1、藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則一、概述遺傳毒性研究（Genotoxicity Study）是藥物非臨床安全性評(píng)價(jià)的重要內(nèi)容，與其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有著密切的聯(lián)系，是藥物進(jìn)入臨床試驗(yàn)及上市的重要環(huán)節(jié)。擬用于人體的藥物，應(yīng)根據(jù)受試物擬用適應(yīng)癥和作用特點(diǎn)等因素考慮進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)。遺傳毒性試驗(yàn)是指用于檢測(cè)通過(guò)不同機(jī)制直接或間接誘導(dǎo)遺傳學(xué)損傷的受試物的體外和體內(nèi)試驗(yàn)，這些試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)出DNA損傷及其損傷的固定。以基因突變、較大范圍染色體損傷或重組形式出現(xiàn)的DNA損傷的固定，通常被認(rèn)為是可遺傳效應(yīng)的基礎(chǔ)，并且是惡性腫瘤多階段發(fā)展過(guò)程的重要因素（惡性腫瘤發(fā)展變化是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，遺傳學(xué)改變可能

2、僅在其中起部分作用）。染色體數(shù)目的改變也與腫瘤發(fā)生有關(guān)，并可提示生殖細(xì)胞出現(xiàn)非整倍體的可能性。在遺傳毒性試驗(yàn)中呈陽(yáng)性的化合物為潛在的人類致癌劑和/或致突變劑。由于在人體中已建立了某些致突變/遺傳毒性化合物的暴露與致癌性之間的相關(guān)性，而對(duì)于遺傳性疾病尚難以證明有類似的相關(guān)性，因此遺傳毒性試驗(yàn)主要用于致癌性預(yù)測(cè)。但是，因?yàn)樯臣?xì)胞突變與人類疾病具有明確的相關(guān)性，所以也應(yīng)同樣重視化合物引起潛在可遺傳性效應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。此外，遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果可能對(duì)致癌性試驗(yàn)的結(jié)果分析有重要作用。因此，在藥物開(kāi)發(fā)的過(guò)程中，遺傳毒性試驗(yàn)的目的是通過(guò)一系列試驗(yàn)來(lái)預(yù)測(cè)受試物是否有遺傳毒性，在降低臨床試驗(yàn)受試者和藥品上市后使用人群的

3、用藥風(fēng)險(xiǎn)方面發(fā)揮重要作用。本指導(dǎo)原則重點(diǎn)闡述遺傳毒性試驗(yàn)的基本原則，介紹標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合方案，闡述體內(nèi)外試驗(yàn)的基本原則，以及對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析評(píng)價(jià)與追加研究策略。本指導(dǎo)原則適用于中藥、天然藥物和化學(xué)藥物。二、基本原則（一）實(shí)驗(yàn)管理藥物遺傳毒性試驗(yàn)必須執(zhí)行藥物非臨床研究質(zhì)量管理規(guī)范（GLP）。（二）具體問(wèn)題具體分析遺傳毒性試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，應(yīng)該在對(duì)受試物認(rèn)知的基礎(chǔ)上，遵循“具體問(wèn)題具體分析”的原則。應(yīng)根據(jù)受試物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)、理化性質(zhì)、已有的藥理毒理研究信息等選擇合理的試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)適宜的試驗(yàn)方案，并試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全面的分析與評(píng)價(jià)。（三）隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)遺傳毒性試驗(yàn)應(yīng)符合毒理學(xué)試驗(yàn)隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)的基本原則。三、

4、基本內(nèi)容（一）受試物中藥、天然藥物：受試物應(yīng)采用能充分代表臨床試驗(yàn)擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。應(yīng)采用工藝路線及關(guān)鍵工藝參數(shù)確定后的工藝制備，一般應(yīng)為中試或中試以上規(guī)模的樣品，否則應(yīng)有充分的理由?；瘜W(xué)藥物：受試物應(yīng)采用工藝相對(duì)穩(wěn)定、純度和雜質(zhì)含量能反映臨床試驗(yàn)擬用樣品和/或上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。受試物應(yīng)注明名稱、來(lái)源、批號(hào)、含量（或規(guī)格）、保存條件、有效期及配制方法等，并提供質(zhì)量檢驗(yàn)報(bào)告。試驗(yàn)中所用溶媒和/或輔料應(yīng)標(biāo)明名稱、標(biāo)準(zhǔn)、批號(hào)、有效期、規(guī)格和生產(chǎn)單位等，并符合試驗(yàn)要求。應(yīng)進(jìn)行受試物樣品分析，并提供樣品分析報(bào)告。在藥物研發(fā)的過(guò)程中，若受試物的工藝發(fā)生可能影響其安全性的變

5、化，應(yīng)進(jìn)行相應(yīng)的安全性研究。（二）標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合對(duì)藥物而言，需對(duì)潛在的遺傳毒性進(jìn)行全面評(píng)價(jià)。遺傳毒性試驗(yàn)方法有多種，根據(jù)試驗(yàn)檢測(cè)的遺傳終點(diǎn)，可將檢測(cè)方法分為三大類，即基因突變、染色體畸變、DNA損傷；根據(jù)試驗(yàn)系統(tǒng)，可分為體內(nèi)試驗(yàn)和體外試驗(yàn)。由于沒(méi)有任何單一試驗(yàn)方法能檢測(cè)出所有的與腫瘤發(fā)生相關(guān)的遺傳毒性機(jī)制，因此，通常采用體外和體內(nèi)試驗(yàn)組合的方法，以全面評(píng)估受試物的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。這些試驗(yàn)相互補(bǔ)充，對(duì)結(jié)果進(jìn)行判斷時(shí)應(yīng)綜合考慮。1.標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合應(yīng)具備的特征標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合應(yīng)反映不同遺傳終點(diǎn)，包括體內(nèi)和體外試驗(yàn)，應(yīng)包含以下內(nèi)容：（1）應(yīng)包含細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（又稱Ames試驗(yàn)）。該試驗(yàn)已證明能檢出相關(guān)的遺傳學(xué)

6、改變和大部分嚙齒類動(dòng)物和人類的遺傳毒性致癌劑。（2）應(yīng)包含哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外和/或體內(nèi)試驗(yàn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外試驗(yàn)中，體外中期相染色體畸變?cè)囼?yàn)、體外微核試驗(yàn)、體外小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞Tk基因突變?cè)囼?yàn)（簡(jiǎn)稱小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)，MLA）已經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證并廣泛應(yīng)用，且同樣適合于檢測(cè)染色體損傷。若實(shí)驗(yàn)室對(duì)這些方法已進(jìn)行了充分的驗(yàn)證，當(dāng)用于標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中時(shí)，這幾個(gè)試驗(yàn)可互相替換。體內(nèi)試驗(yàn)具有考慮到如吸收、分布、代謝、排泄等因素的優(yōu)勢(shì)，并且可檢出體外試驗(yàn)無(wú)法檢出的某些遺傳毒性物質(zhì)（注釋1），因此標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合應(yīng)至少包含一項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn)?？刹捎脟X類動(dòng)物造血細(xì)胞染色體損傷試驗(yàn)（包括骨髓或外周血紅細(xì)胞微核試驗(yàn)、骨髓

7、中期相細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)）或其他合適的體內(nèi)試驗(yàn)。2.推薦的兩種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合組合一：（1）一項(xiàng)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)；（2）一項(xiàng)檢測(cè)染色體損傷的體外細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)（體外中期相染色體畸變?cè)囼?yàn)或體外微核試驗(yàn)），或一項(xiàng)體外小鼠淋巴瘤細(xì)胞Tk基因突變?cè)囼?yàn)；（3）一項(xiàng)體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)，通常為嚙齒類動(dòng)物造血細(xì)胞染色體損傷試驗(yàn)，用于檢測(cè)微核或中期相細(xì)胞染色體畸變。組合二：（1）一項(xiàng)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)；（2）采用兩種不同組織進(jìn)行的體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)，通常為一項(xiàng)嚙齒類動(dòng)物造血細(xì)胞微核試驗(yàn)和第二項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn)。以上兩種試驗(yàn)組合同等適合（注釋2），可根據(jù)受試物特點(diǎn)自主選擇。體內(nèi)試驗(yàn)可采用單次給藥或重復(fù)給藥的試驗(yàn)設(shè)計(jì)。如果試驗(yàn)設(shè)計(jì)科

