1、CpGN ODN對(duì)CpGS ODN誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF的抑制作用         08-03-20 16:09:00     編輯：studa20             作者：蔣為薇 王良喜 丁國富 余雙江【摘要】  目的 明確抑制性CpG ODN 208(CpGN ODN)對(duì)刺激性CpG ODN 1826(CpGS ODN)誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)

2、胞分泌TNF的影響，為通過拮抗細(xì)菌DNA達(dá)到防治膿毒癥的目的提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法 選用本室前期篩選出的對(duì)CpGS ODN活化RAW 264.7細(xì)胞有抑制作用的CpGN ODN，觀察其對(duì)CpGS ODN誘導(dǎo)hPBMC釋放TNF的影響；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)觀察CpGN ODN對(duì)CpGS ODN與hPBMC表面結(jié)合和內(nèi)化的影響。結(jié)果 濃度比為11的CpGN ODN對(duì)刺激性CpGS ODN誘導(dǎo)hPBMC分泌TNF具有抑制作用，并呈一定時(shí)效關(guān)系；CpGN ODN對(duì)CpGS ODN在hPBMC細(xì)胞表面的結(jié)合和內(nèi)化具有抑制作用。結(jié)論 CpGN ODN對(duì)CpGS ODN活化hPBMC具有抑制作用，這個(gè)作用可能與其影響

3、hPBMC的表面結(jié)合和內(nèi)化CpGS ODN有關(guān)。 【關(guān)鍵詞】  膿毒癥 抑制性CpG ODN 刺激性CpG ODN TNF 表面結(jié)合 內(nèi)化    ABSTRACT  Objective  To study the influence of CpG ODN 208 (CpGN ODN) on TNF release from hPBMC induced by CpGS ODN 1826 (CpGS ODN).  Methods  CpGN ODN, selected by the previous work in o

4、ur lab, can inhibit TNF release from RAW264.7 induced by CpGS ODN. The influence of CpGN ODN on TNF release from hPBMC induced by CpGS ODN was measured by ELISA. The effects of CpGN ODN on the surface binding and internalization of CpGS ODN were tested by flow cytometry.  Results   Cp

5、GN ODN could inhibit TNF release from hPBMC induced by CpGS ODN at the concentration ratio 11 in a timedependent manner. CpGN ODN could inhibit the surface binding and internalization of CpGS ODN. Conclusion  CpGN ODN could inhibit TNF release from hPBMC induced by CpGS ODN, which partly attrib

6、uted to inhibition of CpGN ODN on the surface binding and internalization of CpGS ODN.    KEY WORDS  Sepsis;  CpGN ODN;  CpGS ODN;  TNF;  Surface binding;  Internalization    膿毒癥(sepsis)是一種嚴(yán)重創(chuàng)傷和感染的引起全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response

7、syndrome，SIRS)，由其發(fā)展來的多器官功能不全綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)病死率高達(dá)30%50%，但目前尚無有效的防治措施1。細(xì)菌基因組DNA(細(xì)菌DNA)是SIRS的主要啟動(dòng)因子之一。未甲基化CpG的寡核苷酸片段(CpG oligonucleotides，CpG ODN)是細(xì)菌DNA的免疫刺激作用的最小作用單位，廣泛存在于細(xì)菌DNA中2。細(xì)菌DNA之所以被哺乳動(dòng)物視作異己成分而啟動(dòng)防御反應(yīng)，是因?yàn)槠溆兄c不如DNA明顯不同的結(jié)構(gòu)特征：細(xì)菌DNA中的CpG二核苷酸出現(xiàn)的頻率約為1/16，而哺乳動(dòng)物DNA中的CpG二核苷酸出

8、現(xiàn)的頻率僅為1/64，并且80%發(fā)生甲基化3。研究者們發(fā)現(xiàn)只有含有未甲基化CpG為核心的特定六核苷酸序列的CpGODN才具有刺激性， 這些特定的六核苷酸被稱為刺激性CpG基序(stimulatory CpG motif，CpGS ODN)3。Krieg等通過對(duì)Adv2 DNA、Adv5 DNA、Adv12 DNA和大腸埃希菌DNA發(fā)現(xiàn)部分CpG ODN對(duì)細(xì)胞的刺激活性較弱，并能對(duì)CpGS ODN活化細(xì)胞有抑制作用，因此推斷這些序列可能是中和性CpG基序(neutralizing CpG motif；CpGN ODN)4。由于上述研究中發(fā)現(xiàn)的CpGN ODN活性并不穩(wěn)定，因此在Krieg的研究基

9、礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步尋找并得到有效的CpGN ODN：CpG ODN 208(5TGCCGCGGCAGA3)，CpG ODN 208對(duì)RAW264.7細(xì)胞的刺激活性較弱，并對(duì)CpGS ODN活化的細(xì)胞具有抑制作用。因此，本研究以CpGN ODN和CpGS ODN共同誘導(dǎo)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(human peripheral blood mononuclear cells，hPBMC)，觀察CpGN ODN對(duì)CpGS ODN誘導(dǎo)hPBMC分泌TNF的影響，進(jìn)一步探討其可能的作用機(jī)制。    1  材料和方法    1.1 

