1、26(2138-142中國生物防治Chinese Journal of Biological C ontrol2010年5月馬尾松毛蟲種群球孢白僵菌自然流行病流行菌株的異質(zhì)性劉玉軍,陳名君,湯強(qiáng),王濱,黃勃,李增智3(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物防治省重點(diǎn)試驗(yàn)室,合肥230036摘要:2006年在皖東明光市紫陽林場,馬尾松毛蟲Dendrolimus punctatus種群中發(fā)生由球孢白僵菌Beauveria bassiana引起的流行病。本研究通過4對引物,對采自流行區(qū)的44株球孢白僵菌進(jìn)行28S rDNA型內(nèi)含子分析,以探討流行菌株的遺傳多樣性及遺傳類型。結(jié)果顯示,存在8種不同內(nèi)含子單倍型。各單倍型所

2、占比例不同,其中BABA型占據(jù)優(yōu)勢地位,為79155%; BC BC和BC BA型次之,皆為4154%;而BAAA等5種單倍型僅各占2127%。表明引起自然流行病的球孢白僵菌是一個異質(zhì)性的群體。從生態(tài)適應(yīng)性的角度出發(fā),在球孢白僵菌種群中占據(jù)主導(dǎo)地位的BABA型菌株,今后可以作為明光地區(qū)生防菌株的重點(diǎn)篩選對象。關(guān)鍵詞:馬尾松毛蟲;球孢白僵菌;分子標(biāo)記;流行菌株;基因型;異質(zhì)性中圖分類號:S476112文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A文章編號:100529261(2010022*H eterogeneity of the Prevailing Strains of Beauveria bassiana in a P

3、opulationof the Massons Pine C aterpillar,Dendrolimus punctatusLI U Y u2jun,CHE N Ming2jun,T ANG Qiang,W ANG Bin,H UANG Bo,LI Z eng2zhi3 (Anhui Provincial K ey Laboratory for M icrobial C ontrol,Anhui Agricultural University,Hefei230036,ChinaAbstract:T o study the genotype and genetic diversity of t

4、he prevailing strains,a28S rDNA intron mark2 er2based genetic analysis was performed on44fungal strains representing the prevailing strains of Beauve2 ria bassiana on Dendrolimus punctatus in Mingguang.A diversity of8halpotypes appeared in the fungal population.Am ong them,the genotype BABA dominate

5、d the fungal population at a frequency of 79155%,and the genotypes BC BC and BC BA followed by4154%,whereas other5genotypes such as BAAA only occupied a percentage of2127%for each.The different genotype frequency indicated that the strains of B.bassiana with different genetic background had differen

6、t genetic stability and ecological adaptability.C onsideration of ecological adaptability,those strains with a genotype of BABA may serve as a key biological control agent for D.punctatus in Mingguang.K ey w ords:Dendrolimus punctatus;Beauveria bassiana;m olecular marker;prevailing strain;收稿日期:20092

7、05225基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30972368;教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(200503644001;安徽高校省級自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(T D200708;安徽省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(070411012831第2期劉玉軍等:馬尾松毛蟲種群球孢白僵菌自然流行病流行菌株的異質(zhì)性genotype;heterogeneity球孢白僵菌Beauveria bassiana(Bals.2CrivVuill.可侵染15目700余種昆蟲及其部分蜱螨類1,是自然界昆蟲種群的重要限制因子。在我國南方,球孢白僵菌作為持續(xù)控制馬尾松毛蟲(Dendrolimus punctatus的手段被廣泛使用,在條件

8、適宜時?？烧T發(fā)松毛蟲的流行病,從而取得良好的控制效果2。球孢白僵菌不僅有較強(qiáng)的寄生性,而且也具很強(qiáng)的腐生能力,因此能在一些自然環(huán)境中宿存下去。在土壤中,白僵菌在寄主種群中維持地方病的狀態(tài),并在寄主種群上升且環(huán)境條件適宜時上升成為大規(guī)模的流行病3。這種偶爾發(fā)生的自然流行病雖時有觀察,但迄今鮮見報道。已有文獻(xiàn)報道,松林生態(tài)系中的球孢白僵菌種群具有高度的異質(zhì)性4,5。然而,這些研究所涉及的菌株雖然來自同一林分,但涉及不同時期的不同寄主;也就是說,多為引起不同寄主地方病的菌株。關(guān)于昆蟲流行病所涉及到株系的遺傳多樣性,不管在哪類昆蟲病原物中目前尚無報道。了解不同遺傳基礎(chǔ)流行菌株的遺傳結(jié)構(gòu),以及它們對環(huán)境

9、的適應(yīng)性、毒力及寄主譜等方面的差異,了解其在自然界中的延續(xù)能力及引起昆蟲流行病的潛力,對于制定合理的治理決策具有重要意義。各種分子標(biāo)記為昆蟲的真菌流行病鑒定提供了良好的手段。RF LP、RAPD、AF LP等技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于蟲生真菌的遺傳多樣性研究610。28S rDNA型內(nèi)含子標(biāo)記技術(shù)由于操作簡便、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好和菌株易分類等優(yōu)點(diǎn),近年來已成為蟲生真菌遺傳多樣性與分子生態(tài)學(xué)研究的主要手段之一5,1115。Neuvéglise等15首先證明了布氏白僵菌(B.brongniartii的28S rDNA D11區(qū)域存在內(nèi)含子,利用配對引物擴(kuò)增,可檢測該區(qū)域內(nèi)含子的有無及其類型。王成

10、樹16對28S rDNA I型內(nèi)含子在球孢白僵菌分子生態(tài)學(xué)研究中的應(yīng)用做了較系統(tǒng)研究,證明球孢白僵菌的28S rDNA D82D11區(qū)域存在4種不同的內(nèi)含子。本研究通過28S rDNA I型內(nèi)含子分析,研究馬尾松毛蟲球孢白僵菌自然流行病所涉及菌株的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu),探討球孢白僵菌流行菌株與其遺傳類型的關(guān)系?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。1材料與方法111試驗(yàn)地概況與菌株采集2006年4月在安徽省明光市紫陽林場的馬尾松毛蟲種群中暴發(fā)由球孢白僵菌引起的大規(guī)模自然流行病,造成松毛蟲種群的崩潰17。紫陽林場位于安徽省東北部明光市西北23km 處,居江淮分水嶺北側(cè),地處東經(jīng)117°至119

11、6;、北緯32°至34°之間,屬北亞熱帶向暖溫帶過渡的半濕潤季風(fēng)氣候。年平均氣溫15,全年無霜期219d,年平均降雨量93411mm。全場總面積2700hm2,有林地1870hm2,其主要樹種為馬尾松(Pinus massoniana。2006年6月20-22日在流行病的中心區(qū)域采集感病的馬尾松毛蟲蟲尸標(biāo)本,經(jīng)分離、純化及形態(tài)鑒定后,共獲得44株球孢白僵菌菌株,保存于安徽省微生物防治重點(diǎn)試驗(yàn)室。112菌株培養(yǎng)與DNA提取在S DAY平板培養(yǎng)基上鋪滅菌玻璃紙,平衡1d后取各菌株孢懸液012ml鋪平板。25±1下培養(yǎng)6d,于玻璃紙上剝離菌絲體,冷凍干燥后備用。采用氯化

12、芐法提取DNA18。113PCR擴(kuò)增與核型鑒定使用王成樹16設(shè)計(jì)的4組引物E23/E24、121/122、131/132和129/138(表1對4個插入位931點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系與參數(shù)參照劉玉軍等13,采用25l 反應(yīng)體系:加有215l 10×Taq酶緩沖液(Sag on 公司,200m ol/L dNTP (Promega 公司,115mm ol/L MgCl 2,0112ng 引物,110UTaq 聚合酶及50ng 的模板DNA 。擴(kuò)增反應(yīng)在M J Research 200型號的PCR 儀上進(jìn)行。循環(huán)參數(shù):954min ;9445s ,5745s ,7245s ,35個

13、循環(huán);72延伸10min 。取PCR 產(chǎn)物5l 經(jīng)115%瓊脂糖凝膠電泳檢測,在IS 22200型紫外檢測儀(Alpha Innotech 公司下觀察和拍照。表1用于PCR 擴(kuò)增的引物及其序列T able 1Sequences of 4p airs of primers for PCR amplification引物Primers序列(523Sequence 引物Primers序列(523Sequence E23CCG AACCAG AATTCGG T AAG CG I31ATCGG CTTGG CAG AATCAG CG E24G CTG AATT ACCATTG CGG ACAGG I32

14、CAG CCAAACTCCCCACCTG A I21CG ATCCTTT AG TCCCTCG AC I29CTG CCCAG TG CTCTG AATG TC I22CG CTT ACCG AATTCTG CTTCGGI38CG CTG ATTG TG CCAAG CCCAT2結(jié)果與分析211菌株的內(nèi)含子擴(kuò)增圖譜不同菌株由于內(nèi)含子的有無,經(jīng)特異PCR擴(kuò)增,可以得到分子量大小不同的DNA 擴(kuò)增片段。其中具內(nèi)含子的較大擴(kuò)增片段定為A 型,不具內(nèi)含子的擴(kuò)增片段定為B 型。同時,由于球孢白僵菌的不同菌株間存在的準(zhǔn)性生殖現(xiàn)象,導(dǎo)致某一菌株中可能存在異核現(xiàn)象,由此就可能得到大小不同的兩條擴(kuò)增片段,這種內(nèi)

15、含子的擴(kuò)增片段定為C 型16。通過4對引物對內(nèi)含子的4個不同插入位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增,得到了清晰、重復(fù)性好的擴(kuò)增圖譜(圖。再根據(jù)擴(kuò)增條帶類型,確定了44圖引物I 29/I 38和I 21/I 22對部分菌株P(guān)CR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.R esults of PCR amplification using primers I 29/I 38and I 21/I 22from Beauveria bassiana isolates株供試菌株的內(nèi)含子類型(表2。212球孢白僵菌野生種群的內(nèi)含子單倍型分析通過對4個插入位點(diǎn)的內(nèi)含子分析,球孢白僵菌的44株野生菌株表現(xiàn)為8種核型(表2。其中以BABA 型最多,共計(jì)3

16、5株,占79155%;其次是BC BC 和BC BA 型,計(jì)2株,占4154%;而BAAA 等5個單倍型各僅有1株,分別占2127%。在明光地區(qū)馬尾松毛蟲種群引起流行病的球孢白僵菌種群是一個異質(zhì)的種群,而BABA 型菌株是引起流行病的優(yōu)勢菌株。說明這類菌株在該地區(qū)有著較強(qiáng)的野外適應(yīng)能力。213各插入位點(diǎn)的內(nèi)含子頻率分析球孢白僵菌28S rDNA 的D92D11區(qū)域存在4個內(nèi)含子插入位點(diǎn),但對于不同的插入位點(diǎn),其內(nèi)含子出現(xiàn)頻率卻極不相同(表3。同位點(diǎn)的內(nèi)含子插入頻率在4155%至97173%之間變動,存在巨大差異。位點(diǎn)Ec2563和位點(diǎn)Ec2066有插入內(nèi)含子(為A +C 之和的菌株分別占931

17、18%和97173%;與之相反,位點(diǎn)Ec1921和Ec2449有插入內(nèi)含子的菌株僅各占0和4155%。041中國生物防治第26卷表2不同內(nèi)含子單倍型在球孢白僵菌種群中的分布頻率與所含菌株T able2Distribution frequencies and isolates of the different intron2h aplotypes in populations of Beauveria bassiana內(nèi)含子單倍型Intron halotypes (Bb1,Bb2,Bb3,Bb4菌株數(shù)Numberof is olates所占比例(%Percentage所含菌株Is olatesB

18、ABB12127MG44BABA3579155MG04,MG05,MG07,MG08,MG10,MG12,MG15,MG16,MG17,MG18,MG19,MG20,MG21,MG22,MG25,MG27,MG28,MG29,MG30,MG37,MG38,MG41,MG48,MG52,MH55,MG56,MG57,MG59,MG60,MG61,MG63,MG66,MG68,MG70,MG71 BAAA12127MG06BC BC24154MG49,MG67BC BA24154MG18,MG50BCAC12127MG73BABC12127MG31BBBA12127MG01表3四種內(nèi)含子在28S

19、rDNA四個位點(diǎn)的分布頻率和比率T able3Distribution frequencies and ratio of b and type at4sites in28S rDNA產(chǎn)物類型T ype of product位點(diǎn)Ec2563S ite位點(diǎn)Ec2449S ite位點(diǎn)Ec2066S ite位點(diǎn)Ec1921S ite頻率Frequency比率(%Ratio頻率Frequency比率(%Ratio頻率Frequency比率(%Ratio頻率Frequency比率(%Ratio3討論28S rDNA型內(nèi)含子分析提供了一種較為穩(wěn)定、可靠的昆蟲病原真菌種下分型的分子生物學(xué)方法,在本研究中揭示了

20、在一場流行病中涉及到的球孢白僵菌菌株較高的種群異質(zhì)性。然而,這一標(biāo)記所攜帶的遺傳多樣性信息量畢竟較小,其表達(dá)的信息量不足以精確地代表某個特定菌株。如采用SSR2PCR、ISSR2PCR、AF LP2PCR等更為精確的分子標(biāo)記,還可對這種異質(zhì)性進(jìn)行更深入的認(rèn)識。昆蟲的流行病和地方病是同一種病原物引起疾病的兩個不同時期。流行病不常發(fā)生,但發(fā)病率很高,能迅速摧毀昆蟲種群;地方病較為常見,但發(fā)病率很低,病原物與寄主保持平衡狀態(tài)。對昆蟲的真菌流行病來說,高密度而聚集的易感寄主昆蟲和適宜的環(huán)境條件是必不可少的,然而更重要的是侵染力和流行潛力較強(qiáng)的菌株。本研究的球孢白僵菌種群具有較高的種群異質(zhì)性,其中BAB

21、A單倍型菌株為優(yōu)勢株,占整個種群數(shù)量的79155%。我們也發(fā)現(xiàn),在黃山市牯牛降的大褐蜩蟬(Graptopsaltria nigro f uscata中引起顯著流行病的蟬擬青霉(Paecilomyces cicadae的48個分離株,也表現(xiàn)出高度的異質(zhì)性和優(yōu)勢性(另文發(fā)表。一般認(rèn)為,異質(zhì)性強(qiáng)的種群可以在一定程度上維持其種群的穩(wěn)定態(tài),并且還能增強(qiáng)該種群對某一生態(tài)環(huán)境的適應(yīng)能力,而異質(zhì)性弱的種群極易受遺傳漂變而造成基因的隨機(jī)喪失和固定19。因此,在篩選防治農(nóng)林害蟲的球孢白僵菌菌株時,似應(yīng)選擇BABA或BBBA這類優(yōu)勢菌株。然而,彭凡等20從半干旱的內(nèi)蒙準(zhǔn)格爾旗的沙棘木蠹蛾(Holcocerus hi

22、ppophaecolus中流行的球孢白僵菌種群中分離141第2期劉玉軍等:馬尾松毛蟲種群球孢白僵菌自然流行病流行菌株的異質(zhì)性中國生物防治第26卷出的7個菌株,僅表現(xiàn)出極低的遺傳分化。我們在研究柱孢綠僵菌(Metarhizium cylindrosporum于皖東瑯琊山和皇甫山兩個自然保護(hù)區(qū)的流行時也發(fā)現(xiàn),兩個種群間遺傳距離雖然很大,但種群內(nèi)的異質(zhì)性卻很低,各有明顯的優(yōu)勢株(另文發(fā)表。因此,流行株種群異質(zhì)性與流行病的關(guān)系比較復(fù)雜,尚需進(jìn)一步的研究。尤其需要結(jié)合這些流行株的表型性狀來研究,例如對寄主昆蟲的毒力以及環(huán)境適應(yīng)性等。本研究44株白僵菌從形態(tài)鑒定的角度未發(fā)現(xiàn)有明顯的形態(tài)區(qū)別,對今后其他菌株

23、的相關(guān)研究有一定的啟示。參考文獻(xiàn)1蒲蟄龍,李增智.昆蟲真菌學(xué)M.合肥:安徽科技出版社,199612李增智,韓寶瑜,樊美珍,等.應(yīng)用球孢白僵菌防治馬尾松毛蟲的策略及其生物多樣性基礎(chǔ)的研究J.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,1998,9(5:503-51013王濱,樊美珍,李增智.馬尾松林生態(tài)系統(tǒng)中球孢白僵菌種群動態(tài)研究J.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2002,13(11:1368-137214丁德貴,李增智,樊美珍,等.球孢白僵菌種群在松林中的寄主轉(zhuǎn)移及遺傳多樣性對松毛蟲持續(xù)控制的影響J.應(yīng)用生態(tài)學(xué)報,2004,15(12:2315-232015趙學(xué)球,蔡守平,王四寶,等.球孢白僵菌釋放后在森林系統(tǒng)中定殖及持續(xù)控蟲作用的證據(jù)J

24、.菌物學(xué)報,2007,26(1:84-8816S t Leger R A,Allee L L,M ay R,et al.W orld2wide distribution of genetic variation am ong is olates of Beauveria spp.J.M ycologi2cal Research,1992,96:1007-101517de Muro M A,M ehta S,M oore D.The use of am plified fragment length polym orphism for m olecular analysis of Beauver

25、ia bassianais olates from K enya and other countries,and their correlation with host and geographical originJ.FE MS M icrobiology Letters,2003, 229(2:249-25718G aitan A,Valderrama A M,Saldarriaga G,et al.G enetic variability of Beauveria bassiana ass ociated with the coffee berry borer Hy2pothenemus

26、 hampei and other insectJ.M ycological Research,2002,106:1307-131419G lare T R,Inw ood A J.M orphological and genetic characteristics of Beauveria spp.from New Z ealandJ.M ycological Research,1997,102:250-256110M aurer P,C outeaudier Y,G irard P A,et al.G enetic diversity of Beauveria bassiana and relatedness to host insect rangeJ.M yco2logical Research,1997,101:159-164111陳名君,張中,樊美珍,等.利用28S rDNA型內(nèi)含子研