8、學(xué)合理，采用重復(fù)給藥時(shí)可將遺傳毒性終點(diǎn)指標(biāo)整合入一般毒性試驗(yàn)中；當(dāng)在體內(nèi)評(píng)價(jià)一項(xiàng)以上的遺傳毒性終點(diǎn)指標(biāo)時(shí)，也可將它們整合在一項(xiàng)試驗(yàn)中。但是，整合的前提條件是試驗(yàn)設(shè)計(jì)（例如劑量、采樣）對(duì)于重復(fù)給藥試驗(yàn)是合適的，并且需要獲得充分的支持信息。完成上述任何一種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合，若試驗(yàn)結(jié)果為陰性，通常可提示受試物不具有遺傳毒性。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合結(jié)果為陽(yáng)性的受試物，根據(jù)其治療用途，可能需要進(jìn)一步的試驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合不包含為檢測(cè)非整倍體而設(shè)計(jì)的特定試驗(yàn)。但是，檢測(cè)中期相細(xì)胞染色體畸變的體外和體內(nèi)試驗(yàn)可檢測(cè)多種類型的染色體完整性方面的改變，微核試驗(yàn)具有檢測(cè)某些非整倍體誘導(dǎo)劑的能力，小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)也可檢測(cè)染色體

9、丟失（可能導(dǎo)致非整倍體）。建議采用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合并不意味著其他遺傳毒性試驗(yàn)不合適，這些試驗(yàn)可作為標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合以外的供選試驗(yàn)，用于對(duì)標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合得到的遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果的進(jìn)一步研究。在某些情況下，標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中的一項(xiàng)或多項(xiàng)試驗(yàn)對(duì)于受試物不適合或因技術(shù)原因無(wú)法實(shí)施時(shí)，可采用其他經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的試驗(yàn)作為替代試驗(yàn)，但應(yīng)提供充分的科學(xué)合理性及依據(jù)。附錄部分簡(jiǎn)介標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中常用的幾種試驗(yàn)方法，該部分內(nèi)容只是基本原則，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)具體情況具體分析，合理設(shè)計(jì)。3.標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合的調(diào)整標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合在一些特殊情況下不適合，需要根據(jù)情況進(jìn)行調(diào)整。（1）當(dāng)受試物對(duì)細(xì)菌有高毒性時(shí)（如某些抗生素），仍應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，因?yàn)橹?/p>

10、突變性可能出現(xiàn)在較低的、毒性較小的濃度。同時(shí)，還應(yīng)進(jìn)行一項(xiàng)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)，即采用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合一。（2）標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合通常可檢出具有遺傳毒性作用警示結(jié)構(gòu)的受試物（注釋3），因?yàn)榇蟛糠帧熬窘Y(jié)構(gòu)”被定義為與細(xì)菌誘變性有關(guān)。但是，對(duì)于具有某些特殊警示結(jié)構(gòu)的化合物，需要對(duì)標(biāo)準(zhǔn)組合方案進(jìn)行調(diào)整（注釋4）。附加試驗(yàn)的選擇或方案的調(diào)整取決于這些具有警示結(jié)構(gòu)受試物的化學(xué)性質(zhì)、已知活性和代謝信息。（3）某些特殊的受試物，如一些放射影像劑、抗酸鋁合劑、一些吸入用藥、一些皮膚或其他局部用藥，毒代或藥代動(dòng)力學(xué)研究提示其不被全身吸收，因此在體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)中無(wú)法到達(dá)靶組織（注釋5）。對(duì)于這些受試物，體內(nèi)試驗(yàn)（尤其是

11、骨髓、血液、肝臟）難以提供有用的信息。在改變給藥途徑也不能提供足夠的靶組織暴露，且對(duì)暴露量最高的組織無(wú)合適的遺傳毒性試驗(yàn)的情況下，僅根據(jù)體外試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)可能是合適的。某些情況下，采用接觸部位評(píng)價(jià)遺傳毒性作用可能也是合理的，盡管這些試驗(yàn)尚未廣泛應(yīng)用（注釋6）。4.生殖細(xì)胞誘變劑的檢測(cè)遺傳毒性對(duì)生殖細(xì)胞的影響也極其重要。標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中不包含專門(mén)檢測(cè)生殖細(xì)胞誘變劑的試驗(yàn)。但是，比較研究結(jié)果顯示，從定性的角度，大多數(shù)生殖細(xì)胞誘變劑能在體細(xì)胞試驗(yàn)中檢出，因此體內(nèi)體細(xì)胞遺傳毒性試驗(yàn)的陰性結(jié)果通?？商崾臼茉囄飳?duì)生殖細(xì)胞無(wú)影響。體內(nèi)體細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，在綜合評(píng)價(jià)及指導(dǎo)用藥時(shí)應(yīng)關(guān)注受試物對(duì)生殖細(xì)胞的影響。（

12、三）體外、體內(nèi)試驗(yàn)基本要求遺傳毒性的體內(nèi)外試驗(yàn)方法較多，本指導(dǎo)原則僅討論常用方法及需要重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題，試驗(yàn)時(shí)需具體情況具體分析。無(wú)論體外、體內(nèi)試驗(yàn)，方法學(xué)均應(yīng)經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證。各實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立歷史背景對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)（包括陰性和陽(yáng)性對(duì)照數(shù)據(jù)庫(kù)）。1.體外試驗(yàn)基本要求1.1 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中采用的菌株細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)至少應(yīng)采用5種菌株，包括用于檢測(cè)組氨酸靶基因中鳥(niǎo)嘌呤-胞嘧啶（G-C）位點(diǎn)堿基置換或移碼突變的4種組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門(mén)氏菌（TA98；TA100；TA1535；TA1537/TA97/ TA97a），以及用于檢測(cè)組氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位點(diǎn)堿基置換與檢測(cè)交聯(lián)劑的鼠傷

13、寒沙門(mén)氏菌TA102或埃希氏大腸桿菌WP2 uvrA或埃希氏大腸桿菌WP2 uvrA （pKM101）。1.2 體外試驗(yàn)中最高濃度的確定（注釋7） 體外試驗(yàn)中受試物的最高濃度主要取決于受試物對(duì)細(xì)菌/細(xì)胞的毒性和溶解度。1.2.1最高濃度對(duì)不受溶解度或細(xì)胞毒性限制的受試物，細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)應(yīng)達(dá)到的最高濃度為5mg/皿（液體受試物為5µl/皿），哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)為1mM 或0.5mg/ml（選用較低者）。1.2.2要求達(dá)到的細(xì)胞毒性水平在遺傳毒性體外試驗(yàn)中，某些遺傳毒性致癌劑只有在檢測(cè)濃度高達(dá)可產(chǎn)生一定程度的細(xì)胞毒性時(shí)才可檢出，但毒性過(guò)高又會(huì)影響對(duì)相應(yīng)的遺傳終點(diǎn)進(jìn)行恰當(dāng)?shù)脑u(píng)價(jià)。當(dāng)哺乳動(dòng)物

14、細(xì)胞存活率很低時(shí)，一些遺傳毒性以外的作用機(jī)制如細(xì)胞毒性（如與細(xì)胞凋亡、溶酶體釋放核酸內(nèi)切酶等有關(guān)的結(jié)果）會(huì)導(dǎo)致遺傳毒性假陽(yáng)性結(jié)果，這種情況常發(fā)生于受試物濃度達(dá)到毒性閾濃度時(shí)。鑒于以上情況，在體外細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)中，目前可接受以下的細(xì)胞毒性水平（濃度不應(yīng)超過(guò)1.2.1中的規(guī)定）：（1）細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中，進(jìn)行評(píng)價(jià)的濃度應(yīng)能顯示明顯的毒性，如回復(fù)突變菌落數(shù)目減少、背景菌苔減少或消失。（2）哺乳動(dòng)物細(xì)胞體外遺傳學(xué)試驗(yàn)中，最高濃度產(chǎn)生的細(xì)胞毒性應(yīng)約為50%。（3）對(duì)于小鼠淋巴瘤細(xì)胞Tk基因突變?cè)囼?yàn)，最高濃度產(chǎn)生的細(xì)胞毒性應(yīng)為80%90%。1.2.3難溶受試物的檢測(cè)用細(xì)菌和哺乳動(dòng)物細(xì)胞遺傳毒性試驗(yàn)

