1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上果蠅的晝夜生物鐘基因及其作用機(jī)理摘要：晝夜節(jié)律生物鐘是一種以近似24 小時(shí)為周期的自主維持的振蕩器，由輸人通路、中央振蕩器和輸出通路三部分組成的。生物鐘機(jī)制的研究已深入到分子水平。生物鐘相關(guān)基因相繼被分離鑒定，它們及其編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物構(gòu)成的自主調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄和翻譯反饋環(huán)是生物鐘運(yùn)轉(zhuǎn)的分子機(jī)制。本文介紹了果蠅主要生物鐘基因及其作用機(jī)理，展望了揭示生物鐘調(diào)節(jié)機(jī)制在遺傳學(xué)上的重要意義。關(guān)鍵詞：晝夜節(jié)律生物鐘，生物鐘基因，分子機(jī)制Abstract: The circadian clock is a self - sustaining oscillator with a perio

2、d of about 24 hour that includes input ,central oscillator and output . The circadian clock mechanism has been studied extensively at the molecular level and several clock - related genes have been identified. The clock genes and the coded protein comprise the self sustaining feedback loop that can

3、regulate both on the transcriptional and on the translational level . This article introduced the clock genes and molecular circadian mechanism found in drosophilam. The significance of the circadian clock regulation mechanism research in genetics was also prospected.Keywords: circadian clock, Clock

4、 gene, Molecular circadian mechanism生物鐘是基因和行為之間的聯(lián)系的一個(gè)強(qiáng)有力的例證，它也揭示了環(huán)境對(duì)基因表達(dá)的影響，表現(xiàn)了遺傳和外界因素的相互作用決定有機(jī)體外在的行為。生物鐘是許多有機(jī)體所固有的，從細(xì)菌到人類，這或許是由于有機(jī)體長(zhǎng)期接受光照和黑暗循環(huán)的進(jìn)化結(jié)果。最初人們猜想生物鐘可能是因?yàn)橛袡C(jī)體對(duì)每天晝夜變化的反應(yīng)，白天尋找食物，晚上休息。但是實(shí)驗(yàn)證明生物體在沒(méi)有任何環(huán)境變化的條件下仍表現(xiàn)出以24 小時(shí)為一周期的有節(jié)律的行為。生物鐘能夠使生物體本身的節(jié)律與環(huán)境的節(jié)律同步化，因此生物鐘可以優(yōu)化生物體日常行為的節(jié)律，并且生物鐘確實(shí)影響機(jī)體的健康 1 ,2 。昆蟲(chóng)

5、經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的演化，在它們的生命活動(dòng)和行為中，有著明顯的晝夜節(jié)律性周期變化。許多昆蟲(chóng)的活動(dòng)節(jié)律還有季節(jié)性，對(duì)于一年發(fā)生多代的昆蟲(chóng)，各世代在滯育、遷移、交配、生殖等方面對(duì)季節(jié)性晝夜變化有明顯的反應(yīng)。這些周期性節(jié)律活動(dòng)，主要受光周期、溫度等外在因子和內(nèi)在神經(jīng)-內(nèi)分泌物(諸如各種激素)的調(diào)節(jié)和控制。昆蟲(chóng)的生物鐘種類很多，本文詳細(xì)介紹果蠅的晝夜節(jié)律生物鐘 3 。晝夜鐘可分3 個(gè)部分：(1) 生物振蕩器(oscillator) ，由一組呈節(jié)律表達(dá)的基因及其編碼的蛋白質(zhì)組成。節(jié)律基因啟動(dòng)后，經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯生成相應(yīng)的蛋白質(zhì)。當(dāng)此蛋白質(zhì)濃度達(dá)到一定程度，反饋?zhàn)饔糜谧陨砘虻膯?dòng)部位，使其濃度高低以24 小時(shí)周期進(jìn)行

