程菌的大規(guī)模培養(yǎng)等技術(shù)發(fā)展很快,而下游蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)卻沒(méi)有得到相應(yīng)發(fā)展。很多蛋白質(zhì)在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模已生產(chǎn)成功,但卻無(wú)法走向工業(yè)化生產(chǎn)而取得經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益1。因此,急需發(fā)展蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。1 蛋白質(zhì)分離純化的特點(diǎn)和需要解決的問(wèn)題1 1 蛋白質(zhì)分離純化的特點(diǎn)1)大多數(shù)蛋白質(zhì)產(chǎn)品是生物活性物質(zhì),在分離純化過(guò)程中,有機(jī)溶劑、溶液pH值、離子強(qiáng)度的變化均可使蛋白質(zhì)變性失活。2)蛋白質(zhì)產(chǎn)品在物料中含量很低,且物料組成非常復(fù)雜。例如

3、,利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)蛋白質(zhì),物料中含有大量組成復(fù)雜的培養(yǎng)基、菌體生產(chǎn)代謝物等,目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量常常不到蛋白質(zhì)總量的1%。有些目標(biāo)蛋白質(zhì)存在于細(xì)胞內(nèi)或在胞內(nèi)形成包含體,為獲取蛋白質(zhì),還需進(jìn)行細(xì)胞破碎,結(jié)果物料中含有大量的細(xì)胞碎片和胞內(nèi)產(chǎn)物。3)含蛋白質(zhì)產(chǎn)品的物料不穩(wěn)定,蛋白質(zhì)產(chǎn)品易受料液中蛋白水解酶降解。4)很多蛋白質(zhì)產(chǎn)品作為醫(yī)藥、食品被人類(lèi)利用,因而要求蛋白質(zhì)產(chǎn)品必須是高度純化的,產(chǎn)品無(wú)菌、無(wú)致熱源等。1 2 實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)產(chǎn)品的分離純化應(yīng)解決的問(wèn)題1)設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)產(chǎn)品分離純化的最佳工藝,用最少的分離步驟獲得最大的產(chǎn)率,同時(shí)確保來(lái)稿日期:1996 01 18鮑時(shí)翔,男,1966年生,博士后;主要

4、研究方向:蛋白質(zhì)純化工程,發(fā)酵工程。華南理工大學(xué)生物工程系,郵:第12期 鮑時(shí)翔等:蛋白質(zhì)分離純化與層析技術(shù)進(jìn)展99蛋白質(zhì)產(chǎn)品的純度。2)發(fā)展蛋白質(zhì)純度的快速分析檢測(cè)技術(shù)。在下游的各道工序,準(zhǔn)確、快速地對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行純度分析和活性檢測(cè),以保證產(chǎn)品的質(zhì)量。3)搞好上、中、下游技術(shù)的配合,便于蛋白質(zhì)產(chǎn)品的分離純化。大多數(shù)蛋白質(zhì)產(chǎn)品的分離純化,需消耗大量的人力、物力,因此應(yīng)盡可能改進(jìn)上、中游技術(shù),減少下游過(guò)程負(fù)荷。例如,利用金黃色葡萄球菌,發(fā)酵生產(chǎn)A蛋白。通常,A蛋白結(jié)合于菌體胞壁上,需要進(jìn)行細(xì)胞破碎,然后將A蛋白從胞壁上剪切下來(lái),過(guò)程繁瑣,難度大。若運(yùn)用生物技術(shù)培養(yǎng)出A蛋白分泌型菌來(lái)生產(chǎn),A蛋白

5、的分離純化就容易得多。2 層析技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化中的地位分離純化蛋白質(zhì)的方法很多2,對(duì)于不同的目標(biāo)產(chǎn)物,分離純化方法不同。選擇合適的工藝路線,取決于目標(biāo)產(chǎn)物的理化、生物特性。例如,目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)的密度不一樣,可采用離心技術(shù)加以分離;目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)在一定的溶液環(huán)境中溶解度不同,可采用沉淀技術(shù)加以分離;目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)在親水性高分子兩相溶液中分配不同,可采用雙水相萃取技術(shù)加以分離;若目標(biāo)產(chǎn)物和雜質(zhì)等電點(diǎn)不同,可采用離子交換層析和電泳技術(shù)分離。通常,為獲得高純度目標(biāo)產(chǎn)物,往往需要綜合利用目標(biāo)產(chǎn)物的理化特性,采用多種分離技術(shù)組合,但分離步驟多,分離時(shí)間長(zhǎng),則影響目標(biāo)產(chǎn)物的得率和回收。在眾多的蛋白質(zhì)分離