15、檢測(cè)某些受試物時(shí)，在不溶解的濃度范圍內(nèi)也能檢測(cè)出劑量相關(guān)性的遺傳毒性。建議采用以下策略檢測(cè)相對(duì)不溶的受試物：（1）對(duì)于細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)，如果沉淀不干擾計(jì)數(shù)，應(yīng)對(duì)產(chǎn)生沉淀的濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)，且最高濃度不超過(guò)5mg/皿或5µl/皿。當(dāng)未觀察到細(xì)菌毒性時(shí)，應(yīng)以產(chǎn)生沉淀的最低濃度作為計(jì)數(shù)的最高濃度；當(dāng)觀察到劑量相關(guān)的細(xì)菌毒性或誘變性時(shí)，應(yīng)按上述細(xì)胞毒性的要求來(lái)確定最高濃度。（2）對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)，若沉淀不干擾計(jì)數(shù)，最高濃度應(yīng)是培養(yǎng)液中產(chǎn)生最少可見(jiàn)沉淀的最低濃度。應(yīng)通過(guò)肉眼觀察或鏡檢等方法來(lái)觀察記錄沉淀在培養(yǎng)過(guò)程中持續(xù)存在或培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)（至處理結(jié)束時(shí)）。1.3 體外試驗(yàn)的重現(xiàn)性體外試驗(yàn)應(yīng)關(guān)注

16、重現(xiàn)性。當(dāng)采用新方法或試驗(yàn)出現(xiàn)非預(yù)期結(jié)果時(shí)，有必要進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。但是，當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)的、已廣泛應(yīng)用的常規(guī)體外試驗(yàn)方法時(shí)，若這些試驗(yàn)經(jīng)過(guò)了充分驗(yàn)證且進(jìn)行了有效的內(nèi)部質(zhì)量控制，得到明確的陽(yáng)性或陰性結(jié)果，通常不需要重復(fù)試驗(yàn)。但是，若得到可疑結(jié)果，則需要進(jìn)一步試驗(yàn)。2.體內(nèi)試驗(yàn)基本要求2.1 檢測(cè)染色體損傷的體內(nèi)試驗(yàn)采用骨髓細(xì)胞分析染色體畸變或檢測(cè)含微核的嗜多染紅細(xì)胞的體內(nèi)試驗(yàn)方法均可用于檢測(cè)染色體斷裂劑。由于細(xì)胞分裂后期的一個(gè)或多個(gè)染色體相對(duì)滯后也能形成微核，因此微核檢測(cè)方法也能檢測(cè)一些非整倍體誘導(dǎo)劑（注釋8）。大鼠和小鼠均適用于骨髓微核試驗(yàn)。微核也可通過(guò)小鼠外周血中未成熟紅細(xì)胞（如嗜多染紅細(xì)胞）或大鼠

17、血液新生網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定（注釋9）。同樣，也可使用已證明了對(duì)檢測(cè)斷裂劑/非整倍體誘導(dǎo)劑具有足夠靈敏度、來(lái)源于其他種屬動(dòng)物的骨髓或外周血的未成熟紅細(xì)胞。除人工鏡檢方法外，若方法學(xué)經(jīng)過(guò)了充分驗(yàn)證，也可采用自動(dòng)化分析系統(tǒng)（如圖像分析系統(tǒng)和流式細(xì)胞術(shù)）對(duì)微核進(jìn)行檢測(cè)。嚙齒類動(dòng)物給藥后，取外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，也可用于分析染色體畸變（注釋10）。2.2 其他體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)第二項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn)可作為第二種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合的一部分，并可用作追加試驗(yàn)以在評(píng)價(jià)體外或體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果時(shí)提高證據(jù)權(quán)重（注釋11）。體內(nèi)組織和試驗(yàn)的選擇應(yīng)根據(jù)多種因素來(lái)確定，例如受試物可能的作用機(jī)制、體內(nèi)代謝特征或者被認(rèn)為是相關(guān)的暴露組織等信息

18、。由于肝臟的暴露和代謝能力，肝臟是代表性的首選組織。第二種體內(nèi)試驗(yàn)經(jīng)常以評(píng)價(jià)DNA損傷為終點(diǎn)指標(biāo)作為替代終點(diǎn)。目前，已有大量應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)的試驗(yàn)包括：DNA鏈斷裂試驗(yàn)如單細(xì)胞凝膠電泳試驗(yàn)（彗星試驗(yàn)）和堿洗脫試驗(yàn)、轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)突變?cè)囼?yàn)、DNA共價(jià)結(jié)合試驗(yàn)。2.3 體內(nèi)試驗(yàn)的給藥途徑一般情況下，給藥途徑應(yīng)與臨床擬用途徑一致。若不一致，應(yīng)說(shuō)明理由。但是，為獲得全身暴露，在適當(dāng)時(shí)可進(jìn)行調(diào)整，如局部給藥的受試物。2.4 體內(nèi)試驗(yàn)嚙齒類動(dòng)物性別的選用短期給藥（通常是給藥13次）的體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)一般可單用雄性動(dòng)物。若已有的毒性、代謝或暴露資料提示在所用動(dòng)物種屬上存在毒理學(xué)意義的性別差異，則應(yīng)采用兩種性別的動(dòng)物

19、。當(dāng)遺傳毒性試驗(yàn)整合在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中時(shí)，應(yīng)對(duì)兩種性別動(dòng)物進(jìn)行采樣，如果毒性、代謝方面沒(méi)有明顯性別差異，可僅對(duì)單一性別進(jìn)行評(píng)價(jià)。如果受試物擬專用于單一性別，可選用相應(yīng)性別的動(dòng)物進(jìn)行試驗(yàn)。2.5 體內(nèi)試驗(yàn)的劑量選擇（注釋7）通常應(yīng)對(duì)有代表性的三個(gè)劑量水平進(jìn)行分析檢測(cè)。對(duì)于短期試驗(yàn)（通常是給藥13次），推薦的最高劑量是：限度劑量2000mg/kg（若可耐受），或最大耐受量（為產(chǎn)生毒性的劑量，而基于同樣的給藥方案，比該劑量稍高即預(yù)期會(huì)出現(xiàn)死亡）。劑量選擇時(shí)還應(yīng)考慮骨髓紅細(xì)胞生成的抑制。最高劑量之下的其他劑量一般劑量間距為約23倍。對(duì)于多次給藥試驗(yàn)，分為兩種情況：（1）當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合一時(shí)，若該試

20、驗(yàn)整合在重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)中，如果該重復(fù)給藥毒性試驗(yàn)符合支持人體臨床試驗(yàn)的一個(gè)充分試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)，則通常認(rèn)為對(duì)于遺傳毒性評(píng)價(jià)劑量是合適的，該原則適用于體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果為陰性或不相關(guān)的陽(yáng)性時(shí)。（2）當(dāng)進(jìn)行追加試驗(yàn)或當(dāng)采用標(biāo)準(zhǔn)組合二時(shí)，應(yīng)對(duì)多種因素進(jìn)行評(píng)價(jià)以確定高劑量是否適合用于遺傳毒性評(píng)價(jià)。毒性試驗(yàn)（尤其是大鼠試驗(yàn)）的高劑量需滿足以下任何一條標(biāo)準(zhǔn)，才可用于遺傳毒性評(píng)價(jià)：最大給藥量，基于受試物在溶劑中的理化性質(zhì)。對(duì)于給藥14天或更長(zhǎng)時(shí)間的試驗(yàn)，如果能耐受，限度劑量為1000 mg/kg。最大可能暴露量，通過(guò)達(dá)到暴露峰值/穩(wěn)態(tài)或受試物的蓄積來(lái)證明。若受試物的暴露量隨給藥時(shí)間增加而明顯減少（如比起始