6、振蕩 4 。在晝夜振蕩反饋回路中，正性成分(positive element)，啟動(dòng)生物鐘基因，使之進(jìn)行表達(dá)；負(fù)性成分(negative element)，阻斷正性成分的作用，使表達(dá)減弱或停止 5 ，如圖1 所示。振蕩器是生物鐘運(yùn)作的核心元件，它收外界傳入的信號(hào)，引起相應(yīng)的基因表達(dá)，進(jìn)而控制鐘信號(hào)的輸出路徑，使生物體展現(xiàn)晝夜節(jié)律活動(dòng)； (2) 輸入系統(tǒng)，接受環(huán)境周期信號(hào)傳入到振蕩器，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，矯正節(jié)律位相，由感受器和傳入路徑組成。最重要的授時(shí)因子(Zeitgeber) 為光-暗和溫度；(3) 輸出系統(tǒng)，包括與信號(hào)輸出有關(guān)的鐘基因和一些鐘控基因( clock-controlled ge

7、nes ,CCG)，將母鐘節(jié)律振蕩信號(hào)，經(jīng)體液和神經(jīng)途徑送達(dá)效應(yīng)器，調(diào)節(jié)其生理、生化和行為的晝夜節(jié)律 6 。圖1 生物鐘基因反饋調(diào)節(jié)示意圖Fig. 1 A scheme of autoregulatory biological clock gene1 果蠅的晝夜生物鐘基因黑腹果蠅(Drosophilam elanogaster)是研究晝夜生物鐘的重要模式生物，其蛹的羽化和成蟲(chóng)的行為活動(dòng)均呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性。果蠅類鐘基因的研究上世紀(jì)70 年代初已開(kāi)始，積累資料頗豐。它的主鐘由位于腦部的兩簇神經(jīng)元組成，位于腦部。以后研究發(fā)現(xiàn)，在其身體其他組織亦有鐘結(jié)構(gòu)。到現(xiàn)在為止，在果蠅上已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了7 個(gè)基因主要參與

8、中樞鐘的調(diào)節(jié)，它們是：period (per ) , timeless ( tim) , clock(clk) , cycle (cyc) , vrille (vri) , double - time ( dbt) 和Crypto-chrome ( cry) 7 。1.1 per 基因per 是1993 年首次被鑒定和克隆成功的鐘基因，長(zhǎng)10kb，可編碼1200 氨基酸的蛋白質(zhì)，其中一個(gè)氨基酸被取代，就會(huì)使周期和轉(zhuǎn)錄循環(huán)發(fā)生改變。per 缺陷可改變生物節(jié)律。業(yè)已證實(shí)，它有3 個(gè)變異的等位基因：長(zhǎng)周期基因、短周期基因和無(wú)周期基因，分別使果蠅的周期長(zhǎng)度變?yōu)?8 小時(shí)、19 小時(shí)或無(wú)節(jié)律。我們現(xiàn)在對(duì)

9、晝夜鐘的認(rèn)識(shí)是從per 的結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)和產(chǎn)物開(kāi)始的 8 。per 是果蠅的主控基因，影響晝夜節(jié)律和超日節(jié)律。per經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯后，形成PER 蛋白，組成鐘的反饋回路。但其須與另一種鐘蛋白組成異二聚體后，才能作為負(fù)性成分發(fā)揮作用 9 。per可在果蠅成蟲(chóng)的眼、觸角、腦(神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞) 、胸神經(jīng)節(jié)、唾腺、卵巢、消化道和馬氏管等許多組織中表達(dá) 3 。在per mRNA 中部有一個(gè)編碼約20對(duì)蘇氨酸甘氨酸重復(fù)( TG重復(fù))的區(qū)域。TG的缺失對(duì)晝夜節(jié)律并不產(chǎn)生影響，但卻使果蠅的求偶鳴聲節(jié)律變慢 3 。per上游有一段69bp的增強(qiáng)子序列，其中的E-box ( enhancer)是per mRNA高水平

10、表達(dá)所必需的。1.2 tim 基因永恒基因tim是果蠅的第二個(gè)生物鐘基因，它對(duì)per進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)，在細(xì)胞核內(nèi)定位和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等方面起作用 10 。tim基因是在無(wú)明顯晝夜節(jié)律的果蠅pero中發(fā)現(xiàn)的，并已證明是果蠅晝夜節(jié)律功能所必需的，其翻譯產(chǎn)物TIM 是一種酸性蛋白質(zhì)，N端含有核定位序列(信號(hào)肽)，C端富含酸性氨基酸，具有轉(zhuǎn)錄活化結(jié)合結(jié)構(gòu)域。從果蠅中分離到的一種蛋白激酶基因產(chǎn)物DBT，一方面使PER不穩(wěn)定，另一方面使磷酸化后的PER與TIM結(jié)合形成穩(wěn)定異二聚體 11 。per 和tim 在下午提高轉(zhuǎn)錄水平，黃昏時(shí)mRNA 達(dá)高峰，PER和TIM蛋白的積累峰在6 小時(shí)后出現(xiàn)，二者形成異二聚體

