1、第六講 克隆基因的檢測(cè)與鑒定一、抗藥性標(biāo)記及其插入失活選擇法pBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗菌素抗性基因: Tetr和Ampr。 Tetr上有插入位點(diǎn)BamH I和Sal I; Ampr上有插入位點(diǎn)Pst I。1. 原理：（1）四環(huán)素：（2）氨芐青霉素抗性基因：產(chǎn)生-內(nèi)酰胺酶，使氨芐青霉素轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗝雇?，使?青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（藍(lán)灰色）褪色。抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，但不殺死細(xì)菌。殺死生長(zhǎng)的細(xì)菌，但不殺死停止生長(zhǎng)的細(xì)菌。（3）環(huán)絲氨酸：如果在Tetr上插入外源DNA，導(dǎo)致四環(huán)素抗性基因失活，可用四環(huán)素加環(huán)絲氨酸平板培養(yǎng)基選擇重組克隆。Tetr失活的菌生長(zhǎng)被四環(huán)素抑制，不被環(huán)絲氨

2、酸殺死，保留下來(lái)； Tetr不失活的菌抗四環(huán)素，能分裂生長(zhǎng)，反而被環(huán)絲氨酸殺死。（1）四環(huán)素抗性插入失活無(wú)環(huán)絲氨酸培養(yǎng)基如果Ampr上插入外源DNA，導(dǎo)致氨芐青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液選擇。-半乳糖苷酶 乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛藍(lán)+深藍(lán)色1. 原理：載體上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位點(diǎn)。 受體菌基因組中有突變的-半乳糖苷酶基因（片段缺失）。可以被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。 載體和受體菌基因組可以互補(bǔ)形成完整有功能的-半乳糖苷酶。假陽(yáng)性： 如果插入的外源DNA正好是3的倍數(shù)并且沒(méi)有中止密碼；（不破壞 肽）。-半乳糖苷

3、酶使X-gal分解成藍(lán)色產(chǎn)物。利用插入的外源基因的表達(dá)產(chǎn)物特性進(jìn)行直接選擇。（只在特定條件下）。轉(zhuǎn)化進(jìn)來(lái)的外源基因產(chǎn)物能夠彌補(bǔ)受體菌株的突變型缺陷。一、原理：1.彌補(bǔ)缺陷his-his+受體菌：外源基因：在不含組氨酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)小鼠的二輕葉酸還原酶（DHFR）對(duì)三甲氧芐二氨嘧啶有抗性。DHFR載體連接轉(zhuǎn)化受體菌三甲氧芐二氨嘧啶培養(yǎng)基平板含DHFR的克隆才能生長(zhǎng)例：使被轉(zhuǎn)化的受體菌表現(xiàn)出外源基因的表型。利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。一、直接電泳檢測(cè)法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。分子量 Marker載體重組克隆1. 原理：根據(jù)已知的外源DNA序列的限

4、制性酶切圖譜，選擇一兩種內(nèi)切酶切割質(zhì)粒，電泳后比較電泳結(jié)果（DNA帶數(shù)和長(zhǎng)度）?；蛴煤线m的內(nèi)切酶切下插入片斷，再用其它酶切這個(gè)片斷，電泳后比較結(jié)果是否符合預(yù)計(jì)的結(jié)果。ABA或B不同克隆的酶切結(jié)果1. 原理PCR能在模板序列上擴(kuò)增出預(yù)期DNA片斷。2. 過(guò)程（1）從重組克隆中提取質(zhì)粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片斷引物作PCR。（3）電泳PCR產(chǎn)物。（4）檢查是否有PCR產(chǎn)物。（5）PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度是否與外源基因一致。1. 核酸雜交一、原理：重組克隆與探針雜交。3. 識(shí)別標(biāo)記32P 或 125I 。（1）放射性同位素2. 檢測(cè)用的探針與外源DNA插入片斷互補(bǔ)的序列。（2）非放射性標(biāo)記熒光

