1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上抑菌試驗(yàn)1 定義抑菌試驗(yàn)，用于測定抗菌藥物體外抑制細(xì)菌生長效力的試驗(yàn)稱為抑菌試驗(yàn)抑菌活性的研究實(shí)驗(yàn)方案。實(shí)驗(yàn)方法1. 紙片法（抑菌圈法）將測定菌株接種到培養(yǎng)基中，置37度條件下培養(yǎng)6-24小時(shí)，取出備用。再用無菌吸管吸取上述培養(yǎng)液0.1ml，再用三角刮刀將菌液涂勻。待培養(yǎng)基表面稍干后，用無菌小鑷子分別取出所需的藥敏紙片均勻地貼在培養(yǎng)基的表面，輕輕壓平，各紙片間應(yīng)有一定距離，并分別做上標(biāo)記。將培養(yǎng)皿置37度恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)18-24小時(shí)后，測量各種藥敏紙片抑菌圈直徑的大小。2. 挖孔法（1） 在平板上打孔，然后將藥液滴入孔內(nèi)，用經(jīng)酒精燈滅菌的接種環(huán)挑取適量細(xì)菌培養(yǎng)物，以劃線

2、方式將細(xì)菌涂布到平皿培養(yǎng)基上。具體方式：用滅菌接種環(huán)取適量細(xì)菌分別在平皿邊緣相對四點(diǎn)涂菌，以每點(diǎn)開始劃線涂菌至平皿的1/2，依次劃線，自至細(xì)菌均勻密布于平皿（將測定菌株接種到培養(yǎng)皿中，置37度條件下培養(yǎng)18-24小時(shí)，用滅菌的棉拭子將帶將細(xì)菌混懸液涂布于平皿培養(yǎng)基表面。要求涂布均勻）。（2） 以無菌操作將滅菌的不銹鋼小管，（外徑4mm，孔徑與孔距均為3mm，管的兩端要光滑，也可用玻璃管和瓷管），放置在培養(yǎng)基上打孔，將孔中的培養(yǎng)基用針頭挑出，并以火焰封底，使培養(yǎng)基能充分的與平皿融合（3） 加樣時(shí)，按不同藥液加樣，用無菌滴管將樣品加至滿而不溢為止。3. 牛津杯法（1） 雙碟的制備方法：將滅菌培養(yǎng)基

3、溶化后取15ml倒入滅菌平皿內(nèi)。吸取待測菌株的菌液1-5ml與100ml冷至45度的培養(yǎng)基混勻，然后分別每一平皿加入5ml。并均勻攤布在具有底層培養(yǎng)基的平皿內(nèi)。（2） 待培養(yǎng)基凝固后，在每碟中均勻立放小鋼管（及牛津杯）4個(gè)，用陶瓦蓋覆蓋。（3） 將下列實(shí)驗(yàn)藥液分別加入小鋼管中，置37度培養(yǎng)18-24小時(shí)，量取抑菌圈大小，判定抗菌藥物抑菌作用的強(qiáng)弱。乳酸菌的抑菌實(shí)驗(yàn)1產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)乳酸菌的初篩采用紙片法。將培養(yǎng)好的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、蠟樣芽孢桿菌培養(yǎng)液 OD 600分別調(diào)整到 0.17、0.19、0.10，各取 100L 接種于 LB 固體培養(yǎng)基，涂布均勻，固定1h。加入滅菌濾紙圓片。取過

4、濾滅菌的培養(yǎng)上清液 50L 滴加到濾紙圓片上。平板于37培養(yǎng) 12h。測量抑菌圈直徑，每個(gè)菌株做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，求均值。挑選出紙片周圍具有較大抑菌圈及發(fā)酵產(chǎn)物具有廣譜抗性的菌株進(jìn)行下一步試驗(yàn)。2產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)乳酸菌的復(fù)篩-牛津杯法在培養(yǎng)皿中加25mL LB固體培養(yǎng)基，凝固后，分別吸取0.2mL指示菌稀釋液于固體培養(yǎng)基中，用滅菌推棒涂抹均勻，在每個(gè)平皿中等距離放置牛津杯4個(gè)，每個(gè)牛津杯中加入200L初篩出的乳酸菌上清液，于37培養(yǎng)12h。若在牛津杯周圍出現(xiàn)抑菌圈，則表明該乳酸菌具有抑菌活性，并用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，每個(gè)菌株做三個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，求均值。抑菌物質(zhì)的確定1酸抑制作用的排除用乳酸和鹽酸分別

