1、硬膜外腔植入髓核對大鼠脊髓背根神經節(jié)TNF-和IL-1表達的影響首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院疼痛診療科，100053張挺杰首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院疼痛診療科，100053通訊作者：張挺杰（首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院疼痛診療科，100053）作者簡介：張挺杰，男，醫(yī)學博士后，副主任醫(yī)師 倪家驤 張春雷 李娟紅 于翠萍摘要目的：觀察硬膜外腔植入異體髓核對大鼠L6-S1脊髓背根神經節(jié)細胞TNF-和IL-1表達的影響，以期為椎間盤源性疼痛發(fā)病機制提供細胞生物學基礎。方法：24只雄性SD大鼠（體重260280 g）隨機分為四組：脂肪生理鹽水組（FS組）、脂肪膠原酶組（FE）、髓核生理鹽水組（NS）、髓核膠原酶組（NE組）

2、，每組 n=6。術后第15天取L6-S1脊髓背根神經節(jié)，采用免疫組織化學染色方法觀察髓核對背根神經節(jié)細胞炎性介質TNF-和IL-1表達的影響。結果：術后15天FE組大鼠與FS組相比，背根神經節(jié)細胞TNF-表達沒有顯著性差異（P0.05）；NS組與FE組相比背根神經節(jié)細胞TNF-表達顯著增加（P0.05）；NE組與NS組相比背根神經節(jié)細胞TNF-表達顯著降低（P0.05），接近于FS組水平（P0.05）。IL-1在各組大鼠背根神經節(jié)中未染色。結論：硬膜外腔植入異體髓核可引起背根神經節(jié)細胞TNF-表達增加。關鍵詞髓核；背根神經節(jié)；TNF-；IL-1Effect of nucleus pulposu

3、s allografted into epidural space on the expressions of TNF- and IL-1 in rats DRG neuronsAbstract Objective: To observe the effect of nucleus pulposus allografted into the epidural space on the expressions of TNF- and IL-1 in rats DRG neurons, so as to provide theoretical evidence for discogenic pai

4、n. Methods: Twenty-four male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups with 6 rats in each: fat + nature saline group(FS group), fat + collagenase group (FE group), nucleus pulposus + nature saline group(NS group), and nucleus pulposus + collagenase group (NE group). The allografted

5、 fat and nucleus pulposus were provided by the other 8 male SD rats. 15 days after surgery, the L6-S1 DRGs were seperated, and the expressions of TNF- and IL-1 in DRGs were detected by using immunohistochemistry method. Results: 15 days after surgery, the expressions of TNF- in DRGs in NS group was

6、stronger than FE group (P0.05); but the expressions of TNF- in NE goup was less than NS without significant difference compared with FS group (P0.05). Conclusion: Nucleus pulposus allografted into the epidural space can increase the TNF- expressions in rats DRG.Authors address Dept. of Pain Medicine

7、, Xuanwu Hospital of Capital Medical University, Beijing, 100053Key words Nucleus pulposus; Dorsal root ganglion; TNF-; IL-1椎間盤突出可引發(fā)根性神經痛，其發(fā)生機制主要包括椎間盤直接壓迫神經根和繼發(fā)的免疫炎癥反應導致神經根炎，目前認為，后者在椎間盤源性疼痛中發(fā)揮更為重要的作用。本研究通過硬膜外腔植入異體髓核，觀察脊髓背根神經節(jié)細胞炎性細胞因子TNF-和 IL-1的表達，為椎間盤源性疼痛的機制提供依據。1 材料與方法1.1 動物選擇SD雄性大鼠24只，SPF級，體重26028

8、0 g，隨機分為四組：脂肪生理鹽水組（FS組）脂肪膠原酶組（FE組）、髓核生理鹽水組（NS組）和髓核膠原酶組（NE組），每組 n=6。另外8只雄性SD大鼠用來提供異體脂肪和髓核組織。所有動物由北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部提供（許可證號SCXK(京) 20020001）。1.2 主要試劑大鼠抗IL-1抗體 (503503, BioLegend)兔抗TNF-多克隆抗體(BA0131, 武漢博士德生物工程有限公司) 1.3 大鼠硬膜外腔開放手術制備動物按400 mg/kg體重100 g/L水合氯醛腹腔注射麻醉后，做背側中線4050 mm縱行切口，暴露L6-S1棘突，鈍性分離兩旁骶脊肌，切除

9、S1棘突，清晰暴露L6-S1兩側關節(jié)突關節(jié)和椎孔，用顯微鉗鈍性分離硬膜暴露硬膜外腔，根據實驗分組，分別于硬膜外腔植入異體脂肪（約34 mg）生理鹽水（20l），異體脂肪（約34 mg）膠原酶（20l, 125萬u/ml），異體髓核（約34mg）生理鹽水（20l），異體髓核（約34mg）膠原酶（20l, 125萬u/ml），然后逐層縫合肌肉、筋膜和皮膚。所有植入物在放入硬膜外腔前攪拌至糊狀，在37°C下孵育3小時。1.4 異體脂肪和髓核的采集和植入大鼠深麻后處死，取腹膜外脂肪和尾椎間盤髓核，根據實驗分組分別植入大鼠硬膜外腔。1.5 標本制備四組實驗組大鼠術后15天，在水合氯醛腹腔注射深

