1、中國(guó)食品添加劑分析測(cè)試ChinaFoodAdditives紫外分光光度法對(duì)嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的測(cè)定方法研究歐英杰,曾暖茜,馮志強(qiáng),許佩勤211(1.廣東省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)站,廣州󰀁510308;2.廣東省食品工業(yè)公共實(shí)驗(yàn)室,廣州󰀁510308)󰀁󰀁摘󰀁要:木瓜蛋白酶具有分解蛋白為氨基酸的能力,是市場(chǎng)上嫩肉粉的主要成分。本文通過(guò)測(cè)定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力大小,為判斷嫩肉粉質(zhì)量?jī)?yōu)劣提供參考依據(jù)。把嫩肉粉溶于鹽酸半胱氨酸溶液,取該混合液與酪蛋白溶液反應(yīng)10min,用紫外分光光度法測(cè)得反應(yīng)所生成酪氨酸的含量。該方法

2、具有較好的準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性,添加標(biāo)準(zhǔn)回收率為96󰀁8%105󰀁8%;且步驟簡(jiǎn)明,所需測(cè)試儀器簡(jiǎn)單。在該方法條件下,每分鐘水解酪蛋白生成1󰀁g酪氨酸所需樣品的量為1個(gè)酶活力單位。此種酶活力表述方式亦為國(guó)內(nèi)關(guān)于各種酶活力的表述所常用,便于酶活力數(shù)據(jù)的比較與換算。通過(guò)測(cè)定,發(fā)現(xiàn)市售各種嫩肉粉中木瓜蛋白酶的酶活力參差不齊,則嫩肉粉對(duì)肉類(lèi)的嫩化能力強(qiáng)弱亦有差別,體現(xiàn)在使用添加量的多少和對(duì)肉類(lèi)浸泡時(shí)間的長(zhǎng)短上。也有發(fā)現(xiàn)酶活力為0的,說(shuō)明該產(chǎn)品中的木瓜蛋白酶已失去活力,或者根本沒(méi)有添加木瓜蛋白酶,屬于偽劣商品。關(guān)鍵詞:紫外分光光度法;嫩肉粉;木瓜蛋白酶;酶活力中

3、圖分類(lèi)號(hào):TS207󰀁3󰀁󰀁󰀁文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A󰀁󰀁󰀁文章編號(hào):1006-2513(2010)02-0214-03Determinationofpapain󰀂senzymeactivityinmeattenderizerbyUVspectrophotometryOUYing󰀂jie,ZENGNuan󰀂xi,FENGZhi󰀂qiang,XUPei󰀂qin1211(1.GuangdongFoodQualitySu

4、pervisionandInspectionStation,Guangzhou510308;2.GuangdongProvincialPublicLaboratoryofFoodIndustry,Guangzhou510308)Abstract:Papaincandecomposeproteinintoaminoacidsandistheessentialingredientofmeattenderizer.Thispaperstudiedthedeterminationofpapains'enzymeactivityinmeattenderizer.Theresultscanbeus

5、edforestimatingthequal󰀂ityofmeattenderizer.DissolvemeattenderizerinL-cysteinehydrochloridemonohydratesolution,mixthemeatten󰀂derizersolutionandcaseinsolutionforchemicalreaction10minutesanddetectthecontentofreactionproducttyrosinebyUVSpectrophotometry.Thismethodjustneedssimpleequipment

6、andisconvenient,accurateandpractica.lThetheamountofmeattenderizerfordecomposingcaseinintorecoveryratewas96󰀁8%105󰀁8%.Undertheconditions,usedinhome,1󰀁gtyrosineperminuteisdefinedoneenzymeactivityunit.Thiskindofdefinitionaboutenzymeactivityisusuallysothedataisconvenientforcompare

7、andconversion.Afterdetermination,wefoundtheenzymeactivitydifferentmeattenderrizershaddifferentan󰀂ortheofpapainindifferentmeattenderizerssoldinmarketweredifferent,andthetendercapabilityofmeattenderizerswerealsodifferent.Sohowmuchtouseandhowlongtomarinatethemeat,swers.Wealsofoundsomeenzymeacti

8、vitywaszero,meattenderizerhadnotaddedpapain.Keywords:UVspectrophotometry;meattenderizer;papain;收稿日期:2009-05-08作者簡(jiǎn)介:歐英杰(1982-),男,本科,研究方向?yàn)槭称窓z驗(yàn)。thatindicatedthepapainhadlostitsenzymeactivity,enzymeactivity214󰀁分析測(cè)試中國(guó)食品添加劑ChinaFoodAdditives木瓜蛋白酶(PapainEC3󰀁4󰀁22󰀁2)屬于巰基蛋白酶,可水