11、進(jìn)入核內(nèi)，作為負(fù)性成分發(fā)揮作用。黎明后光使TIM降解，致使PER不穩(wěn)定，導(dǎo)致PERTIM 對(duì)CLOCKCYC 的抑制作用降低，開(kāi)啟新一輪的循環(huán)。時(shí)間生物學(xué)研究表明，光暗周期可導(dǎo)引晝夜節(jié)律使其位相重調(diào)。在黑夜的早期給果蠅光照，使晝夜周期延長(zhǎng)，由于此時(shí)tim 的mRNA 處于高峰期穩(wěn)定，TIM被光解后可能迅速被新合成的TIM 替補(bǔ)，系統(tǒng)推遲節(jié)律后再回到光照前的位點(diǎn)上；在夜間晚期給予光照，晝夜節(jié)律縮短，這可能由于大TIM被光降解，此時(shí)正處于節(jié)律的低谷期，很少或無(wú)tim mRNA 替補(bǔ)之故。1.3 clk 基因CLOCK最早是從小鼠中分離出來(lái)的生物鐘基因產(chǎn)物，是由Clock編碼的轉(zhuǎn)錄因子。結(jié)構(gòu)中含有P

12、AS-bhlh (堿基- 螺旋- 環(huán)- 螺旋)結(jié)構(gòu)域，且C端富含具有轉(zhuǎn)錄激活作用的Gln (即Q-rich) 。1.4 cyc 基因果蠅的CLOCK和CYC通常以異二聚體形式，發(fā)揮正性調(diào)節(jié)作用。per 和tim 兩種基因啟動(dòng)子的E-box是其作用的目標(biāo)靶。CLOCKCYC 異二聚體，激活per 、tim 基因轉(zhuǎn)錄，生成PER 和TIM 兩種蛋白。而且也激活vri 、pdf 、ccg 等基因生成蛋白質(zhì)或引起相應(yīng)生物學(xué)效應(yīng)12 。1.5 dbt 基因dbt 基因產(chǎn)物DBT 是一種蛋白激酶，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)對(duì)PER進(jìn)行磷酸化，使其穩(wěn)定性降低，從而易于與TIM 結(jié)合。二者結(jié)為異二聚體后性能穩(wěn)定，進(jìn)入細(xì)胞核1

13、2。1.6 vri 基因果蠅晝夜生物鐘vri基因的作用現(xiàn)在還難以確定。它是在分離野生型和無(wú)節(jié)律型per01基因突變體的不同轉(zhuǎn)錄本時(shí)發(fā)現(xiàn)的。測(cè)序發(fā)現(xiàn)它是一個(gè)已知的編碼bZip轉(zhuǎn)錄因子的基因，對(duì)于生長(zhǎng)發(fā)育有重要的作用。vri的mRNA周期表達(dá)隨per/tim 基因表達(dá)水平而改變，并受CLOCK/CYC與E-box結(jié)合的調(diào)節(jié)。反過(guò)來(lái)，在表達(dá)tim 基因的細(xì)胞中， vri基因的持續(xù)活化可抑制per和tim 基因的轉(zhuǎn)錄。vri基因的長(zhǎng)時(shí)程表達(dá)可經(jīng)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)機(jī)制降低PDF的水平，而PDF水平的下降可能是果蠅長(zhǎng)周期及無(wú)節(jié)律表型增加的原因。在這些表型突變的果蠅中，已發(fā)現(xiàn)vri基因的水平是恒定的。vri基因的m

14、RNA在果蠅腹部神經(jīng)元(LNs) 和光受體細(xì)胞上進(jìn)行表達(dá)，其產(chǎn)物VRI可能是生物振蕩器的中心成分之一。VRI一旦被破壞，可以打破其他基因產(chǎn)物如TIM 等的正常循環(huán) 13 。1.7 cry 基因隱色素(Cryp tochrome, CRY)是由cry基因編碼的一種對(duì)藍(lán)光極為敏感的黃素蛋白光受體。作為光受體,接受光波并將其傳遞到振蕩器的鐘基因。首先在擬南芥中分離鑒定，能介導(dǎo)擬南芥的生長(zhǎng)、開(kāi)花時(shí)間和向光 14 。1996年克隆出了哺乳動(dòng)物的同源蛋白mCRY，并發(fā)現(xiàn)mCRY蛋白也作為感光受體表達(dá)于哺乳動(dòng)物的視網(wǎng)膜內(nèi)核層中，它在光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起重要的作用。果蠅的cry 基因突變成cryb后，突變體果蠅腦的

15、晝夜鐘表現(xiàn)正常，但外周鐘則變的無(wú)節(jié)律，這種現(xiàn)象提示中樞鐘與外周鐘的機(jī)制不同 15 。Fernanda等研究表明 16 ，CRY接受光信號(hào)刺激后，發(fā)生光化學(xué)變化，在胞漿和細(xì)胞核中直接與TIM發(fā)生光依賴性結(jié)合，促使PER /TIM復(fù)合物失活，從而終止其在反饋環(huán)路中的作用。果蠅的光受體除了CRY之外，神經(jīng)元的振蕩器還可能從其它輸入途徑獲得光信號(hào)。隱色素開(kāi)始是作為一種植物光受體，后來(lái)又在動(dòng)物中找到了它的同源基因，這是為數(shù)不多的從植物到動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)之間的進(jìn)化聯(lián)系，未來(lái)的研究需著眼于果蠅與哺乳動(dòng)物CRY的不同功能。2 果蠅晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)的分子機(jī)制果蠅的晝夜節(jié)律，在蛹期是測(cè)定種群中個(gè)體之間羽化高峰的小時(shí)數(shù)，在

16、成蟲(chóng)期則是測(cè)定個(gè)體靜止/運(yùn)動(dòng)周期的時(shí)間。目前認(rèn)為，果蠅生物鐘節(jié)律的起搏點(diǎn)是一種“轉(zhuǎn)錄翻譯抑轉(zhuǎn)錄”機(jī)制構(gòu)成的反饋環(huán)路。此反饋環(huán)的具體作用方式如圖2。TIM通過(guò)與PER 的異型結(jié)合，調(diào)節(jié)PER 進(jìn)入核的時(shí)間進(jìn)而調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律行為。但是兩者都不具有DNA 結(jié)合活力，因此，PER可能通過(guò)其PAS 域或之外的區(qū)域與其他含有bHLH-PAS域的生物鐘基因結(jié)合，來(lái)進(jìn)行負(fù)反饋調(diào)節(jié)。最近發(fā)現(xiàn)， per 上游的增強(qiáng)子序列中的1 個(gè)E-box (enhancer box) 是per RNA 高水平表達(dá)所必需的。而tim 的E-box 的作用方式有所不同，它需和上游相鄰的順式作用因子結(jié)合在一起，進(jìn)而促進(jìn)tim mRNA

17、 的高水平表達(dá)；同時(shí)，E-box 還是bHLH 異型二聚蛋白的結(jié)合部位。而在此機(jī)制中恰好有2 個(gè)含有bHLH-PAS 域的轉(zhuǎn)錄因子CLOCK 和CYCLE ，兩者之間通過(guò)它們的PAS 域相互作用，形成CLOCK-CYCLE 異二聚體結(jié)合到per 和tim 的E-box 增強(qiáng)子上，分別驅(qū)動(dòng)per和tim 的表達(dá)。隨著PER 和TIM 的積累并進(jìn)入核內(nèi)，它們與dCLOCK-CYCLE 相互作用導(dǎo)致異二聚體改變構(gòu)象或者掩蓋它的結(jié)構(gòu)域，進(jìn)而阻遏CLOCK-CYCLE與E-box 的結(jié)合，消減了per 和tim 的轉(zhuǎn)錄；與此同時(shí)，通過(guò)一個(gè)獨(dú)立的激活因子或激活因子復(fù)合物又可以促進(jìn)dClk 的轉(zhuǎn)錄。與之相對(duì)

18、應(yīng)，在缺少PER-TIM的情況下，高水平的dCLK-CYC 可以激活per和tim 的轉(zhuǎn)錄，同時(shí)抑制dClk 的轉(zhuǎn)錄，其作用方式可能是直接或間接的，這樣就形成了2 個(gè)相互調(diào)節(jié)的反饋環(huán)，從而驅(qū)動(dòng)果蠅生物節(jié)律內(nèi)部生物鐘的正常運(yùn)轉(zhuǎn)。這個(gè)生物鐘再經(jīng)過(guò)一些尚未知的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性及磷酸化的蛋白的放大作用，而使生物體具有節(jié)律性。此回路中的DBT(double-time 基因的表達(dá)產(chǎn)物) 影響PER 的磷酸化過(guò)程，進(jìn)而調(diào)節(jié)PER的穩(wěn)定性，DBT 很可能是PER翻譯后的調(diào)節(jié)因子17。圖2果蠅的生物鐘的調(diào)節(jié)模式Fig2Model for gene regulation within the Drosophil

19、a biological clock3 展望有關(guān)生物鐘基因的研究頗多，就鐘基因之間的相互作用來(lái)說(shuō)，由于牽涉的因素較多，提出來(lái)的生物體整個(gè)生物鐘節(jié)律的一些假想的調(diào)節(jié)模式還有待于進(jìn)一步證實(shí)。生物節(jié)律普遍存在于生物的各級(jí)水平，是生命科學(xué)的重大基礎(chǔ)理論問(wèn)題。由于鐘基因的發(fā)現(xiàn)和活動(dòng)規(guī)律的揭示，使這問(wèn)題的研究獲得突破性進(jìn)展。盡管在較短時(shí)間內(nèi)，人們對(duì)近日節(jié)律的認(rèn)識(shí)取得了很大的進(jìn)步，但僅僅是一個(gè)開(kāi)始,還存在許多未知領(lǐng)域。在晝夜節(jié)律行為方面，有些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生物鐘突變體的表型與多種人類疾病具有驚人的相似性。生物鐘基因的研究有助于對(duì)遺傳性疾病的了解。鐘基因突變可使機(jī)體晝夜周期延長(zhǎng)或縮短，從而造成機(jī)體與環(huán)境不能同步，導(dǎo)

20、致精神性疾患。生物鐘基因運(yùn)作機(jī)制的深入研究，對(duì)揭示生命節(jié)律性活動(dòng)的本質(zhì)、生物進(jìn)化的分子基礎(chǔ)和開(kāi)拓遺傳學(xué)研究新領(lǐng)域具有重要意義，可為醫(yī)療保健和農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)實(shí)踐，提供新的理論依據(jù)。參考文獻(xiàn)：1 Beaver LM, Gvakharia BO, Vollintine , et al. Loss of circadian clock function decreases reproductive fitness in males of Drosophila melanogasterJ . Proc Natl Acad Sci USA ,2002 ,99 : 2134 2139.2 Ouyang Y, A

21、ndersson C R , Kondo T, et al. Resonating circadian clocks enhance fitness in cyanobacteria J .Proc NatlAcad Sci USA ,1998 , 95 :8660 - 8664.3 王英,司馬,楊虎,等.昆蟲(chóng)生物鐘基因及其分子作用機(jī)制研究進(jìn)展,江蘇蠶業(yè),2008,1: 9144 Ripperger J A, Schibler U. Circadian regulation of gene expressionin animals. Curr Opin Cell Biol ,2001 ,13

22、:357362.5 Dunlap J C. Molecular bases for circadian clock. Cell ,1999 ,96 :271290.6 Young M W. Circadian rhythms marking time for a kingdom. Science ,2000 ,288 :451453.7 Youngm W. Circadian rhythms marking time for a kingdom J . Science, 2000, 288: 451 4538 Dunlap J C. Molecular bases for circadian clock. Cell ,1999 ,96 :271290.9 Hardin P E , Hall J C , Rosbach M. Feedback of the drosophila period gene product on circadian cycling of its messenger RNA levels. Nature ,1990 ,343 :5365