5、調(diào)蒸餾水、MRS液體的pH值分別為3.0、4.0、4.5、5.0、6.0，做各種指示菌的抑菌實(shí)驗(yàn)，確定對照pH值。挑取發(fā)酵產(chǎn)物對5種指示菌都有抑菌作用的菌株，接種于1mLMRS液體，30靜置培養(yǎng)24h，再取100L到10mL MRS液體，30靜置培養(yǎng)48h，1×104r/min離心1min后，測其pH值，并用1mol/L NaOH和1mol/L HCl將其離心發(fā)酵上清液調(diào)至對照pH值，做對各種指示菌的抑菌實(shí)驗(yàn)。2過氧化氫作用的排除過氧化氫酶溶解在50mmol /L 的磷酸緩沖液( pH=7.0 )中配成母液,加入到發(fā)酵液中使過氧化氫酶的終濃度為5mg/mL,在37水浴中溫育2h后取出

6、,檢測過氧化氫酶處理后發(fā)酵液的抑菌活性。3蛋白酶解檢測用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶對篩選出的菌株進(jìn)行酶分解實(shí)驗(yàn)，先用1mol/LNaOH和1mol/LHCl分別調(diào)發(fā)酵液到胰蛋白酶、木瓜蛋白酶的最適作用pH7.0，按1mg/mL加入胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，37水浴2h，再將pH值調(diào)回6.5（對照pH值），做對各種指示菌的抑菌實(shí)驗(yàn)。產(chǎn)細(xì)菌素乳酸菌的鑒定通過rep-pcr已經(jīng)將菌種進(jìn)行種水平的鑒定，將重復(fù)的菌進(jìn)行從大到小的范圍縮小，方便細(xì)菌素菌株的鑒定。生長曲線的測定本實(shí)驗(yàn)用分光光度計(jì)對已經(jīng)鑒定產(chǎn)細(xì)菌素的細(xì)菌進(jìn)行光電比濁測定不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)菌懸浮液的OD值，繪制生長曲線(l)標(biāo)記:取無菌大試管,用記號筆分別標(biāo)

7、明培養(yǎng)時(shí)間;(2)接種:(3)培養(yǎng):將己接種的試管置搖床37e培養(yǎng)，分別培養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后取出放入冰箱中貯存；(4)比濁測定:用未接種的MRS液體培養(yǎng)基作空白對照，選用6O0nm波長測定吸光值，同時(shí)測定pH值。記錄。三、試驗(yàn)方法（一）平板抑菌試驗(yàn)（真菌）將絲瓜傷流液過濾除菌，定量加在PDA培養(yǎng)基中配制成平板，對照組分別在培養(yǎng)基中加入域絲瓜傷流液等量的無菌水。真菌在PDA平板上培養(yǎng)5d，自菌落邊緣用滅菌打孔器取直徑4.5mm的圓形菌塊，移到制備好的含傷流液的平板中央，25培養(yǎng)，測量菌落半徑，根據(jù)測量結(jié)果計(jì)算抑菌率。（二）抑菌實(shí)驗(yàn)濾紙片法（細(xì)菌）1、 菌懸液制備將供試菌種在各自適合的斜面培養(yǎng)基上和適宜

8、的溫度條件下(細(xì)菌37, 霉菌28 )于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)活化(細(xì)菌24 h,霉菌48 h), 備用。將活化后的供試斜面培養(yǎng)基用10 mL 無菌生理鹽水稀釋制成含菌量為106108 個(gè)/ mL 的菌懸液。2、 絲瓜傷流液濾紙片的制備及處理細(xì)濾紙,用鋼筆套按一個(gè)圓印,剪下(一次剪4個(gè)),盡量剪圓。置于三角瓶中,塞上棉塞,高壓蒸汽滅菌后浸泡于絲瓜傷流液中, 2 h后用無菌鑷子夾出,在瓶口瀝去多余絲瓜傷流液,即可貼入剛接種的器皿上。貼入時(shí)標(biāo)記起始位置,按順時(shí)針或逆時(shí)針方向?qū)V紙片順序貼入。3、 抑菌試驗(yàn)分別將配制好并已經(jīng)滅菌的各種固體培養(yǎng)基趁熱分別倒入無菌培養(yǎng)皿中, 每皿1520 mL(各皿量要相同), 冷卻凝固后用吸管吸取0.3 mL 被試菌液, 加到平