5、素用DNA（或RNA）探針檢測(cè)DNA樣品。1. Southern blotting從宿主細(xì)胞中提取DNA（或質(zhì)粒載體），再用探針雜交。只有帶有插入片斷的重組載體才能與探針雜交，在底片上曝光顯示。酶切前酶切后插入片斷載體特點(diǎn)：對(duì)應(yīng)的菌斑或噬菌斑位置不變，可以直接找出陽(yáng)性菌落。DNA-RNA雜交。1）原理：2）選擇過(guò)程在70%甲酰胺中，把DNA雙鏈變性，復(fù)性的時(shí)候，DNA-RNA雜交分子比DNA-DNA雙鏈更穩(wěn)定。電鏡下可見(jiàn)一種R-環(huán)形結(jié)構(gòu)。用外源基因的mRNA與重組載體雜交。缺點(diǎn)：需要電鏡！用DNA（或RNA）探針檢測(cè)RNA樣品。主要檢測(cè)插入片斷是否被轉(zhuǎn)錄。從宿主細(xì)胞中提取RNA，再用探針雜交。

6、利用抗體作為“探針”來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)入受體菌并且表達(dá)出相應(yīng)的蛋白質(zhì)的外源基因。根據(jù)第一抗體（一抗）和第二抗體（二抗）的性質(zhì)可分為幾種作用方式：1. 抗體與產(chǎn)物的結(jié)合方式對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)。蛋白蛋白“雜交” 待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)記的二 抗結(jié)合蛋白固相支持濾膜待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗125I標(biāo)記的二抗固相支持濾膜待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗固相支持濾膜固相支持濾膜待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗125I 標(biāo)記的二抗 結(jié)合蛋白125I標(biāo)記的二抗質(zhì)粒基因A插入基因B表達(dá)質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B融合蛋白檢測(cè)融合蛋白。既檢測(cè)外源基因產(chǎn)物又檢測(cè)載體基因產(chǎn)物。固相支 持濾膜抗A抗體125I標(biāo)記的 抗B抗體質(zhì)粒蛋白A 外

7、源蛋白B質(zhì)粒蛋白A外源蛋白B固相支 持濾膜抗A抗體發(fā)光，底片曝光把非放射性抗體加到平板培養(yǎng)基中，當(dāng)插入基因的表達(dá)產(chǎn)物被細(xì)菌分泌到菌落周?chē)鷷r(shí)，就會(huì)與抗體反應(yīng)形成“沉淀圈”。1. 原理抗原抗體凝集反應(yīng)。檢測(cè)分泌型產(chǎn)物。2. 方法對(duì)于不能被分泌到菌體外的蛋白質(zhì)可先進(jìn)行原位溶菌處理（溶菌酶、原噬菌體誘發(fā)）。Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：一抗（primary antibody）: 與目標(biāo)分子的特異結(jié)合。 二抗（secondary antibody）： 與一抗的特異性結(jié)合。 酶連（enzyme-linke）： 二抗上攜帶一種酶能催化一種反應(yīng)將無(wú)色的底物轉(zhuǎn)變?yōu)?/p>

8、有色的物質(zhì)（或發(fā)光），再通過(guò)比色測(cè)定有色物質(zhì)的含量（或光強(qiáng)度），從而推測(cè)目標(biāo)分子的含量。待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗酶 待測(cè)基因 產(chǎn)物蛋白一抗二抗無(wú)色的底物有色的產(chǎn)物比色觀察酶 （1）固定樣品將待測(cè)樣品加入96孔微量滴定板（microtiter plate）的孔中，干燥后就被固定在孔底?？椎准尤胍豢?，反應(yīng)后沖洗掉未結(jié)合的抗體。一抗加入二抗，與一抗結(jié)合后再將未結(jié)合的二抗沖洗掉。二抗只識(shí)別一抗。二抗上聯(lián)著一種酶（堿性磷酸酶、過(guò)氧化物酶、脲酶等）。二抗加入無(wú)色的底物，被二抗上所帶的酶催化反應(yīng)轉(zhuǎn)變成有色物質(zhì)（或發(fā)光）。在特殊的分光光度儀（酶標(biāo)儀）上比色，打印出結(jié)果。有效，但準(zhǔn)確性稍差（主要取決于一抗的特