10、 材料    全硫代修飾的CpG ODN 208(CpGN ODN)：5TGCCGCGGCAGA3，由大連寶生物公司合成；全硫代修飾的CpG ODN 1826(CpGS ODN)：5TCCCTGACGTTCCTGACGTT3和6FAM標(biāo)記的CpG ODN 1826由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。淋巴細(xì)胞分離液購自挪威AxisShield公司，比重1.077。RPMI 1640培養(yǎng)液購自Hyclone公司，胎牛血清購自PAA公司。人TNF檢測(cè)試劑盒購自Bioscience公司。實(shí)驗(yàn)用移液管，吸管，離心管等玻璃器材均經(jīng)260高溫3h去熱原處理；培養(yǎng)板購自BD公司，無熱

11、原，一次性使用。    1.2  hPBMC的分離    按淋巴細(xì)胞分離液說明書進(jìn)行，密度梯度離心法。無菌靜脈穿刺采血，肝素抗凝。在8ml離心管中加3m1淋巴細(xì)胞分離液，取5m1抗凝血加到分離液液面上，2000r/min離心15min。小心吸取中間白膜層，轉(zhuǎn)到新的離心管內(nèi)，用冷生理鹽水洗滌2次，1500r/min離心6min棄上清，加2m1 RPMI 1640培養(yǎng)液(含10%胎牛血清、100u/ml青霉素、100u/ml鏈霉素)，吹勻制成細(xì)胞懸液備用。    1.3  CpGN ODN

12、抑制CpGS ODN誘導(dǎo)hPBMC分泌細(xì)胞因子的作用    調(diào)整hPBMC懸液濃度為1×106/ml，取0.2ml細(xì)胞懸液加于96孔板內(nèi)，置37 CO2溫箱培養(yǎng)2h，同時(shí)加入0、10、20、30、40、50g/ml CpGN ODN和10g/ml的CpGS ODN，每組設(shè)3復(fù)孔，另設(shè)陽性對(duì)照組加入100ng/ml LPS，置37繼續(xù)培養(yǎng)8h，取100l上清，所有上清立即進(jìn)行ELISA檢測(cè)TNF。    1.4  CpGN ODN抑制CpGS ODN誘導(dǎo)hPBMC分泌細(xì)胞因子的時(shí)效關(guān)系  

13、0; 按上述方法將hPBMC加于96孔板后，置37 CO2溫箱培養(yǎng)2h，CpGN ODN相對(duì)于CpGS ODN的時(shí)相點(diǎn)分別為-2、-1、0、1和2h，CpGN ODN和CpGS ODN均為10g/ml，每組3復(fù)孔，另設(shè)陽性對(duì)照組，0時(shí)相點(diǎn)加入100ng/ml LPS。置37繼續(xù)培養(yǎng)8h后取100l上清測(cè)定TNF。    1.5  CpGN ODN與CpGS ODN預(yù)孵對(duì)hPBMC分泌細(xì)胞因子的影響實(shí)驗(yàn)    按上述方法將hPBMC加于96孔板后，置37 CO2溫箱培養(yǎng)2h，將一組CpGN ODN和CpGS ODN各10g/m

14、l預(yù)孵2h，另一組的CpGN ODN和CpGS ODN不預(yù)孵，直接加入hPBMC中，每組3復(fù)孔。置37繼續(xù)培養(yǎng)8h后取100l上清測(cè)定TNF。    1.6  CpGN ODN對(duì)hPBMC表面結(jié)合CpGS ODN的影響    調(diào)整hPBMC懸液濃度為1×106/ml，按每孔0.5ml加入24孔板內(nèi)，同時(shí)加入10g/ml的CpGN ODN和56FAMCpGS ODN；另設(shè)陽性對(duì)照：加入10g/ml的56FAMCpGS ODN；陰性對(duì)照：未加任何處理。4避光繼續(xù)培養(yǎng)30min后取出，采用流式技術(shù)檢測(cè)。 

15、60;  1.7  CpGN ODN對(duì)hPBMC內(nèi)化CpGS ODN的影響    調(diào)整hPBMC懸液濃度為1×106/ml，按每孔0.5ml加入24孔板內(nèi)，同時(shí)加入10g/ml的CpGN ODN和56FAMCpGS ODN；另設(shè)陽性對(duì)照：加入10g/ml的56FAMCpGS ODN；陰性對(duì)照：未加任何處理。37避光繼續(xù)培養(yǎng)2h后取出，采用流式技術(shù)檢測(cè)。    1.8  統(tǒng)計(jì)學(xué)處理    所得數(shù)據(jù)均以±s表示，應(yīng)用Microsoft Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析處

16、理，P<0.05為有顯著性差異。    2  結(jié)果    2.1  CpGN ODN抑制CpGS ODN誘導(dǎo)hPBMC分泌TNF的作用    加人不同濃度(1050g/ml)CpGN ODN后，當(dāng)CpGN ODN與CpGS ODN濃度比為11時(shí)，hPBMC釋放細(xì)胞因子的作用受到抑制(P<0.05)；而其它比例劑量時(shí)未見抑制作用，但也無協(xié)同或相加作用。因此我們?cè)?1的濃度比條件下研究其量效關(guān)系：提前和與CpGS ODN同時(shí)給CpGN ODN均可抑制hPBMC分泌細(xì)胞因子(P<0.05)，且抑制效果相當(dāng)，約為25%；延后給則未見抑制效應(yīng)(Fig.1)。    2.2  CpGN ODN與CpGS ODN不直接結(jié)合和相互作用    為觀察CpGN ODN對(duì)CpGS ODN的抑制作用是否因?yàn)槠渲苯幼饔靡?，將CpGN ODN與Cp