6、純化技術(shù)中,層析是一門(mén)關(guān)鍵的技術(shù),它通常在分離工序的后部,決定著產(chǎn)品的純度和收率。和其它分離技術(shù)相比,層析技術(shù)具有以下特點(diǎn):1)分離效率高。離心、沉淀、雙水相萃取技術(shù)往往只能獲取粗產(chǎn)品,而運(yùn)用層析技術(shù),可得到純度較高的生物產(chǎn)品。例如,在中空纖維膜反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體,單克隆抗體存在于雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液中。采用沉淀分離技術(shù)只能獲得粗產(chǎn)品,為提高單克隆抗體純度,還必須結(jié)合離子交換層析、分子篩層析等3。若運(yùn)用親和層析技術(shù),以A蛋白為配基,從雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液中,經(jīng)一步純化,得到的單克隆抗體純度可達(dá)到電泳純4;2)和電泳分離相比,層析過(guò)程易于放大,易于自動(dòng)化。若采用電泳技術(shù)分離蛋白質(zhì),

7、雖然產(chǎn)品純度非常高,但其過(guò)程卻產(chǎn)生大量的熱,不但有損于蛋白質(zhì)的生物活性,而且過(guò)程難于放大。層析過(guò)程并不產(chǎn)生明顯的熱量,放大可采用加大柱徑和高度的方法。運(yùn)用計(jì)算機(jī)進(jìn)行控制,還可實(shí)現(xiàn)操作過(guò)程的自動(dòng)化5,6;3)層析技術(shù)適用性廣。差不多每一種蛋白質(zhì)純化過(guò)程都包括層析技術(shù),或者是離子交換層析,或者是分子篩層析,或者是幾種層析技術(shù)的組合。針對(duì)蛋白質(zhì)不同的生物特性,采用不同的層析技術(shù),可獲得純度很高的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。在蛋白質(zhì)分離純化方法中,層析技術(shù)占有重要地位。當(dāng)然層析技術(shù)的成功應(yīng)用也需要和其它的分離技術(shù)相配合。特別是前面的離心、沉淀等過(guò)程對(duì)層析效果的好壞也有很大的影響。3 層析技術(shù)進(jìn)展本世紀(jì)初,俄國(guó)植物學(xué)家

8、Tswett,用石油醚萃取植物色素,然后注入填有碳酸鈣的玻璃柱,7,100華南理工大學(xué)學(xué)報(bào) 第24卷 層析技術(shù)發(fā)展緩慢。到50年代,氣液層析的發(fā)展,給層析技術(shù)的工業(yè)應(yīng)用帶來(lái)了光明。隨著層析固定相的開(kāi)發(fā),層析作為一門(mén)工業(yè)技術(shù),廣泛用于各種化學(xué)物質(zhì)的分析、分離。到60年代,由于開(kāi)發(fā)出適用于生物物質(zhì)分離純化的層析固定相,層析技術(shù)才被用于生物物質(zhì)的分離純化并得到迅速發(fā)展。蛋白質(zhì)層析技術(shù)進(jìn)展表現(xiàn)在以下三方面:新型層析方法、新型層析固定相和對(duì)層析過(guò)程進(jìn)行數(shù)學(xué)模擬的深入研究。3 1 層析方法層析分離是基于固定相對(duì)流動(dòng)相中各組份阻滯能力的大小,各種層析方法,其阻滯機(jī)理不同。根據(jù)固定相對(duì)物料組份阻滯機(jī)理的不同,

9、層析可分為分子篩層析、羥基磷灰石層析、離子交換層析、疏水作用層析、反相作用層析、親和層析等。分子篩層析又稱(chēng)凝膠過(guò)濾層析或尺寸排阻層析,它是利用各組份分子體積大小與形狀的不同將組份分開(kāi)。分子篩層析的分離精度不高,常用于分子大小相差懸殊的蛋白質(zhì)的分離純化或蛋白質(zhì)溶液的脫鹽。羥基磷灰石層析基于羥基磷灰石對(duì)一些蛋白質(zhì)的吸附作用進(jìn)行分離。雖然羥基磷灰石層析應(yīng)用有限,但其分離成本低,在對(duì)某些蛋白質(zhì)如血漿銅藍(lán)蛋白的分離有獨(dú)到之處。離子交換層析是早期蛋白質(zhì)層析方法之一,目前仍被普遍使用。疏水作用層析、反相作用層析利用組份間疏水性的差異分離各組份。用于疏水作用層析、反相作用層析的固定相表面都帶有疏水作用基團(tuán)。不