9、解蛋白質(zhì)和多肽中精氨酸和賴(lài)氨酸的羧基端,并能優(yōu)先水解在肽鏈的N端具有2個(gè)羧基的氨基酸或芳香L氨基酸(如酪氨酸)的肽鍵。其最適作用pH為5󰀁07󰀁0,在中性或偏堿性時(shí)亦有作用,耐熱性強(qiáng)1稀釋到500mL,用前配制。三氯乙酸溶液:取三氯乙酸1󰀁8g,加乙酸鈉2󰀁99g和冰乙酸1󰀁9mL,加水溶解并稀釋至100mL。1󰀁3󰀁對(duì)照品和樣品的處理對(duì)照品溶液的制備:精密稱(chēng)取已在105!干燥至恒重的酪氨酸對(duì)照品適量,用0󰀁1mol/L鹽酸溶液制成每mL中約含40󰀁g

10、的溶液。供試品溶液的制備:取嫩肉粉約0󰀁5g,精密稱(chēng)定,加酶稀釋液攪拌,稀釋至100mL。1󰀁4󰀁測(cè)定法準(zhǔn)確量取供試品溶液各1󰀁0mL,分別置于2支10mL具塞試管中,于(37 0󰀁2)!水浴預(yù)熱5min,準(zhǔn)確加入(37 0󰀁2)!預(yù)熱的底物溶液5󰀁0mL,立即振搖,置(37 0󰀁2)!水浴中,精確反應(yīng)10min后,加三氯乙酸溶液5󰀁0mL,振搖,于(37 0󰀁2)!水浴中放置40min,用干燥濾紙過(guò)濾,濾液在2h內(nèi)采用分光光度法以水為

11、空白,在275nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度A;再精確量取供試品溶液1󰀁0mL,置于10mL具塞試管中,于(37 0󰀁2)!水浴預(yù)熱5min,加入三氯乙酸溶液5mL,振搖,置(37 0󰀁2)!水浴中,反應(yīng)10min后,準(zhǔn)確加入(37 0󰀁2)!預(yù)熱的底物溶液5󰀁0mL,振搖,于(37 0󰀁2)!水浴中放置40min,用干燥濾紙過(guò)濾,濾液在2h內(nèi)采用分光光度法以水為空白,在275nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度A0。另取酪氨酸對(duì)照溶液,以0󰀁1mol/L鹽酸溶液為空白,在275nm處測(cè)定吸收度An。1&

12、#983041;5󰀁結(jié)果計(jì)算W3A-A011n1000W10An。目前市場(chǎng)上嫩肉粉的成分主要是木瓜蛋白酶,木瓜蛋白酶通過(guò)分解膠原蛋白、彈性蛋白,降解膠原纖維和結(jié)締組織蛋白成為小分子的多肽甚至氨基酸,令肌肉肌絲和腰筋絲斷裂,因此嫩肉粉能使老牛肉、豬肚、臘肉等較堅(jiān)韌肉類(lèi)迅速嫩化,有利消化并提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,并可節(jié)省烹調(diào)時(shí)間與能源,適合飯店、賓館及家庭使用2。酶活力是酶性質(zhì)的重要參數(shù),顯示酶分解底物能力的強(qiáng)弱。木瓜蛋白酶酶活力的測(cè)定,采用不同底物衍生的測(cè)定方法也不同,所取得的數(shù)值也不能進(jìn)行直接比較。傳統(tǒng)的作法,木瓜蛋白酶是用明膠或血紅蛋白作底物來(lái)測(cè)定的。由于要求底物具有較高的專(zhuān)一性和便于

13、標(biāo)準(zhǔn)化,新的測(cè)定方法往往采用合成的N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)3。但以BAEE為底物的測(cè)定方法所涉4及到的儀器設(shè)備昂貴,成本偏高。本文采用以酪蛋白為底物的紫外光譜法來(lái)測(cè)定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的活力,該法所需測(cè)試儀器簡(jiǎn)單,步驟簡(jiǎn)明,容易掌握;并且該法也常被國(guó)內(nèi)用來(lái)測(cè)定各種酶的活力,所得的數(shù)據(jù)便于比較。對(duì)嫩肉粉中木瓜蛋白酶活力的測(cè)定,可為嫩肉粉質(zhì)量?jī)?yōu)劣提供一項(xiàng)重要的參考指標(biāo)。1󰀁實(shí)驗(yàn)部分1󰀁1󰀁儀器恒溫水浴鍋;751-GW分光光度計(jì)。1󰀁2󰀁試劑酪蛋白溶液:取酪蛋白0󰀁6g,加0󰀁