9、異性）。 必須與其他方法一起綜合考慮。最好用單克隆抗體（monoclonal antibody）臨床檢驗(yàn)常用的單抗1.原理：在蛋白質(zhì)凝膠電泳以后，用轉(zhuǎn)膜和免疫的方法檢測(cè)膠上的蛋白質(zhì)泳帶。（1）SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳 是蛋白質(zhì)的變性劑，使煮沸變性的蛋白質(zhì)維持線(xiàn)性狀態(tài)，并與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)帶上負(fù)電荷。 SDS:（SDS-PAGE）：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在電場(chǎng)的作用下線(xiàn)性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動(dòng)，移動(dòng)的速率主要取決于其分子量大小（鏈的長(zhǎng)短），從而把不同分子量的肽鏈分開(kāi)。電泳buffer電泳buffer點(diǎn)樣電泳方向已知分子量的蛋

10、白質(zhì)混合液，與待測(cè)樣品一起電泳，為樣品蛋白質(zhì)提供分子量估計(jì)。商品化供應(yīng)Da道爾頓(質(zhì)量單位, 等于一氧原子質(zhì)量的十六分之一。 一克約為61023道爾頓DaltonSDS PAGE考馬斯亮藍(lán)： 靈敏度底、只能檢出0.3-1g/帶，但可褪色回收。 硝酸銀： 靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。1）直接染色直接染色電泳結(jié)果電泳膠里的蛋白質(zhì)帶可以用電轉(zhuǎn)的方法，轉(zhuǎn)到膜上（硝酸纖維素膜、PVDF膜、中性尼龍膜等）。 Western（轉(zhuǎn)膜）膠里的蛋白質(zhì)帶在電場(chǎng)的作用下橫向轉(zhuǎn)移到正極一側(cè)的膜上。膜膠蛋白原理與ELISA相同。待測(cè)蛋白硝酸纖 維素膜一抗 二抗辣根過(guò)氧 化物酶底物產(chǎn)物， 并發(fā)出光

11、PAGE膠待測(cè)蛋白底片曝光辣根過(guò)氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待測(cè)蛋白的單克隆抗體）與 膜上的蛋白結(jié)合。2）洗去未結(jié)合的一抗。3）用二抗與一抗結(jié)合（二抗上帶有HRPO）。4）清洗掉未結(jié)合的二抗。5）用HRPO的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，沖洗膠片。Immuno Blotting多 克 隆 抗 體Blotting的結(jié)果單抗blotting結(jié)果一、無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)能把外源的mRNA翻譯成蛋白質(zhì)的細(xì)胞提取物。 如：麥胚提取物系統(tǒng)、網(wǎng)織紅細(xì)胞提取物系統(tǒng)。借助無(wú)細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，通過(guò)表達(dá)或抑制所選擇的克隆載體上的外源基因的轉(zhuǎn)錄，來(lái)篩選其產(chǎn)物是否符合預(yù)期。適用于mRNA轉(zhuǎn)錄豐度高的外源基因。mRNA無(wú)細(xì)胞翻譯

12、系統(tǒng)35S標(biāo)記的 甲硫氨酸翻譯35S標(biāo)記的肽鏈PAGE電泳放射自顯影比較放射性 帶紋的位置載體+外源DNA轉(zhuǎn)錄與預(yù)期的產(chǎn)物分子量相符？mRNA一旦與DNA雜交成RNA-DNA雙鏈后就不能被核糖體翻譯出蛋白質(zhì)（轉(zhuǎn)譯被抑制）。單鏈mRNA核糖體 小亞基核糖體 大亞基能翻譯mRNADNA核糖體 小亞基核糖體 大亞基不能翻譯1. 原理1. 原理：在高甲酰胺溶液中載體上克隆的cDNA與它的mRNA雜交吸附，然后洗脫，釋放出與它對(duì)應(yīng)的mRNA，進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。 研究其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的性質(zhì)是否是預(yù)期的基因產(chǎn)物（如分子量、免疫原性等）。硝酸纖 維素濾膜載體和插 入的cDNA總mRNAcDNA基因的 mRNA雜交洗脫c

13、DNA基因的 mRNA體外翻譯cDNA編碼的蛋白電泳凝膠放射自顯影cDNA編 碼的蛋白硝酸纖 維素濾膜載體和插 入的cDNA硝酸纖 維素濾膜載體和插 入的cDNA收集35S標(biāo)記的氨基酸專(zhuān)門(mén)設(shè)計(jì)檢測(cè)能同DNA特異結(jié)合的蛋白質(zhì)因子。待測(cè)蛋白質(zhì)硝 酸 纖 維 素 濾 膜能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的DNA序列放射性標(biāo)記待測(cè)蛋白質(zhì)硝 酸 纖 維 素 濾 膜能與蛋白質(zhì)結(jié) 合的DNA序列放射性標(biāo)記真核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶（dihydrofolate reductase，DHFR）1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk）（1）TK選擇原理四氫葉酸的必要性