21、暴露量減少50%），則不宜采用多次給藥試驗(yàn)。高劑量急性給藥試驗(yàn)所采用高劑量的50%，即接近最小致死量。僅基于無(wú)毒性的暴露范圍（高于臨床暴露量的若干倍）來(lái)選擇高劑量，不是充分合理的。對(duì)于具有血液或骨髓毒性的受試物，進(jìn)行遺傳毒性評(píng)價(jià)的劑量應(yīng)在具有嚴(yán)重紅細(xì)胞系毒性（如具有明顯的嗜多染紅細(xì)胞或網(wǎng)織紅細(xì)胞抑制）的高劑量之下、間距不超過(guò)約2倍。（四）試驗(yàn)的階段性細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)可支持單次給藥的臨床試驗(yàn)；為支持多次給藥的臨床試驗(yàn)，應(yīng)采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行一項(xiàng)評(píng)估染色體損傷試驗(yàn)；在期臨床試驗(yàn)開(kāi)始前完成完整的遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合。但是，為了減少藥物開(kāi)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、保護(hù)受試者安全，建議在臨床試驗(yàn)開(kāi)始前完成遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)

22、組合。四、試驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)與追加研究策略遺傳毒性研究是藥物安全性評(píng)價(jià)與藥物整體開(kāi)發(fā)進(jìn)程的一個(gè)重要組成部分，其最終目的在于預(yù)測(cè)受試物潛在的致癌性或其他遺傳危害性。試驗(yàn)結(jié)果的分析與評(píng)價(jià)是試驗(yàn)的必要組成部分，應(yīng)對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行科學(xué)和全面的分析與評(píng)價(jià)。在對(duì)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)結(jié)合受試物的藥學(xué)特點(diǎn)、藥效學(xué)、藥代動(dòng)力學(xué)和其他毒理學(xué)研究的結(jié)果等信息進(jìn)行綜合分析。試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)最終應(yīng)落實(shí)到臨床試驗(yàn)受試者范圍限定、風(fēng)險(xiǎn)效益評(píng)估以及必要防治措施的制定和應(yīng)用上。遺傳毒性試驗(yàn)組合檢測(cè)的是主要通過(guò)直接的遺傳損傷機(jī)制的致癌物質(zhì)（如絕大多數(shù)已知的人類致癌劑），不適用于檢測(cè)非遺傳毒性致癌劑。每種試驗(yàn)系統(tǒng)均可能產(chǎn)生假陰性或

23、假陽(yáng)性結(jié)果。一些試驗(yàn)條件，如有限的體外代謝活化能力，可能導(dǎo)致體外試驗(yàn)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。試驗(yàn)組合方法的設(shè)計(jì)是為了減少具有潛在遺傳毒性的受試物產(chǎn)生假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)。另一方面，任何一項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)中的陽(yáng)性結(jié)果并不一定能說(shuō)明受試物對(duì)人類真正具有遺傳毒性或致癌性的危險(xiǎn)。在對(duì)體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)時(shí)，對(duì)陽(yáng)性或陰性的結(jié)果均應(yīng)予以充分考慮，尤其是在有疑問(wèn)時(shí)。評(píng)價(jià)受試物的潛在遺傳毒性時(shí)，應(yīng)全面考慮各項(xiàng)試驗(yàn)結(jié)果、體內(nèi)和體外試驗(yàn)方法的內(nèi)在價(jià)值及其局限性，進(jìn)行綜合分析與評(píng)價(jià)。（一）體外試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)1.體外試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果1.1 體外細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)陽(yáng)性結(jié)果的評(píng)價(jià)由于細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的陽(yáng)性結(jié)果提示DNA反應(yīng)性，為評(píng)估對(duì)患者

24、用藥的潛在風(fēng)險(xiǎn)，需進(jìn)行充分的追加試驗(yàn)以評(píng)價(jià)體內(nèi)致突變和潛在致癌性，除非通過(guò)恰當(dāng)?shù)娘L(fēng)險(xiǎn)獲益分析證明是合理的。細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)考慮受試物的純度，以確定陽(yáng)性結(jié)果是否污染物所致。氨基酸（組氨酸或色氨酸）污染可能導(dǎo)致菌落數(shù)的升高而出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，因此細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)不適合檢測(cè)可能會(huì)降解的肽類。一些特殊情況下，細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)陽(yáng)性結(jié)果并不提示對(duì)人體有遺傳毒性潛力，例如當(dāng)發(fā)生細(xì)菌特異性代謝時(shí)（如通過(guò)細(xì)菌硝基還原酶活化）。1.2 體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的評(píng)價(jià)對(duì)于體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果，應(yīng)采用下述的證據(jù)權(quán)重法進(jìn)行分析，必要時(shí)進(jìn)行追加試驗(yàn)。例如（包括但不限于）：陽(yáng)性結(jié)果是否歸因于體內(nèi)不

25、存在的條件（如pH值、滲透壓、沉淀物）；陽(yáng)性結(jié)果僅發(fā)生于產(chǎn)生最高細(xì)胞毒性的濃度：在小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)中陽(yáng)性結(jié)果發(fā)生于相對(duì)總細(xì)胞生長(zhǎng)率（Relative total growth，RTG）減少80%時(shí)；在體外細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)中陽(yáng)性結(jié)果發(fā)生于細(xì)胞生長(zhǎng)抑制50%時(shí)。對(duì)于以上情況，如果應(yīng)用證據(jù)權(quán)重法分析提示缺乏潛在遺傳毒性，可采用標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合一，即一個(gè)體內(nèi)試驗(yàn)即可。2.體外試驗(yàn)陰性結(jié)果對(duì)于體外試驗(yàn)陰性結(jié)果，在一些特殊情況下需考慮進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)，例如（包括但不限于）：受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)或已知代謝特征提示標(biāo)準(zhǔn)的體外代謝活化技術(shù)（如嚙齒類動(dòng)物肝臟S9）可能不適用；受試物的化學(xué)結(jié)構(gòu)或已知活性提示采用其他試驗(yàn)方法

26、或系統(tǒng)更合適。（二）體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)與體外試驗(yàn)相比，體內(nèi)試驗(yàn)方法具有考慮到與人體應(yīng)用相關(guān)的吸收、分布、排泄的優(yōu)點(diǎn)，而且體內(nèi)代謝相對(duì)于體外試驗(yàn)中的代謝系統(tǒng)更具有相關(guān)性。因此，體內(nèi)試驗(yàn)在遺傳毒性試驗(yàn)中具有更重要的意義。如果體外與體內(nèi)試驗(yàn)的結(jié)果不一致，對(duì)其結(jié)果差異應(yīng)采用具體問(wèn)題具體分析的原則進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，如代謝差異、受試物在體內(nèi)快速和高效排泄等。1.體內(nèi)試驗(yàn)陰性結(jié)果體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果的意義與受試物在靶組織（注釋5）中是否有足夠的暴露直接相關(guān)，尤其是當(dāng)體外試驗(yàn)為確定的陽(yáng)性結(jié)果而體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為陰性時(shí)，或者是當(dāng)未進(jìn)行體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)時(shí)更為重要。受試物在靶組織中具有足夠暴露的證據(jù)包括可疑組織的毒性，或下述

27、的毒代動(dòng)力學(xué)資料。如果受試物在靶組織中無(wú)法達(dá)到足夠的暴露量，則常規(guī)的體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)的意義較小。對(duì)于體外遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性（或未進(jìn)行）而體內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果為陰性的受試物，應(yīng)采用以下任何一種方法來(lái)反映受試物在體內(nèi)/靶組織的暴露水平：（1）細(xì)胞毒性對(duì)于細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)，可通過(guò)微核試驗(yàn)中各劑量組和各采樣時(shí)間點(diǎn)所用組織（骨髓或外周血）中未成熟紅細(xì)胞數(shù)與紅細(xì)胞總數(shù)的比例的顯著變化，或通過(guò)染色體畸變?cè)囼?yàn)中有絲分裂指數(shù)的顯著降低，來(lái)間接反映受試物的暴露水平。對(duì)其他體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)，可通過(guò)肝臟或組織的毒性（如通過(guò)組織病理學(xué)檢查或血液生化學(xué)指標(biāo)）來(lái)間接反映受試物的暴露水平。（2）暴露通過(guò)測(cè)定血液或血漿中的受試物相關(guān)