10、同的是,疏水作用層析固定相表面的疏水基團(tuán)疏水性弱,一定鹽濃度的蛋白溶液流過(guò)固定相時(shí),蛋白質(zhì)被吸附,然后以低鹽水溶液作為洗脫劑進(jìn)行洗脫。而反相作用層析固定相表面的基團(tuán)疏水性強(qiáng),蛋白質(zhì)水溶液流過(guò)固定相時(shí),蛋白質(zhì)被吸附,然后用有機(jī)溶劑洗脫。疏水作用層析多用于大分子蛋白質(zhì)的分離純化。反相作用層析分離蛋白質(zhì)時(shí),蛋白質(zhì)容易變性失活。一般用于小分子蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸的分析、分離。親和層析是60年代發(fā)展起來(lái)的一種高效、快速蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)。通常的層析方法都是利用蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的差異來(lái)進(jìn)行分離的,這種差異往往并不是很大,所以,分離精度不高。親和層析則利用蛋白質(zhì)分子與某一分子專(zhuān)一可逆結(jié)合的生物特性,來(lái)選擇分離

11、目標(biāo)蛋白質(zhì)。親和層析容量大,分離效率高,且對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的生物活性起到一定的保護(hù)作用。隨著染料配基、人工定向合成配基的應(yīng)用和配基偶聯(lián)技術(shù)的發(fā)展,親和層析技術(shù)更加適用化8。特別是由于任何蛋白質(zhì)都具有抗原性,通過(guò)雜交瘤技術(shù)均可制備相應(yīng)的特異性單抗,以單抗為親和配基,去分離對(duì)應(yīng)的目標(biāo)蛋白質(zhì),可以實(shí)現(xiàn)各種天然、重組蛋白質(zhì)的高效、快速分離純化。近年來(lái),隨著人們對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的深入研究和其它學(xué)科的發(fā)展,又出現(xiàn)了一些新的蛋白質(zhì)層析方法,如金屬螯合層析、層析聚焦等9,10。這些層析技術(shù)在蛋白質(zhì)分離純化上都發(fā)揮著重要作用。表1給出了一些常用的層析方法及其特征。3 2 層析固定相各種層析技術(shù)的成功應(yīng)用,首先要有合適

12、的層析固定相,可以說(shuō),層析固定相決定著層析技術(shù)的發(fā)展。大多數(shù)層析固定相是官能化的載體,所以,層析固定相又直接決定于層析載體。早期使用的各種強(qiáng)酸、強(qiáng)堿型離子交換樹(shù)脂等固定相不適用于蛋白質(zhì)的分離。適用于蛋白質(zhì)分離純化的固定相必須具有高度的親水性,并具有一定的三維空間結(jié)構(gòu)和疏散度,以便于生物物質(zhì)的擴(kuò)散進(jìn)出,通過(guò)表面作用或體積排阻實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的分離。到60年代,纖維素、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖凝膠等的使用,使各種蛋白質(zhì)層析技術(shù)的應(yīng)用得以實(shí)現(xiàn)。瓊脂糖由于其高度的親水,第12期 鮑時(shí)翔等:蛋白質(zhì)分離純化與層析技術(shù)進(jìn)展表1 常用層析方法及其特征Table1 Methodsofvariouschromatograph

13、yandcharacteristics層析方法分子篩層析 離子交換層析 疏水作用層析 反相作用層析 親和層析:生物專(zhuān)一親和層析 免疫親和層析 染料親和層析 金屬螫合親和層析 層析聚焦生物活性 抗原與抗體作用 蛋白質(zhì)與染料分子吸附 蛋白質(zhì)與金屬離子絡(luò)合 等電點(diǎn)高高中中高高高高高中作用原理分子體積與形狀 離子交換 疏水作用 疏水作用分辨率低中中中容量低高中中101柱的放大受到限制。交聯(lián)瓊脂糖的剛性、對(duì)pH值和溫度的穩(wěn)定性比瓊脂糖大大提高。到70年代末,高效液相層析的開(kāi)發(fā)成功,可以說(shuō)是層析技術(shù)上的一次革命11。高效液相層析大多以硅膠、合成聚合物為層析固定相載體。和常規(guī)層析不同的是,高效液相層析固定相

14、顆粒剛性大,粒徑小,一般在510 m,目標(biāo)產(chǎn)物在顆粒內(nèi)傳質(zhì)快,層析操作時(shí)間短,分辨率高。通過(guò)對(duì)硅膠、合成聚合物表面進(jìn)行修飾,可以實(shí)現(xiàn)分子篩、離子交換、疏水作用、反相作用、親和等高效液相層析。目前,高效液相層析已被廣泛用于各種生物物質(zhì)的分析和制備。由于高效液相層析使用小顆粒固定相,所以操作壓降很高,在設(shè)備上高效液相層析需要高壓泵,層析柱、閥門(mén)、管道必須由不銹鋼制造,設(shè)備價(jià)格昂貴。為了避免高壓操作帶來(lái)的問(wèn)題,人們又開(kāi)發(fā)出各種新型的制備層析介質(zhì),如灌注層析介質(zhì)、膜介質(zhì)等。1987年美國(guó)PerseptiveBiosystems公司首推灌注層析介質(zhì)。灌注層析的特點(diǎn)是含有雙孔結(jié)構(gòu),即除了常規(guī)層析介質(zhì)的大量

15、微孔外,還含有縱橫交錯(cuò)貫穿介質(zhì)的 大孔 ?？焖俚鞍踪|(zhì)液相層析系統(tǒng)就是采用這種介質(zhì)為固定相,其操作壓降介于常規(guī)和高效液相層析之間。膜層析則是以膜為載體,對(duì)膜的內(nèi)外表面進(jìn)行修飾,接上官能團(tuán)來(lái)分離純化蛋白質(zhì)。由于膜具有良好的通透性和耐壓性,使得層析可以高效、快速進(jìn)行。灌注層析介質(zhì)與膜介質(zhì)的開(kāi)發(fā),是層析技術(shù)的新突破。12143 3 層析過(guò)程的數(shù)學(xué)模擬隨著新型層析方法、新型層析固定相的開(kāi)發(fā),人們對(duì)蛋白質(zhì)層析過(guò)程也在進(jìn)行深入研究。在分析層析機(jī)理和過(guò)程的基礎(chǔ)上,建立描述層析過(guò)程的數(shù)學(xué)模型,不但可以闡明層析作用機(jī)理,而且可以?xún)?yōu)化操作,并為層析過(guò)程的放大、設(shè)計(jì)提供理論依據(jù)。按組份在流動(dòng)相和固定相間的分配,層析可

16、以分為線性層析和非線性層析。線性層析是指組份在流動(dòng)相和固定相間的分配呈線性關(guān)系;非線性層析是指組份在流動(dòng)相與固定相間分配呈非線性關(guān)系。按操作規(guī)模和目的來(lái)分,層析可分為分析層析和制備層析。分析層析是為了獲得樣品組成信息,進(jìn)樣濃度低,進(jìn)樣量少;制備層析是為了分離制備產(chǎn)品,為了提高設(shè)備的生產(chǎn)能力,總是盡可能提高進(jìn)料濃度和進(jìn)料量。對(duì)于制備層析,目標(biāo)組份在流動(dòng)相和固定相間分配大都呈非線性關(guān)系,屬非線性層析。15102華南理工大學(xué)學(xué)報(bào) 第24卷 板構(gòu)成,并假設(shè)塔板上流動(dòng)相和固定相間組份的分配處于平衡狀態(tài),然后運(yùn)用物料衡算,得出層析柱出口組份濃度隨時(shí)間的變化。塔板理論只適用于線性層析,因?yàn)槔碚撍鍞?shù)是平衡常

17、數(shù)的函數(shù)。對(duì)于非線性層析,大多采用速率理論,即運(yùn)用質(zhì)量衡算方程、傳質(zhì)動(dòng)力學(xué)方程和平衡等溫線方程,再結(jié)合一定的初始條件和邊界條件,來(lái)描述目標(biāo)組份在流動(dòng)相和固定相中濃度隨時(shí)間和柱高的變化。目前,運(yùn)用速率理論建立各種非線性層析的數(shù)學(xué)模型報(bào)道很多1618,特別是運(yùn)用數(shù)值技術(shù)求解數(shù)學(xué)模型,使得數(shù)學(xué)模型更加適用化,可直接用于層析過(guò)程的最優(yōu)化設(shè)計(jì)和自動(dòng)化控制?？傊?近年來(lái)層析技術(shù)的發(fā)展非常迅速,層析技術(shù)的發(fā)展為蛋白質(zhì)產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化提供了保證。參 考 文 獻(xiàn)2 JansonJC,LarsRyden.ProteinPurification:Principles,highresolutionmethods,anda

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