1、STZ 建立 2 型糖尿病大鼠模型的劑量探討         【摘要】  目的：探討鏈脲佐菌素（streptozocin, STZ）腹腔注射建立 2 型糖尿?。═2DM）大鼠模型的最佳注射劑量。方法：4 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠高糖高脂飼料喂養(yǎng) 4 周，分別按 30 mg/kg、40 mg/kg、50 mg/kg 體重劑量腹腔注射 STZ 建立 T2DM 大鼠模型，觀察成模大鼠各階段體重、食量、飲水量、尿量變化；檢測空腹血糖（FBG）、胰島素（FINS）、血脂，比較各組大鼠模型穩(wěn)定性。結果：40

2、mg/kg 劑量組大鼠的成模率最高（73.3%），成模大鼠具有胰島素抵抗、高血糖、高胰島素血癥和血脂紊亂的 T2DM 臨床特征，高血糖持續(xù)時間最長、最穩(wěn)定（到實驗結束模型穩(wěn)定至少 28 d）。30 mg/kg 劑量組大鼠成模率只有 40%，成模大鼠于實驗結束血糖水平已基本恢復正常，50 mg/kg 劑量組成模大鼠傾向于 1 型糖尿病。結論：短期高糖高脂飲食聯(lián)合 STZ 腹腔注射建立 2 型糖尿病 SD 大鼠模型的 STZ 最佳注射劑量為 40 mg/kg。 【關鍵詞】  2 型糖尿病；大鼠模型；鏈脲佐菌素   Abstract Objective To 

3、 explore  the  best  dosage  of  streptozocin  (STZ)  what  was  used  to  induce  rat   model  of   Type  2  diabetes  mellitus  (T2DM).  Methods   Sixty  4  weeks 

4、 old  male  Sprague  Dawley  (SD)  rats  were  fed  with  high  fatty  and  high  sugar  diet  for  4  weeks,  then  STZ  (30  mg/kg、40  mg/kg、50  mg/kg)  was  injected 

5、intraperitoneally  to  make  rat  model  of  T2DM,  each  phase  avoirdupois,  appetite  and  the  amount  of  urine  and  drinking  of  rat  model  were  tested,  in  unison, 

6、; the  fasting  blood  glucose  level  (FBG),  serum  insulin  level  (FINS)  and  blood  lipid  were  also  detected,  the  data  was  used  to  evaluate  the  stability  of 

7、 the  rat  model  of  T2DM.   Results  The  40  mg/kg  group  has  the  highest  making  model  success  rate  of  over  73.3%,  all  the  succeed  model  rat  has 

8、insulin  resistance,  hyperglycemia,  blood  lipid  disorder  and  blood  insulin  increased  which  were  the  typical  characteristic  of  T2DM,  and  duration  of  high  blood  glucose

9、60; was  the  longest  and  the  most  stabile  too.  Only  40%  of  the  30  mg/kg  group  has  succeed,  beside  the  blood  glucose  level  has  get  right  until  the

10、  end  of  experimental.  The  successful  rat  models  of  the  50  mg/kg  group  were  inclined  to  type  1  diabetes  mellitus.   Conclusion  Associate  with  high  fatty&

11、#160; and  high  sugar  diet  feeding  shortly,  the  best  dosage  of  STZ  which  was  used  to  induce  rat  model  of  T2DM  is  40  mg/kg.   Key  Words  Type  2

12、  diabetes  mellitus;  Rat  model;  Streptozocin   隨著人們生活水平的提高和飲食結構的變化，糖尿病的發(fā)病率逐年遞增，糖尿病已成為僅次于腫瘤和心血管疾病之后的第三大健康殺手1，在我國，實際患糖尿病人數(shù)已達 4 000 萬以上，其中 2 型糖尿?。═2DM）占整體糖尿病患者的 95%，2 型糖尿病的研究意義重大。復制與人體接近的T2DM實驗動物模型是進行 T2DM 研究的關鍵環(huán)節(jié)之一。近年來，眾研究人員多推崇采用高熱量飲食聯(lián)合 STZ 注射的方法誘導 T2DM 大鼠模型。STZ

13、對動物的胰島細胞具有高度選擇性的毒性作用，破壞動物的胰島細胞，導致糖尿病，但它對機體其他組織的毒性作用相對較小，采用 STZ 注射法復制 T2DM 大鼠模型，大鼠存活率高，成模狀態(tài)持續(xù)時間長，模型穩(wěn)定。然而，參閱眾文獻，STZ 的使用劑量各不相同，其模型狀況也各不一樣，因此，探索一個合適的 STZ 注射劑量，建立更長期穩(wěn)定的 T2DM 大鼠模型，能夠為糖尿病新藥的開發(fā)及其慢性并發(fā)癥的研究提供更理想的動物實驗技術平臺。本實驗在閱讀相關文獻的基礎上，通過不同 STZ 劑量組間對比，摸索建立長期穩(wěn)定的 2 型糖尿病大鼠模型的 STZ 最佳注射劑量。    1 

14、  材料和方法   1.1   動物與飼料   SPF 級雄性 SD 大鼠 60 只，4 周齡，體重 8595 g。SPF 級普通飼料。高糖高脂飼料：即普通飼料中加入 20% 的脂肪（50% 豬油和50% 蛋黃粉）和 20% 蔗糖，攪拌機混勻成型，烤熟后真空包裝，于深圳市金鵬源輻照技術有限公司 60Co 照射消毒滅菌至 SPF 級備用。動物和飼料及加工原料均由廣東省實驗動物中心提供實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（粵）2003-0002 粵監(jiān)證字 2006A015；普通飼料成分：小麥、玉米、進口魚粉、氨基酸、維生素、礦物元素添加

15、劑等組成。   1.2   試劑與儀器   鏈脲佐菌素（STZ）：美國Sigma 公司；檸檬酸（C6H8O7.H2O）：廣東臺山粵僑試劑塑料有限公司生產(chǎn)，批號：20060501；二水檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7.2H2O）：上海通直精細化工廠生產(chǎn)，批號：20050511；血糖儀、血糖試紙：美國強生穩(wěn)豪血糖儀及其配套試紙；Beckman-CX7 全自動生化儀：美國貝克曼庫爾特有限公司；FMJ 全自動放射免疫-計數(shù)器。   1.3   動物喂養(yǎng)及分組   所有 SD 大鼠 SP

16、F 環(huán)境飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為 2025，濕度 56%，自由飲水，12/12 h 晝夜規(guī)律，喂食時間為每日下午 5 點至次日上午 8 點。大鼠適應性飼養(yǎng) 1 周后禁食不禁水12 h，剪尾取血測血糖，稱體重，隨機分為 4 組：A 組（普通飼料組，即正常對照組）15 只，B、C、D 組（高糖高脂飼料 + STZ 注射組，即模型組），每組各 15 只，每籠 5 只喂養(yǎng)。   1.4   造模方法   各大鼠血糖值均在 5.56.5 mmol/L，屬正常范圍。A 組喂以普通飼料，B、C、D 組大鼠均喂以高糖高脂飼料，4 周后，禁食不禁水 12 h，

17、4 組的大鼠測體重，剪尾取血后 A 組按 0.1 mL/100 g 體重劑量腹腔注射檸檬酸緩沖液（0.1 mmol/L, pH 4.4），B、C、D 組分別按 30 mg/kg；40 mg/kg；50 mg/kg 體重劑量一次性腹腔內(nèi)注射STZ（溶于 0.1 mmol/L 檸檬酸緩沖液，pH 4.4，終濃度分別為 3%、4%、5%，冰浴，現(xiàn)配現(xiàn)用，5 min 內(nèi)用完）。   1.5   模型篩選   模型組大鼠注射 STZ 72 h 后測空腹血糖（FBG）。FBG 16.7 mmol/L 者確定為糖尿病大鼠模型。計算各組成模率和死亡率

18、。   1.6   模型維持狀況觀察   監(jiān)測各組成模大鼠第0、7、14、21、28 天下午 5 點血糖。觀察大鼠食量、飲水量、尿量及體重變化。   1.7   統(tǒng)計學方法   數(shù)據(jù)采用 x±s 表示，組間差異采用單因素方差分析，統(tǒng)計軟件為 SPSS 13.0 軟件包。    2   實驗結果   2.1   各組大鼠體重變化   用高糖高脂飼料喂養(yǎng) 4 周

19、后，模型組大鼠體重顯著高于正常對照組（P 0.05），成功誘導肥胖。實驗結束時，與注射 STZ 前比較，B 組大鼠體重增加 23.2%（P 0.05），C 組大鼠體重改變無統(tǒng)計學意義，D 組大鼠體重顯著低于 STZ 注射前（P 0.05），詳見表 1。   2.2   各組大鼠成模率比較   模型組大鼠注射STZ 72 h 后測 FBG，F(xiàn)BG 16.7 mmol/L 者確定為糖尿病大鼠模型，其中 C 組成模率最高，詳見表 2。   2.3   各組大鼠代謝特征比較   用高

20、脂飼料喂養(yǎng) 4 周后，與正常對照組相比，模型組大鼠食量增大，血清總膽固醇、甘油三酯、空腹胰島素、低密度脂蛋白水平均明顯升高（P 0.05），高密度脂蛋白顯著降低（P 0.05），血糖升高雖無統(tǒng)計學意義，但根據(jù)李氏胰島素敏感指數(shù)計算方法IAI=ln（1/FINS ×FBG），模型組 IAI 與正常對照組比較差異性顯著（P 0.05），結果表明已經(jīng)成功誘發(fā)出胰島素抵抗。實驗結束時，模型組大鼠血清總膽固醇、甘油三酯、空腹胰島素、低密度脂蛋白水平仍明顯高于正常對照組（P 0.05），高密度脂蛋白顯著低于正常對照組（P 0.05），IAI 與正常對照組比較差異顯著（P 0.05），具有 T2D