28、物質(zhì)水平來(lái)反映受試物的體內(nèi)暴露（注釋12）；直接測(cè)定靶組織中的受試物相關(guān)物質(zhì)；或通過(guò)放射自顯影檢測(cè)組織暴露水平。體內(nèi)暴露的評(píng)估應(yīng)采用與遺傳毒性試驗(yàn)相同的動(dòng)物種屬、品系和給藥途徑，在最高劑量或其他相關(guān)劑量中進(jìn)行。如果全身暴露與預(yù)期的臨床暴露相似或更低，提示可能需要采用替代的方法，如采用不同的給藥途徑、采用具有更高暴露的不同種屬、采用不同的組織或試驗(yàn)。若體外試驗(yàn)未顯示受試物有潛在遺傳毒性，可采用上述任何一種方法，也可用嚙齒類動(dòng)物吸收、分布、代謝和排泄試驗(yàn)結(jié)果來(lái)確定體內(nèi)暴露水平。2.體內(nèi)試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果體內(nèi)遺傳毒性試驗(yàn)也可能出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，例如：未給予任何遺傳毒性物質(zhì)，但由于干擾了紅細(xì)胞生成而導(dǎo)致微核升

29、高；DNA加合物數(shù)據(jù)應(yīng)根據(jù)內(nèi)源性加合物的已知背景水平進(jìn)行解釋分析；與毒性相關(guān)的間接作用可能影響DNA鏈斷裂試驗(yàn)（如彗星試驗(yàn)和堿洗脫試驗(yàn)）的結(jié)果。因此評(píng)價(jià)遺傳毒性數(shù)據(jù)時(shí)應(yīng)考慮所有的毒理學(xué)和血液學(xué)發(fā)現(xiàn)（注釋13）。與毒理學(xué)改變相關(guān)的間接作用可能有一個(gè)安全范圍，且可能不具有臨床相關(guān)性。（三）陽(yáng)性結(jié)果追加研究策略1.對(duì)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的追加以下討論基于細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)結(jié)果為陰性。1.1 追加機(jī)制/體內(nèi)試驗(yàn)體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞試驗(yàn)為陽(yáng)性結(jié)果且無(wú)充分證據(jù)以排除生物學(xué)相關(guān)性時(shí)，建議進(jìn)行追加試驗(yàn)以提供試驗(yàn)證據(jù)。可進(jìn)行附加的體外試驗(yàn)或進(jìn)行兩種合適的體內(nèi)試驗(yàn)，具體如下：（1）進(jìn)行附加的體外試驗(yàn)。體外試驗(yàn)可

30、為陽(yáng)性結(jié)果缺乏生物學(xué)相關(guān)性提供機(jī)制信息，如小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)中誘導(dǎo)染色體畸變或突變的受試物不是DNA損傷性物質(zhì)的證據(jù)（如：除細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)外的其他突變/DNA損傷試驗(yàn)結(jié)果為陰性；化學(xué)結(jié)構(gòu)上的考慮），或者體內(nèi)可能不相關(guān)或可能具有閾值的間接機(jī)制的證據(jù)（如抑制DNA合成、僅在高濃度時(shí)產(chǎn)生活性氧簇等）。體外微核試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的追加試驗(yàn)也可采用類似的試驗(yàn)，或者證據(jù)還可包含提示染色體丟失/非整倍體的已知機(jī)制、著絲點(diǎn)染色試驗(yàn)（注釋14）提示染色體丟失。多倍體是體外染色體畸變?cè)囼?yàn)中的一種常見(jiàn)現(xiàn)象。雖然非整倍體劑可誘導(dǎo)多倍體產(chǎn)生，但僅多倍體產(chǎn)生并不能提示受試物具有誘導(dǎo)非整倍體的潛力，而可能僅提示細(xì)胞周期紊亂；多

31、倍體也常常與細(xì)胞毒性的升高有關(guān)。如果在體外試驗(yàn)中僅見(jiàn)多倍體，而未見(jiàn)結(jié)構(gòu)上的染色體斷裂，一個(gè)確保具有合適暴露的體內(nèi)微核試驗(yàn)的陰性結(jié)果，通?？商峁┎痪哂袧撛诜钦扼w誘導(dǎo)作用的充分證據(jù)。如果上述機(jī)制信息和證據(jù)權(quán)重分析支持受試物不具有相關(guān)的遺傳毒性，僅需要一個(gè)具有合適暴露證據(jù)的體內(nèi)試驗(yàn)，以確定受試物不具有遺傳毒性作用。通常采用體內(nèi)細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)，而且，當(dāng)對(duì)潛在染色體丟失進(jìn)行追加研究時(shí)要求進(jìn)行體內(nèi)微核試驗(yàn)。（2）進(jìn)行兩項(xiàng)合適的體內(nèi)試驗(yàn)，通常采用不同的組織，并有支持暴露的證據(jù)。如果無(wú)充分的證據(jù)或機(jī)制信息以排除相關(guān)的潛在遺傳毒性，通常要求進(jìn)行兩項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn)，需要采用合適的終點(diǎn)指標(biāo)和合適的組織（通常是兩種不同組

32、織），且應(yīng)在體內(nèi)獲得充分的暴露。終點(diǎn)指標(biāo)充分合理并且證明有暴露的合適的體內(nèi)試驗(yàn)的陰性結(jié)果，足以證明受試物不具有遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。 1.2 依賴于S9的體外試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的追加當(dāng)陽(yáng)性結(jié)果僅見(jiàn)于S9代謝活化條件下，首先應(yīng)確認(rèn)是否是代謝活化的原因而非其他一些不同條件（如，與非代謝活化培養(yǎng)條件下的10%血清濃度相比，S9混合物中血清濃度低或無(wú)血清）。因此追加策略的目的是確定體外結(jié)果與體內(nèi)條件的相關(guān)性，通常采用肝臟體內(nèi)試驗(yàn)（注釋15）。2.對(duì)體內(nèi)微核試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的追加若體內(nèi)微核升高，應(yīng)對(duì)所有的毒理學(xué)資料進(jìn)行評(píng)價(jià)，以確定是否是由于非遺傳毒性作用所致或非遺傳毒性作用是其中的一個(gè)作用因素。如果懷疑存在干擾紅細(xì)胞生成

33、作用或生理學(xué)的非特異性因素（如體溫偏低或過(guò)高），進(jìn)行一項(xiàng)體內(nèi)染色體畸變?cè)囼?yàn)更為合適。如果懷疑一個(gè)升高的結(jié)果，應(yīng)進(jìn)行研究以證明該升高是否是由于染色體丟失或染色體斷裂所致（注釋14）。有證據(jù)顯示非整倍體誘導(dǎo)作用，如紡錘體抑制劑，具有非線性劑量反應(yīng)關(guān)系。因此，可能可確定該作用是否有閾值暴露（低于該暴露下預(yù)期不會(huì)有染色體丟失），以及確定與臨床暴露比較是否存在合適的安全范圍?？傊茉囄餄撛谶z傳毒性的評(píng)價(jià)應(yīng)考慮所有結(jié)果，并認(rèn)識(shí)到體外與體內(nèi)試驗(yàn)各自的內(nèi)在價(jià)值及局限性。（四）與致癌性試驗(yàn)的腫瘤發(fā)現(xiàn)有關(guān)的追加遺傳毒性試驗(yàn)在遺傳毒性標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中呈陰性結(jié)果，但在致癌性試驗(yàn)中顯示腫瘤發(fā)生率升高，而且無(wú)充分證據(jù)確定

34、是非遺傳毒性作用機(jī)制的受試物，應(yīng)在合適的模型上進(jìn)行附加的遺傳毒性試驗(yàn)。為了幫助了解作用方式，附加試驗(yàn)可包括改變體外試驗(yàn)的代謝活化條件，或包括測(cè)定腫瘤誘導(dǎo)靶器官遺傳學(xué)損傷的體內(nèi)試驗(yàn)，如DNA鏈斷裂試驗(yàn)（如彗星試驗(yàn)或堿洗脫試驗(yàn)）、DNA加合試驗(yàn)（如通過(guò)32P-后標(biāo)記）、轉(zhuǎn)基因突變誘導(dǎo)試驗(yàn)，或腫瘤相關(guān)基因遺傳學(xué)改變的分子特征性分析。（五）綜合分析與評(píng)價(jià)當(dāng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性時(shí)，對(duì)進(jìn)入臨床試驗(yàn)是否安全，應(yīng)考慮所有的安全性資料，包括對(duì)所有遺傳毒性資料的全面評(píng)價(jià)，以及擬進(jìn)行的臨床試驗(yàn)的性質(zhì)。對(duì)于遺傳毒性試驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果、但不直接與DNA發(fā)生作用的受試物，不全都會(huì)帶來(lái)明顯的體內(nèi)給藥的風(fēng)險(xiǎn)。因此，當(dāng)遺傳毒性

35、試驗(yàn)出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果時(shí)，建議提供有關(guān)遺傳毒性機(jī)制的證據(jù)以及這種機(jī)制與預(yù)期體內(nèi)暴露的相關(guān)性，或者通過(guò)試驗(yàn)排除為直接與DNA作用的機(jī)制，如證明受試物不使DNA烷化或DNA鏈斷裂，并提供未觀察到遺傳毒性的劑量水平。若確認(rèn)受試物可直接損傷DNA，在極特殊情況下，可能會(huì)被允許用于危及生命的疾?。ㄈ缤砥诎┌Y），但不能在健康受試者中使用。五、參考文獻(xiàn)1.ICH. S2(R1)：Guidance on genotoxicity testing and data interpretation for pharmaceuticals intended for human use. 20112. ICH. M3 (R2

36、): Non-clinical safety studies for the conduct of human clinical trials and marketing authorization for pharmaceuticals. 20093.FDA. Guidance for industry and review staff: Recommended approaches to integration of genetic toxicology study results. 20064.OECD. Guideline for testing of chemicals No.471

37、： Bacterial reverse mutation test.19975.OECD. Guideline for testing of chemicals No.473：In Vitro mammalian chromosomal aberration test. 20166.OECD. Guideline for testing of chemicals No.474：Mammalian erythrocyte micronucleus test. 20167.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 475：Mammalian bone

38、 marrow chromosome aberration test. 20168.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 476: In vitro mammalian cell gene mutation tests using the Hprt and xprt genes. 20169.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 487：In vitro mammalian cell micronucleus test. 201610.OECD. Guideline for testing

39、of chemicals No. 488：Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. 201311.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 489：In vivo mammalian alkaline comet assay. 201612.OECD. Guideline for testing of chemicals No. 490：In vitro mammalian cell gene mutation tests using the thymidine k

40、inase gene. 2016六、注釋注釋1：盡管只有少數(shù)但仍有一定數(shù)量的遺傳毒性致癌劑能被骨髓染色體損傷試驗(yàn)檢出，而在標(biāo)準(zhǔn)組合所列出的體外試驗(yàn)中卻得到陰性、弱陽(yáng)性或相互矛盾的結(jié)果。丙卡巴肼、對(duì)苯二酚、氨基甲酸乙酯、苯等致癌劑即為此類物質(zhì)。注釋2：雖然兩種標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合同等適合，但是某些受試物的特異性信息提示應(yīng)首選其中一種組合。例如，如果動(dòng)物上的全身暴露與預(yù)期臨床暴露相當(dāng)或更低，應(yīng)進(jìn)行體外試驗(yàn)即組合一；當(dāng)預(yù)期在肝臟產(chǎn)生短暫的活性代謝物時(shí)，推薦采用包含有一項(xiàng)肝臟體內(nèi)試驗(yàn)的組合二。注釋3：某些具有遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)的化合物被認(rèn)為與致癌和/或致突變潛力有因果關(guān)系。警示結(jié)構(gòu)包括烷化親電子中心、不穩(wěn)定過(guò)氧

41、化物、芳香胺、偶氮結(jié)構(gòu)、N-亞硝基基團(tuán)、芳香硝基基團(tuán)。注釋4：對(duì)有特殊警示結(jié)構(gòu)的幾類化合物，如含有偶氮基團(tuán)的分子、糖苷類、活化需要還原硝基的化合物如硝基咪唑類、代謝活化需要不同的嚙齒類動(dòng)物S9的化合物如非那西汀，為最適合檢測(cè)遺傳毒性，采用特殊的方案調(diào)整或附加試驗(yàn)是非常重要的。注釋5：靶組織：此處特指體內(nèi)試驗(yàn)的檢測(cè)目標(biāo)組織，如小鼠骨髓微核試驗(yàn)中的骨髓。注釋6：采用皮膚和結(jié)腸進(jìn)行誘導(dǎo)微核的體內(nèi)試驗(yàn)已有一些經(jīng)驗(yàn)，而且在這些組織中進(jìn)行DNA損傷試驗(yàn)也是一種合適的替代方法。注釋7：此處所指最高濃度的確定主要針對(duì)化學(xué)藥物，因中藥、天然藥物所包含范圍寬且情況復(fù)雜，在合適時(shí)可參考化學(xué)藥物的最高濃度的確定原則進(jìn)

42、行設(shè)計(jì)，不合適時(shí)需根據(jù)具體情況進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)。注釋8：雖然微核的形成源于受試物與紡錘體相互作用導(dǎo)致整條染色體分裂的滯后，但微核試驗(yàn)無(wú)法檢測(cè)所有非整倍體誘導(dǎo)劑。更特異的非整倍體誘導(dǎo)檢測(cè)方法之一是采用快速、靈敏的技術(shù)分析個(gè)體（嚙齒類動(dòng)物）分裂間期核中的染色體，如熒光原位雜交（FISH）方法。注釋9：原則上，造血細(xì)胞的微核可采用任何動(dòng)物種屬的骨髓，以及循環(huán)系統(tǒng)中的含微核紅細(xì)胞不會(huì)被脾臟清除的動(dòng)物種屬的外周血進(jìn)行評(píng)價(jià)。在小鼠上，微核可通過(guò)血中的嗜多染紅細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)小鼠持續(xù)給藥約4周或更長(zhǎng)時(shí)間時(shí)也可采用成熟紅細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。雖然大鼠可快速清除循環(huán)中的含微核紅細(xì)胞，但是大鼠血液網(wǎng)織紅細(xì)胞中可檢測(cè)到由一系

43、列斷裂劑和非整倍體劑誘導(dǎo)的微核，因此大鼠外周血也可用于微核分析，但所采用方法學(xué)需確保能分析新生網(wǎng)織紅細(xì)胞且方法學(xué)經(jīng)過(guò)充分驗(yàn)證。注釋10：在某些情況下，動(dòng)物單次或多次給予受試物后取外周血淋巴細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，可檢測(cè)中期相染色體畸變，就如同可采用骨髓中期相細(xì)胞一樣。因?yàn)檠h(huán)中的淋巴細(xì)胞是不可復(fù)制的，所以該試驗(yàn)系統(tǒng)無(wú)法檢測(cè)需要通過(guò)細(xì)胞復(fù)制才能顯示出遺傳毒性作用的受試物（如某些核苷類似物）。由于一些淋巴細(xì)胞壽命相對(duì)較長(zhǎng)，原則上它們具有體內(nèi)蓄積未修復(fù)DNA損傷的潛力，這使得細(xì)胞在體外受到刺激進(jìn)行分裂時(shí)畸變率升高。體內(nèi)淋巴細(xì)胞試驗(yàn)可用于斷裂劑指征的追加研究，但是，對(duì)于造血細(xì)胞微核試驗(yàn)，采用其他組織（如肝臟）的

44、試驗(yàn)通?？裳a(bǔ)充提供更多信息量，因?yàn)楦闻K中藥物和代謝物的暴露通常更高。注釋11：在標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中包含第二項(xiàng)體內(nèi)試驗(yàn)，是為了通過(guò)一種對(duì)受試物和/或其代謝物具有良好暴露的組織來(lái)確證受試物不具有遺傳毒性。另外，一小部分被認(rèn)為有遺傳毒性的致癌劑在肝臟試驗(yàn)中結(jié)果為陽(yáng)性，但在體內(nèi)骨髓細(xì)胞遺傳學(xué)試驗(yàn)中結(jié)果卻為陰性。這些案例很可能反映了缺乏合適的代謝活性或缺乏活性中間體傳遞至骨髓造血細(xì)胞。注釋12：骨髓是血液灌流性良好的組織，故血液或血漿中受試物相關(guān)物質(zhì)的水平與骨髓中水平相似。無(wú)論何種給藥途徑，肝臟對(duì)于有全身暴露的受試物預(yù)期會(huì)有暴露。注釋13：微核升高可發(fā)生于未給予任何遺傳毒性物質(zhì)時(shí)，而是由于紅細(xì)胞生成的干擾（