10、度麻醉后，開胸暴露心臟，在心尖處剪一小口，用灌注針穿刺入主動脈，同時剪開右心耳引流。先用200ml生理鹽水灌注沖洗，然后用4多聚甲醛緩沖液200ml灌注固定。手術解剖右側L6-S1椎間孔，取出背根神經節(jié)放入4多聚甲醛緩沖液固定。1.6指標檢測標本石臘包埋，順序切片，厚度為5m，采用免疫組織化學方法測定背根神經節(jié)TNF-和IL-1表達，黃褐色為陽性表達。1.7 圖像分析所有切片在顯微鏡下拍照，采用Axioplan 2 imaging 系統(tǒng) (ZEISS，德國)，Axiocam 數(shù)碼相機分辨率 1200萬（3900×1590）像素進行圖像分析。分析過程：(1)輸圖；(2)圖像增強 陰影校

11、正和對比度增強，選擇測量區(qū)域；(3)圖像分隔 設定陽性輝度閾值，計算機自動識別，最后畫面整理；(4)結果分析 根據陽性面積占整個測量面積百分比，計算出陽性率。1.8 統(tǒng)計學分析計量資料表示為均數(shù)±標準差（±S），采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析。組間比較One-way ANOVA方差分析，運用GLM過程，P<0.05認為差異有顯著性。2 結果2.1 背根神經節(jié)TNF-表達：術后15天FE組大鼠與FS組相比，背根神經節(jié)細胞TNF-表達沒有顯著性差異（P0.05）；NS組與FE組相比背根神經節(jié)細胞TNF-表達顯著增加（P0.05），陽性染色多見于大、中體積細胞；NE組與NS組

12、相比背根神經節(jié)細胞TNF-表達顯著降低（P0.05），接近于FS組水平（P0.05）。見圖1和圖2。FS組FE組NS組NE組 圖2. 背根神經節(jié)TNF-免疫組化染色 X2002.2 背根神經節(jié)IL-1表達：各組大鼠背根神經節(jié)IL-1未見陽性染色。見圖3。FS組FE組NS組NE組 圖3. 背根神經節(jié)IL-1免疫組化染色 X2003 結論硬膜外腔植入異體髓核可引起背根神經節(jié)細胞TNF-表達增加，提示髓核可引起背根神經節(jié)細胞內部炎癥。4 討論目前認為，腰椎間盤突出對神經根的機械性壓迫不是引起根性疼痛和功能異常的惟一原因1。動物實驗顯示，髓核植入硬膜外腔可產生神經根炎，導致神經傳導速度的降低、軸索水腫

13、和雪旺細胞的變化以及痛覺過敏2,3。背根神經節(jié)(DRG) 是軀體初級感覺神經元細胞體的聚集處,是傷害性感受處理的初級中樞，由大小不同、電生理特征各異的大、中和小神經元組成。一般來說,直徑較大的神經元主要是非傷害性感受的A和A纖維,而直徑較小的神經元則為傷害性感受的A和C 類纖維4,5。但髓核引發(fā)的神經根炎癥是否會造成背根神經節(jié)細胞內部的炎癥變化未見報道。TNF-和IL-1是兩種重要的炎性細胞因子，參與多種組織的損傷和免疫炎癥反應。Onda A等6研究顯示，抗TNF-抗體可部分逆轉髓核誘發(fā)的背根神經節(jié)細胞傷害性放電。Olmarker K等7研究發(fā)現(xiàn)，TNF-參與了髓核引發(fā)的脊神經根結構和功能變化

14、。Hiroshi T等8運用放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法發(fā)現(xiàn)，在人的椎間盤突出周圍組織中IL-1、IL-6和TNF-含量增加。本研究結果發(fā)現(xiàn)，異體髓核植入硬膜外腔可引起大鼠相應背根神經節(jié)TNF-表達增加，而應用膠原酶孵化髓核后這種效應消失，提示髓核中的膠原蛋白等物質是造成背根神經節(jié)TNF-表達增加的物質基礎。關于IL-1在背根神經節(jié)中未染色可能存在兩種情況：(1) IL-1不適于免疫組化分析，(2) IL-1沒有參與髓核引發(fā)的背根神經節(jié)細胞內部病理生理變化過程，還有待于進一步研究。參考文獻1. Boden SD, Davis DO, Dina TS, et al. Abnormal magnet

15、ic resonance scans of the lumbar spine in asymptomatic subjects: A prospective investigation. J Bone Joint Surg 1990;72:403-82. Kawakami M, Weinstein JN, Spratt KF, et al. Experimental lumbar radiculopathy: Immunohistochemical and quantitative demonstrations of pain induced by lumbar nerve root irri

16、tation of the rat. Spine 1994;19:1780-941. Olmarker K,Rydevik B,Nordborg C. Autologous nucleus pulposus induces neurophysiologic and histologic changes in porcine cauda equina nerve roots. Spine 1993;18:1425-322. Rose MA, Kam PCA. Gabapentin: pharmacology and its use in pain management. Anaesthesia,

17、 2002; 57: 451-462.3. Armijo JA, Pena MA, Adin J, et al. A ssociation between patient age and gabapentin serum concentration-to-dose ratio: a preliminary multivariate analysis. Ther Drug Monit, 2004;26(6):633-637.4. Onda A, Yabuki S, Kikuchi S. Effects of neutralizing antibodies to tumor necrosis factor-alpha on nucleus pulposus-induced abnormal nociresponses in rat dorsal horn neurons. Spine. 2003;28(10):967-72.5. Olmarker K, Rydevik B. Selective inhibition of tumor necrosis factor-alpha prevents nucleus pulposus-induced thrombus formation, intraneural edema, a