14、;05mol/L磷酸氫二鈉溶液80mL,置沸水浴中煮30min,時(shí)時(shí)攪拌,冷至室溫,加0󰀁1mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至7󰀁0 0󰀁1,用水稀釋至100mL,用前配制。酶稀釋液:取鹽酸半胱氨酸2󰀁635g,氯化鈉11󰀁7g,加水250mL溶解,另取乙二胺四乙酸二鈉1󰀁115g,加水100mL溶解,合并兩液混勻,用4󰀁0mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值到5󰀁5,加水酶活力(U/g)=式中:W3#對(duì)照品溶液每1mL中含酪氨酸的量,單位為微克(󰀁g);W#供試

15、品的取樣量,單位為毫克(mg);10#反應(yīng)時(shí)間;11#測(cè)定總體積;n#供試品的稀釋倍數(shù);1000#毫克與克的轉(zhuǎn)換倍數(shù)。在上述條件下,每分鐘水解酪蛋白生成1󰀁g酪氨酸所需的嫩肉粉的量為1個(gè)酶活力單位。215󰀁中國(guó)食品添加劑分析測(cè)試ChinaFoodAdditives2󰀁結(jié)果與討論2󰀁1󰀁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制用100󰀁g/mL的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,在275󰀁0nm處進(jìn)行測(cè)定,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),見(jiàn)圖1,以0󰀁1mol/L鹽酸溶液為空白。其回歸方程y=0󰀁

16、0075x-0󰀁0019,相關(guān)系數(shù)r=0󰀁9996。在酪氨酸濃度為0100󰀁g/mL范圍內(nèi),酪氨酸濃度與吸光度具有良好的線(xiàn)性關(guān)系。2󰀁4󰀁樣品的檢測(cè)與分析分別取市售不同嫩肉粉,按上述方法處理,測(cè)定其酶活力,結(jié)果見(jiàn)表3。表3󰀁樣品測(cè)試分析結(jié)果Tab󰀁3󰀁Resultsofanalysissample樣品名稱(chēng)嫩肉粉1嫩肉粉2嫩肉粉3嫩肉粉4酶活力(U/g)51645226965192370015981630平均酶活力(U/g)5195944401614結(jié)果表明,市售各種嫩

17、肉粉中木瓜蛋白酶活力參差不齊,則木瓜蛋白酶對(duì)肉類(lèi)的蛋白分解能圖1󰀁酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig󰀁1󰀁ThestandardcurveofTyrosine力也有較大差異,最終將影響到嫩肉粉的嫩化作用。其中,嫩肉粉2酶活力最高,其每次使用添加量少且肉類(lèi)浸泡時(shí)間短(見(jiàn)該產(chǎn)品的外包裝說(shuō)明);嫩肉粉1酶活力適中,其每次使用添加量比嫩肉粉2略多且肉類(lèi)浸泡時(shí)間也略長(zhǎng)(見(jiàn)該產(chǎn)品的外包裝說(shuō)明);嫩肉粉4酶活力較低,其每次使用對(duì)肉類(lèi)需浸泡較長(zhǎng)時(shí)間(見(jiàn)該產(chǎn)品的外包裝說(shuō)明)。嫩肉粉3酶活力為0,可能該產(chǎn)品里面的木瓜蛋白酶已失去活力,或者該產(chǎn)品根本就沒(méi)有添加木瓜蛋白酶,屬于偽劣商

18、品?？梢?jiàn),嫩肉粉酶活力的大小直接反映了該產(chǎn)品的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。2󰀁2󰀁精密度取市售嫩肉粉樣品1,做6個(gè)平行樣,由表1可知,酶活力相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2󰀁6%。表1󰀁精密度實(shí)驗(yàn)Tab󰀁1󰀁Theresultsoftheprecisiontest測(cè)量次數(shù)123456酶活力94879366893889729448930592532392󰀁6平均值標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD(%)3󰀁結(jié)論利用紫外分光光度法能準(zhǔn)確地測(cè)定嫩肉粉中木瓜蛋白酶的活力,該法樣品處理簡(jiǎn)便,所需儀器簡(jiǎn)單,步驟簡(jiǎn)明,能快速、直觀地測(cè)出嫩肉粉中木瓜蛋白酶分解肉類(lèi)蛋白能力的強(qiáng)弱,為判斷嫩肉粉產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)劣提供重要參考。參考文獻(xiàn):1張春紅.食品酶制劑及應(yīng)用M.