45、如再生障礙性貧血、髓外造血作用）、應(yīng)激、體溫偏低或體溫過(guò)高所致。脾臟功能的改變可影響含微核細(xì)胞從血液中的清除，可導(dǎo)致循環(huán)中的含微核紅細(xì)胞數(shù)量輕微升高。注釋14：確定微核誘導(dǎo)是否主要由于染色體丟失或染色體斷裂所致，試驗(yàn)應(yīng)包括對(duì)體外或體內(nèi)微核染色以確定著絲粒是否存在，例如，在著絲粒位置的DNA序列采用有探針的熒光原位雜交（FISH），或者采用抗著絲粒蛋白的標(biāo)記抗體。如果大多數(shù)誘導(dǎo)的微核是著絲粒陽(yáng)性，這提示有染色體丟失。但是，需要注意，強(qiáng)微管毒物如秋水仙堿和長(zhǎng)春堿為一種特殊情況，它們雖然不會(huì)產(chǎn)生100%著絲粒陽(yáng)性的微核，但典型的著絲粒陽(yáng)性微核超過(guò)70%80%，而在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中卻被公認(rèn)為主要是非整倍體誘

46、導(dǎo)劑。一種替代的方法是進(jìn)行一項(xiàng)體外或體內(nèi)中期相結(jié)構(gòu)畸變?cè)囼?yàn)，如果該試驗(yàn)結(jié)果是陰性，則提示微核誘導(dǎo)與染色體丟失有關(guān)。注釋15：標(biāo)準(zhǔn)誘導(dǎo)的S9混合物比人S9具有更高的活化能力，并且缺乏相解毒能力，除非添加特異性的輔助因子。此外，在體外測(cè)試底物濃度很高時(shí)可發(fā)生非特異的代謝活化作用。采用人S9或其他人類相關(guān)的代謝活化系統(tǒng)進(jìn)行遺傳毒性試驗(yàn)是有用的。分析遺傳毒性試驗(yàn)中培養(yǎng)物的代謝產(chǎn)物特性，與非臨床種屬（非誘導(dǎo)的微粒體或肝細(xì)胞，或體內(nèi)）或來(lái)自于人體樣本的已知代謝產(chǎn)物特性進(jìn)行比較，也可有助于確定試驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)性。而且，追加試驗(yàn)通常采用肝臟的體內(nèi)試驗(yàn)。在S9存在條件下體外試驗(yàn)得到陽(yáng)性結(jié)果的受試物，在體內(nèi)可能不誘

47、導(dǎo)遺傳毒性，因?yàn)椴恍纬纱x產(chǎn)物或形成極微量，或被代謝性解毒或快速排泄，這種情況可提示缺乏體內(nèi)風(fēng)險(xiǎn)。注釋16：小鼠淋巴瘤細(xì)胞試驗(yàn)為一種體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞Tk基因突變?cè)囼?yàn)。除小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞外，人淋巴母細(xì)胞TK6細(xì)胞也可用于檢測(cè)Tk基因位點(diǎn)突變。目前，TK6試驗(yàn)已納入OECD指導(dǎo)原則，但是，對(duì)于該試驗(yàn)，目前積累的試驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)較少，且未進(jìn)行充分的方法學(xué)驗(yàn)證。在該試驗(yàn)經(jīng)過(guò)充分的方法學(xué)驗(yàn)證后才可用于藥物注冊(cè)目的。推薦的標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組合中的遺傳毒性試驗(yàn)方法注：以下方法中所提供的最高濃度和最高劑量設(shè)計(jì)原則主要針對(duì)化學(xué)藥物，中藥、天然藥物由于情況復(fù)雜，應(yīng)綜合考慮多方面因素，不能簡(jiǎn)單套用該原則，試驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)具體

48、情況進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)。（一）細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)（Bacterial reverse mutation test）1.菌株組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門(mén)氏菌和/或色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型埃希氏大腸桿菌，至少應(yīng)包含下述五種菌株組合（除特殊說(shuō)明外，均為鼠傷寒沙門(mén)氏菌）：（1）TA98；（2）TA100；（3）TA1535；（4）TA1537或TA97或TA97a；（5）TA102或大腸埃希桿菌WP2 uvrA或大腸埃希桿菌WP2 uvrA（pKM101）。菌株特性鑒定需符合要求，80或液氮凍存?zhèn)溆谩?.濃度至少應(yīng)包含5個(gè)可用于結(jié)果分析的濃度。最高濃度主要取決于受試物對(duì)細(xì)菌的毒性和/或溶解度：（1）對(duì)于可溶性的無(wú)細(xì)菌

49、毒性的受試物，推薦的最高濃度一般為5mg/皿（液體受試物為5µl/皿）。 （2）對(duì)于可溶性的有細(xì)菌毒性的受試物，應(yīng)根據(jù)細(xì)菌毒性情況確定最高濃度（詳見(jiàn)正文1.2.2）。（3）對(duì)于難溶性的受試物，若未觀察到細(xì)菌毒性，一般以最小沉淀濃度為評(píng)價(jià)的最高濃度；若觀察到濃度相關(guān)性的細(xì)菌毒性或誘變性，則要求檢測(cè)多個(gè)產(chǎn)生沉淀的濃度（詳見(jiàn)正文1.2.3）。3.代謝活化一般采用誘導(dǎo)劑，如Aroclor 1254或苯巴比妥和-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)處理后的哺乳動(dòng)物肝臟微粒體酶（S9）進(jìn)行體外代謝活化試驗(yàn)，即在加S9和不加S9平行條件下測(cè)試。S9在S9混合液中的濃度一般為5%30%（v/v）。4.對(duì)照代謝活化或非代謝

50、活化條件下，均應(yīng)設(shè)立平行陰性（空白對(duì)照和/或溶劑對(duì)照）和陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照物應(yīng)為已知的菌株特異性的陽(yáng)性致突變劑。5.方法可采用標(biāo)準(zhǔn)平板摻入法或預(yù)培養(yǎng)法，受試物處理后4872小時(shí)觀察結(jié)果。每一濃度至少平行三皿。6.結(jié)果判定結(jié)果中應(yīng)描述各濃度組細(xì)菌毒性大小和沉淀情況；結(jié)果表示為每皿的回復(fù)突變菌落數(shù)，并計(jì)算各組的均值和標(biāo)準(zhǔn)差。至少在一個(gè)菌株上，在有或無(wú)代謝活化條件下，受試物所誘發(fā)的回復(fù)突變菌落數(shù)出現(xiàn)濃度依賴性的增加和/或在一個(gè)或多個(gè)濃度組上出現(xiàn)可重復(fù)性的增加，可判定為陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)果判定時(shí)應(yīng)首先考慮試驗(yàn)結(jié)果的生物學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有助于結(jié)果的評(píng)價(jià)。（二）體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)（In vitr

51、o mammalian chromosomal aberration test）1.細(xì)胞可采用哺乳動(dòng)物或人的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，如CHL細(xì)胞、CHO細(xì)胞、TK6細(xì)胞、人外周血淋巴細(xì)胞等，細(xì)胞系需定期檢查核型和有無(wú)支原體污染等。-80或液氮凍存?zhèn)溆谩?.濃度至少應(yīng)包含3個(gè)可用于結(jié)果分析的濃度。最高濃度主要取決于受試物的細(xì)胞毒性和/或溶解度。（1）對(duì)于可溶性的無(wú)細(xì)胞毒性的受試物，推薦的最高濃度一般為1 mM或0.5 mg/ml （選用較低者）。（2）對(duì)于可溶性的有細(xì)胞毒性的受試物，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞毒性大小確定最高濃度。最高濃度所產(chǎn)生的細(xì)胞毒性應(yīng)達(dá)到約50%但無(wú)需超過(guò)50%。對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞，可采用相對(duì)群體倍增

52、數(shù)（Relative population doubling，RPD）和相對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)數(shù)（Relative increase in cell count，RICC）的減少來(lái)反映細(xì)胞毒性；對(duì)培養(yǎng)的人外周血淋巴細(xì)胞，可通過(guò)有絲分裂指數(shù)（Mitotic Index，MI）的降低來(lái)反映細(xì)胞毒性。 （3）對(duì)于難溶性的受試物，一般采用最小沉淀濃度為最高濃度。對(duì)最高濃度之下的其他濃度，對(duì)于細(xì)胞毒性小或無(wú)的受試物，一般濃度間距為23倍；對(duì)于有細(xì)胞毒性的受試物，所選擇的濃度應(yīng)覆蓋產(chǎn)生細(xì)胞毒性的范圍，并且包括具有中度或少/無(wú)細(xì)胞毒性的濃度；在一些情況下，如具有較陡峭的濃度反應(yīng)關(guān)系，則可適當(dāng)縮小濃度間距或?qū)z測(cè)的濃度

53、加至3個(gè)以上。每一濃度一般平行2皿；若能獲得足夠細(xì)胞數(shù)，可用單皿，尤其當(dāng)超過(guò)3個(gè)檢測(cè)濃度時(shí)。3.代謝活化一般采用誘導(dǎo)劑，如Aroclor 1254或苯巴比妥和-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)處理后的哺乳動(dòng)物肝臟微粒體酶（S9）進(jìn)行體外代謝活化試驗(yàn)，即在加S9和不加S9平行條件下測(cè)試。S9在試驗(yàn)介質(zhì)中的終濃度一般為1%10%（v/v）。4.對(duì)照代謝活化或非代謝活化條件下，均應(yīng)設(shè)立平行陰性（空白對(duì)照和/或溶劑對(duì)照）和陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照物應(yīng)為已知的陽(yáng)性誘變劑。5.方法處理及細(xì)胞收獲時(shí)間：在代謝活化或非代謝活化條件下，受試物和細(xì)胞作用36小時(shí)，在1.5個(gè)正常細(xì)胞周期時(shí)收獲細(xì)胞；在非代謝活化條件下，受試物和細(xì)胞還應(yīng)持

54、續(xù)作用至1.5個(gè)正常細(xì)胞周期時(shí)收獲細(xì)胞。對(duì)于某些受試物，與細(xì)胞接觸時(shí)間/收獲細(xì)胞時(shí)間可能要大于1.5個(gè)正常細(xì)胞周期。讀片分析：一般油鏡下每種濃度至少觀察300個(gè)分散良好的分裂中期相細(xì)胞，若觀察到大量染色體畸變細(xì)胞，分析細(xì)胞數(shù)可相應(yīng)減少。應(yīng)分別記錄各組含有結(jié)構(gòu)畸變?nèi)旧w的細(xì)胞數(shù)和畸變類型，染色單體型與染色體型畸變應(yīng)分別記錄并記錄亞型（斷裂、交換）。裂隙應(yīng)單獨(dú)記錄，但不計(jì)入畸變率中。同時(shí)應(yīng)單獨(dú)記錄多倍體和內(nèi)復(fù)制等數(shù)目畸變，但不計(jì)入畸變率中。6.結(jié)果判定結(jié)果中應(yīng)描述各濃度組細(xì)胞毒性大小和沉淀情況；結(jié)果表示為染色體結(jié)構(gòu)畸變細(xì)胞的百分率。受試物在任一處理?xiàng)l件下至少一個(gè)濃度時(shí)染色體畸變率顯著升高，升高具有

55、濃度依賴性，且畸變率在陰性對(duì)照歷史范圍之外，可判定為陽(yáng)性結(jié)果。結(jié)果判定時(shí)應(yīng)首先考慮試驗(yàn)結(jié)果的生物學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析有助于結(jié)果的評(píng)價(jià)。如果結(jié)果不是明確的陽(yáng)性或陰性結(jié)果，或者為了幫助確定結(jié)果的生物學(xué)意義，應(yīng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行專家同行評(píng)議和/或進(jìn)一步研究。分析更多的細(xì)胞（當(dāng)可行時(shí)），或者通過(guò)改變?cè)囼?yàn)條件進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)（如改變?cè)囼?yàn)濃度間距、改變代謝活化條件等）可能是有用的。應(yīng)單獨(dú)記錄多倍體和內(nèi)復(fù)制的發(fā)生率。多倍體數(shù)目的增加提示受試物可能會(huì)抑制有絲分裂或誘導(dǎo)染色體數(shù)目畸變。出現(xiàn)染色體內(nèi)復(fù)制的細(xì)胞數(shù)增多提示受試物可能會(huì)影響細(xì)胞周期。（三）體外小鼠淋巴瘤細(xì)胞Tk基因突變?cè)囼?yàn)（In vitro mouse lympho

56、ma cell Tk gene mutation assay，MLA）1.細(xì)胞通常采用小鼠淋巴瘤L5178Y tk+/- -3.7.2 C細(xì)胞（注釋16）。細(xì)胞系需定期檢查核型或有無(wú)支原體污染等，必要時(shí)進(jìn)行自發(fā)突變細(xì)胞的清除。-80或液氮凍存?zhèn)溆谩?.濃度至少應(yīng)包含4個(gè)可用于結(jié)果分析的濃度。最高濃度主要取決于受試物的細(xì)胞毒性和/或溶解度：（1）對(duì)于可溶性的無(wú)細(xì)胞毒性的受試物，推薦的最高濃度一般為1mM或0.5mg/ml （選用較低者）。（2）對(duì)于可溶性的有細(xì)胞毒性的受試物，應(yīng)根據(jù)細(xì)胞毒性大小確定最高濃度，最高濃度應(yīng)能產(chǎn)生80%90%的細(xì)胞毒性。通過(guò)相對(duì)總生長(zhǎng)率（Relative total g

57、rowth，RTG）來(lái)反映細(xì)胞毒性。（3）對(duì)于難溶性的受試物，若無(wú)細(xì)胞毒性，一般采用最小沉淀濃度作為最高濃度；即使細(xì)胞毒性出現(xiàn)在最小沉淀濃度以上，一般建議只檢測(cè)1個(gè)沉淀濃度，因?yàn)槌恋砜赡墚a(chǎn)生干擾。對(duì)最高濃度之下的其他濃度，對(duì)于細(xì)胞毒性小或無(wú)的受試物，一般濃度間距為23倍；對(duì)于有細(xì)胞毒性的受試物，所選擇的濃度應(yīng)覆蓋產(chǎn)生細(xì)胞毒性的范圍，并且包括具有中度或少/無(wú)細(xì)胞毒性的濃度；在一些情況下，如受試物具有較陡峭的濃度反應(yīng)關(guān)系，可適當(dāng)縮小濃度間距或?qū)z測(cè)的濃度增加至4個(gè)以上。3.代謝活化一般采用誘導(dǎo)劑，如Aroclor 1254或苯巴比妥和-萘黃酮聯(lián)合誘導(dǎo)處理后的哺乳動(dòng)物肝臟微粒體酶（S9）進(jìn)行體外代謝

58、活化試驗(yàn)，即在加S9和不加S9平行條件下測(cè)試。S9在試驗(yàn)介質(zhì)中的終濃度一般為1%10%（v/v）。4.對(duì)照代謝活化或非代謝活化條件下，均應(yīng)設(shè)立平行陰性（空白對(duì)照和/或溶劑對(duì)照）和陽(yáng)性對(duì)照組。陽(yáng)性對(duì)照物應(yīng)為已知的陽(yáng)性誘變劑。5.方法一般采用微孔法或軟瓊脂法進(jìn)行試驗(yàn)。以微孔法為例：處理時(shí)間：在代謝活化或非代謝活化條件下，一般受試物與細(xì)胞作用34小時(shí)。如果作用34小時(shí)后結(jié)果為陰性，還需進(jìn)行在非代謝活化條件下作用24小時(shí)的附加試驗(yàn)。突變表達(dá)期：受試物與細(xì)胞作用結(jié)束后，去除受試物，將細(xì)胞重懸于培養(yǎng)液中，一般L5178Y細(xì)胞的突變表達(dá)期為2天。分別在處理結(jié)束后及表達(dá)期結(jié)束后測(cè)定平板接種效率以評(píng)價(jià)細(xì)胞毒性。突變率測(cè)定：表達(dá)期結(jié)束后，將細(xì)胞接種于含有突變選擇劑三氟胸苷（TFT）的96孔板中進(jìn)行TFT抗性突變集落的測(cè)定。如果受試物出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，需要