21、M 的臨床特征，詳見表 3。同時，STZ 注射后，與正常對照組相比，模型組大鼠的攝食量繼續(xù)增加，均出現(xiàn)了多飲多尿現(xiàn)象，B 組大鼠飲水量、尿量隨著時間的延長有相對減少，于實驗結束基本恢復正常；C 組、D 組大鼠飲水量、尿量到實驗結束未見減少，C 組大鼠飲水量、尿量增加 23 倍，D 組大鼠飲水量、尿量分別增加 45 倍。            2.4   各組成模大鼠血糖變化   模型組大鼠在成模后的第 0、7、14、21、28 天下午 5 點剪尾取血，用美

22、國強生穩(wěn)豪血糖儀測血糖，結果顯示，50 mg/kg 劑量組成模大鼠各階段血糖均大于 33.3 mmol/L（血糖儀器顯示：HI，提示大于 33.3 mmol/L，表 3 均用33.3 表示），30 mg/kg、40 mg/kg 劑量組成模大鼠分別于 STZ 注射 3 d 后顯示一個高血糖值，此血糖濃度維持 1 周左右，第 7 天開始有所下降，30 mg/kg 劑量組成模大鼠血糖下降較快，到第 28 天均降至16.7 mmol/L 以下，40 mg/kg 組成模大鼠血糖到實驗結束仍然維持一個較穩(wěn)定的高血糖濃度，詳見圖 1。    3   討論&#

23、160;  2 型糖尿病是以胰島素抵抗和持續(xù)高血糖為主要特征的代謝紊亂綜合征。目前，在 T2DM 的研究中，國內(nèi)外學者的實驗已證實高熱量飲食 + STZ 注射是復制 T2DM 大鼠模型的重要條件4-6：高熱量飲食可以導致肥胖，肥胖引起胰島素抵抗，并產(chǎn)生高胰島素血癥、血脂紊亂等一系列 2 型糖尿病臨床特征；STZ 選擇性損傷胰島細胞，導致高血糖；兩者的聯(lián)合作用可以成功誘導出具有胰島素抵抗和高血糖特征的 2 型糖尿病大鼠模型6-8。但是，此種方法復制 T2DM 大鼠模型，各研究人員所使用的 STZ 劑量不盡相同，本研究采用短期高糖高脂飼料喂養(yǎng)聯(lián)合三種不同劑量（30 mg/kg、40 mg

24、/kg、50 mg/kg）STZ 腹腔注射的方法制備實驗性 T2DM 大鼠模型，通過比較組間模型差異，探討復制 T2DM 大鼠模型的最佳 STZ 注射劑量。   實驗結果顯示，實驗大鼠用高糖高脂飼料喂養(yǎng) 4 周后，成功誘導胰島素抵抗、高胰島素血癥、血脂紊亂等 2 型糖尿病的主要臨床特征。同時，STZ 注射后，與正常對照組相比，模型組大鼠均出現(xiàn)了多飲多尿現(xiàn)象，30 mg/kg 劑量組大鼠飲水量、尿量隨著時間的延長有相對減少，至實驗結束，基本恢復正常；40 mg/kg 劑量組大鼠飲水量、尿量增加 23 倍，50 mg/kg 劑量組大鼠飲水量、尿量增加 45倍，到實驗結束亦未見減

25、少。STZ 注射 3 d 后進行模型篩選，30 mg/kg 劑量組大鼠成模 6 只，成模大鼠血糖均值最高達到 16.9 mmol/L，但是在 1 個月內(nèi)均逐漸下降至 16.7 mmol/L 以下，接近正常水平；50 mg/kg 劑量組大鼠成模 10 只，到實驗結束，成模大鼠血糖值始終維持在 33.3 mmol/L 以上；而 40 mg/kg 劑量組大鼠成模 11 只，從造模成功到實驗結束，成模大鼠血糖水平始終維持在一個相對較高水平，于實驗結束均值仍高達 17.8mmol/L。血糖變化主要與細胞損傷的程度密切相關，細胞損傷過于輕微，殘存胰島細胞代償作用可迅速使血糖恢復為正常狀態(tài)（如 30 mg/kg 劑量組），而細胞損傷過于嚴重，則傾向于 1 型糖尿?。ㄈ?50 mg/kg 劑量組）。本實驗 40 mg/kg 劑量組成模大鼠具備胰島素抵抗、高血糖、高胰島素血癥、血脂紊亂等 2 型糖尿病的主要臨床特征，且達到成模標準