1、1小鼠糖化血紅蛋白（GHb）酶聯(lián)免疫分析（ELISA ）試劑盒使用說明書關(guān)液體樣本中糖化血紅蛋白（GHb 含量實(shí)驗(yàn)原理：本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中小鼠糖化血紅蛋白（GHb）水平。用純化的小鼠糖化血紅蛋白（GHb） 抗體包被微孔板， 制成固相抗體， 往包被單抗的微孔中依次加入糖化血紅 蛋白 （GHb） ，再與 HRP 標(biāo)記的糖化血紅蛋白（GHb）抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合 物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的糖化血紅蛋白（GHb）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（0

2、D 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中小鼠糖化血紅蛋白（GHb）濃度。試劑盒組成：試劑盒組成48 孔配置96 孔配置保存說明書1 份1 份圭寸板膜2 片( 48)2 片(96)密封袋1 個(gè)1 個(gè)酶標(biāo)包被板1X481X962-8C保存標(biāo)準(zhǔn)品：3600 nmol/L0.5mlX1 瓶0.5mlX1 瓶2-8C保存標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液1.5mlX1 瓶1.5mlX1 瓶2-8C保存酶標(biāo)試劑3 mlX1 瓶6 mlX1 瓶2-8C保存樣品稀釋液3 mlX1 瓶6 mlX1 瓶2-8C保存顯色劑 A 液3 mlX1 瓶6 mlX1 瓶2-8C保存顯色劑 B 液3 mlX1 瓶6 mlX1 瓶2-8C保存終止液3mlX

3、1 瓶6mlX1 瓶2-8C保存濃縮洗滌液(20mlX20 倍)X1 瓶(20mlX30 倍)X1 瓶2-8C保存樣本處理及要求：1血清：室溫血液自然凝固10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。2血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA、者檸檬酸鈉或肝素作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再 次離心。3尿液：用無菌管收集，離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、

4、腦脊液參照實(shí)行。4細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí)，用無菌管收集。離心20 分鐘左右（2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（ PH7.2-7.4 ）稀釋細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度達(dá)到 100 萬/ml 左右。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份。離心20 分鐘左右（ 2000-3000 轉(zhuǎn) /分）。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測(cè)定小鼠血清，血漿及相25.組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量。加入一定量的PBS， PH7.4 。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持 2-8C的溫度。加入一定量的 PBS （

5、 PH7.4）,用手工或勻漿器將 標(biāo)本勻漿充分。 離心 20 分鐘左右 （ 2000-3000 轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清。 分裝后一份待檢測(cè)， 其余冷凍備用。操作步驟1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋與加樣：在酶標(biāo)包被板上設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔 10 孔，在第一、第二孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品 100M，然后在第一、第二孔中加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50d，混勻；然后從第一孔、第二孔中各取 100d分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50d,混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50dl 棄掉，再各取 50dl 分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50d分別加到

6、第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液50d，混勻后從第七、第八孔中分別取 50dl 加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標(biāo)準(zhǔn) 品稀釋液 50d，混勻后從第九第十孔中各取50d棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50d,濃度分別為 2400nmol/L， 1600nmol/L ， 800nmol/L， 400nmol/L ， 200 nmol/L ）。2.加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液40d,然后再加待測(cè)樣品 10d（樣品最終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕

7、晃動(dòng)混勻。3.溫育：用封板膜封板后置 37C溫育 30 分鐘。4.配液：將 30 （48T 的 20 倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30 （48T 的 20 倍）倍稀釋后備用。5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，如此重復(fù) 5 次，拍干。6.加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50dl ，空白孔除外。7.溫育：操作同 3。8.洗滌：操作同 5。9.顯色：每孔先加入顯色劑A50d，再加入顯色劑 B50d，輕輕震蕩混勻，37C避光顯色15 分鐘.10.終止：每孔加終止液 50d，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。11.測(cè)定：以空白空調(diào)零， 450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（

8、OD 值）。 測(cè)定應(yīng)在加終止 液后 15分鐘以內(nèi)進(jìn)行。注意事項(xiàng)：1 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標(biāo)包被板開封后如未 用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。2 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。3 各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好 控制在 5 分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。4 請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，最好做復(fù)孔。如標(biāo)本中待測(cè)物質(zhì)含量過高（樣本OD 值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的 OD 值），請(qǐng)先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（ n 倍）后再測(cè)定，計(jì) 算時(shí)請(qǐng)最后乘以總稀釋倍數(shù)（XnX5）o

9、5 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。6.底物請(qǐng)避光保存。7 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).3&所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。9.本試劑不同批號(hào)組分不得混用。10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準(zhǔn)。 計(jì)算：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)， 0D 值為縱坐標(biāo)， 在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的0D值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋 倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 0D 值計(jì)算出標(biāo) 準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的0D 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋 倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。試劑盒性能：1樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R 值為 0

10、.95 以上。2批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和 11%檢測(cè)范圍：100 nm ol/L -3000nmol/L保存條件及有效期：1.試劑盒保存：;2-8Co2 有效期：6 個(gè)月4Mouse Glycated hemoglob inFOR RESEARCH USE ONLYDrug NamesGen eric Nam: Mouse Glycated hemoglobi(GHb) ELISA Kit.PurposeThis kit allows for the determ in ationof GHb concen trati onSn Mouse serum, blood plasma, ando

11、ther biological fluids.Principle of the assayThe kit assay Mouse GHb level in the sampuee Purified Mouse GHb antibody to coat microtiterplatewells, make solid-phasea ntibody,the n add GHb to wells, Combi nedGHb an tibody which With HRPlabeled ,become an tibody - an tige n - en zyme-a ntibody complex

12、, after wash ing Completely, Add TMBsubstrate soluti on, TMB substrate becomes blue color At HRP en zyme-catalyzed, reacti on is term inated by the additi on of a sulphuric acid soluti on and the color change is measuredspectrophotometricallyit a wavelength of 450 nm. The concentration of GHb in the

13、 samples is thendetermined by comparing the O.D. of the samples to the sta ndard curve.Materials provided with the kitMaterials providedwith the kit48determ in ations96 determ in atio nsStorageUser manual11Closure plate membrane22Sealed bags11Microelisa stripplate112-8CStandard3600 nmol/L0.5ml 1Xbot

14、tle0.5ml Kbottle2-8CStan dard dilue nt1.5mlXbottle1.5ml Kbottle2-8CHRP-Co njugatereagent3mlXbottle6ml 1 bottle2-8CSample dilue nt3ml 1 bottle6ml 1 bottle2-8CChromoge n Soluti onA3ml 1 bottle6ml 1 bottle2-8CChromoge n Soluti onB3ml 1 bottle6ml 1 bottle2-8C5Stop Soluti on3ml 1 bottle6ml 1 bottle2-8Cwa

15、sh solution(20mlX20fold)X1bottle(20mlX30foldX1bottle2-8CSpecimen requirements1. serum- coagulation at room temperature 10-20 ,meintrifugation 20-min at the speed of 2000-3000r.p.m. remove super nata nt. If precipitati on appeared, Cen trifugal aga in.2. plasma-use suitedEDTA,citrateor heparinizecpla

16、smaas an anticoagulant,miX0-20 mins ,centrifugatior20-min at the speed of 2000-3000r.p.m. remove super nata nt,If precipitation appeared,Centrifugal again.3. Urine collect sue a sterile container, cen trifugati on 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. removesupernata nt,If precipitati on appeared,

17、 Cen trifugalaga in. The Operatio n of Hydrothorax andcerebrosp inal fluid Refere nee to it.4. cell culture supernatan-detect secretorycomponentscollect sue a sterile container, cen trifugatior20-min at the speed of 2000-3000r.p.m. removesuper nata nt,detectie compositionof cells, Dilut cellsuspensi

18、orwith PBS(PH7.2-7.4 , Cell concentration reached 1 million / ml, repeatedfreeze-thawcycles, damage cells and release ofin tracellular comp onen ts, cen trifugati on 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. removesupernatant, If precipitation appeared, Centrifugal again.5. Tissue samples- After cutti

19、ng samples, check the weight,add(PPBHS7.2-7.4), Rapidlyfroze n with liquid n itroge n, mai ntain samples atQ-8fter melt in g,add PBSPH7.4 ,Homogenized by hand or Grinders, centrifugation 20-min at the speed of 2000-3000 r.p.m. removesupernatant.Assay procedure1. Dilute and add sample to Standard: se

20、t 10 Standard wells on the ELISA plates coated, addStandard 100 卩 l to the first and the second well, then add Stand50didilUrtithe first andthe second well, mix;kte out 100 卩 l form the first and the second well then add it to the thirdand the forth well separatelythen add Standarddilution 50 卩 to t

21、he third and the forthwell ,mix ; then take out 50卩 l from the third and the forth well discardh add 506the sixth well ,then add Standard dilL50)pl to the fifth and the sixth well, mix ; take out 50from the fifth and the sixth well and add to the seventh and the eighth well, then add Standarddilutio

22、n50 卩 l to the seventh and the eighth well ,mix ; take out 50卩 l from theseveneighth well and add to the ninth and the tenth well, add Sta ndard50liutionD the ninth andthe ten th well, mix , take out 50 m the nin thpahdcthe ten th wescard(add Sample 50 卩 l toeach well after Diluting ,(densi2ty4:00nm

23、ol/L ，1600nmol/L ， 800nmol/L ， 400nmol/L ，200nmol/L)2. add sample：Set blank wells separately(blank comparisonwells donatdd sampleandHRP-Conjugate reagent, other each step operation is same). testing sample well. add Samplediluti on40ytlo test in gsamplewel, the n add testi ng sample10y(samplefi nal

24、diluti onis5-fold), add sample to welldso,nt touch the well wall as far as poasnsidblGe,ently mix.3.ln cubate: After closi ng plate with Closure plate membra ne ,in cubate for 30tmin at 374. Configurate liquid: 30-fold (or 20-fold)wash solution diluted 30-fold (or 20-fold) with distilled water andre

25、serve.5. washing：Uncover Closure plate membrane, discard Liquid, dry by swing, add washing bufferto every well, still for 30s then drain, repeat 5 times, dry by pat.6. add enzym:Add HRP-Conjugate reagent l to each well, exceptank well.7.incubate：Operation with 3.8.washing：Operation with 5.9.color：Ad

26、d Chromogen Solution A 50ul and Chromogen Solution B to each well, evade thelight preservati on for 15 min at37lO.Stopthe reaction Add Stop Solutio50 卩1each well, Stop the react ion (theolue color change toyellow color).11.assay：take olank well as zero , Read aosoroance at 450nm after Adding Stop So

27、lution and within715min.Important notes1. The kit takes out from the refrigeration environment should oe oalanced 15-30 minutes in the roomtemperature, ELISA plates coated if has not use up after opened, the plate should oe stored inSealed oag.2. washingoufferwill Crystallizationseparation,it can oe heatedthe water helps dissolve when dilute .Washing does not affect the result.3. add Samplewith sam