14、DHFR氨甲喋啉（或氨基喋啉）是葉酸的類(lèi)似物。 能抑制二氫葉酸還原酶，從而阻斷dATP、dCTP和dTTP的合成：dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 TK+細(xì)胞能產(chǎn)生胸苷酸激酶，所以可以利用培養(yǎng)基中的胸苷（T）合成TTP，存活。Ttk次黃嘌呤的補(bǔ)救作用細(xì)胞可以利用次黃嘌呤合成dATP和dCTP。dUMP dATP TTP dCTP 次黃嘌呤 補(bǔ)救 氨甲喋啉 抑制 抑制 HAT培養(yǎng)基：Tk- 細(xì)胞株。TK基因。 宿主細(xì)胞 載體標(biāo)記含次黃嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培養(yǎng)基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine）只有轉(zhuǎn)入TK基因的細(xì)胞才能生存。真

15、核細(xì)胞核苷酸的合成需要四氫葉酸提供甲基。（1） 選擇原理二氫葉酸還原酶的必要性dUMPdATPTTPdCTP四氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸四氫葉酸二氫葉酸還原酶二氫葉酸還原酶合成四氫葉酸DHFR+細(xì)胞能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以能合成四氫葉酸。能在無(wú)胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存不需要補(bǔ)救！DHFR- 細(xì)胞不能產(chǎn)生二氫葉酸還原酶，所以不能合成四氫葉酸。不能在無(wú)胸腺嘧啶和次黃嘌呤的培養(yǎng)基中生存。需要補(bǔ)救！dUMPdATPTTPdATP次黃嘌呤補(bǔ)救胸苷補(bǔ)救無(wú)四氫葉酸提供甲基，dNTP合成受阻時(shí)，胸腺嘧啶和次黃嘌呤分別補(bǔ)救:DHFR-細(xì)胞株（不能在無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)）。 宿主細(xì)胞透析除去血清中的內(nèi)源性

16、核苷酸，以免補(bǔ)救。 無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基需要胸腺嘧啶和次黃嘌呤補(bǔ)救！ 氨甲喋呤“加壓” 添加少量氨甲喋啉抑制內(nèi)源性DHFR的補(bǔ)救作用，可提高選擇。DHFR+基因。 載體標(biāo)記只有轉(zhuǎn)入DHFR+基因的細(xì)胞才能生存。DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie無(wú)核苷酸的培養(yǎng)基是細(xì)菌抗生素，干擾細(xì)菌的核糖體，使細(xì)菌的蛋白質(zhì)合成不能正常進(jìn)行，但不影響真核生物。（1）選擇原理 新霉素（neomycin）新霉素的類(lèi)似物，是一種氨基糖苷，對(duì)真核細(xì)胞和原核細(xì)胞都有毒性。 G418（geneticin）細(xì)菌的新霉素抗性基因（neor）編碼一種磷酸轉(zhuǎn)移酶（APH），能使G418失活。G418真核細(xì)胞死亡G41

17、8存活neor真核細(xì)胞含致死劑量G418的完全培養(yǎng)基。 G418培養(yǎng)基真核細(xì)胞株均可。neor基因。宿主細(xì)胞載體標(biāo)記G418：（100-800g/mL）CAT是由大腸桿菌轉(zhuǎn)座子Tn9編碼的，催化氯霉素發(fā)生乙?；Щ?。氯霉素cat含氯霉素的完全培養(yǎng)基。真核細(xì)胞株均可。cat基因。乙酰氯霉素（1）選擇原理（2） 選擇條件（3） 宿主細(xì)胞（4）載體標(biāo)記chloramphenicol acetyl transferase在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞提取物中測(cè)定是否有乙酰氯霉素。 免疫學(xué)檢查：用抗CAT的血清進(jìn)行Western blot或ELISA，檢查CAT的表達(dá)。Anti-CAT Antiserum is available from Invitrogen. Other kits to assay for CAT protein using ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecul