1、中藥長期毒性試驗(yàn)研究問題探討    中藥長期毒性試驗(yàn)研究問題探討摘要 近年來中藥注射劑臨床應(yīng)用中不良反應(yīng)的增加，引起人們對(duì)中藥注射劑安全性的重視，中藥新藥研究技術(shù)要求對(duì)中藥注射劑毒理學(xué)研究提出了嚴(yán)格的要求。本文提出中藥注射劑長期毒性試驗(yàn)研究中常見問題溶血性、刺激性、過敏反應(yīng)等制劑安全性問題對(duì)毒理學(xué)試驗(yàn)研究的影響，長期毒性試驗(yàn)劑量與用藥周期的設(shè)計(jì)、給藥方法及對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析方面的問題?？偨Y(jié)了上述問題，并提出一些看法與解決辦法。關(guān)鍵詞 中藥注射劑 長期毒性 制劑安全性 隨著中藥現(xiàn)代化的進(jìn)程、中藥新劑型的研究逐年增加，特別是近年來新藥研究熱潮的出現(xiàn)，提出中藥注射

2、劑的注冊申請(qǐng)數(shù)目逐年增加，1998-2000年8個(gè)，而2001-2003年上升到60個(gè)。由于中藥新藥研究技術(shù)要求和新的藥品注冊管理辦法的實(shí)施，對(duì)中藥注射劑提出了新的毒理學(xué)要求；外加研究單位與委托單位的目的不完全一致或溝通不夠等種種原因，致使中藥注射劑，特別是靜脈給藥注射劑的毒理學(xué)研究常常出現(xiàn)各種各樣的問題。筆者就五年來所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)和審閱過的近百個(gè)毒理學(xué)資料中出現(xiàn)的問題提出來與同行們共同探討，以期今后在毒理學(xué)研究特別是中藥注射劑長期毒性試驗(yàn)研究中避免出現(xiàn)不該出現(xiàn)的問題，減少投入和研究工作的反復(fù)。一、中藥注射劑制劑安全性的問題 中藥注射劑不同于一般口服制劑，首先是要滿足注射劑安全性的要求，對(duì)新藥臨

3、床研究用藥樣品都要求進(jìn)行全面的制劑安全性試驗(yàn)，但對(duì)用于毒理學(xué)研究樣品往往沒有進(jìn)行相應(yīng)的研究，或僅對(duì)溶血、熱原關(guān)注較多。中藥制劑毒性相對(duì)較小，長期毒性試驗(yàn)劑量往往可達(dá)臨床用藥劑量的幾十倍，甚至百倍以上。而如此高的劑量，因限于給藥體積，增加藥物濃度成了提高劑量的常用方法。藥物濃度的增加，可引起注射劑性質(zhì)的改變，如滲透壓、pH值、刺激性、溶血性等改變，對(duì)于溶解性不好需采用助溶劑的藥物更為明顯。這些改變導(dǎo)致毒理學(xué)樣品本身已不完全符合注射液的要求，如就此樣品進(jìn)行長期毒性研究往往出現(xiàn)各種問題。 1溶血作用 對(duì)臨床用藥樣品必須進(jìn)行溶血性試驗(yàn)，符合要求者方可應(yīng)用于臨床。毒理學(xué)用藥樣品因濃度增加易出現(xiàn)溶血反應(yīng)，

4、如未進(jìn)行本項(xiàng)研究而直接進(jìn)行長毒試驗(yàn)研究，很可能因溶血而致動(dòng)物死亡。在犬靜脈注射或大鼠腹腔注射預(yù)試驗(yàn)中對(duì)溶血作用較弱的受試藥物，短時(shí)間內(nèi)不易觀察到溶血反應(yīng)的影響，但在長期用藥后勢必引起體重下降、精神萎糜、RBC、HGB的降低、Tbil的升高等毒性反應(yīng)。因此，對(duì)含有具有溶血作用的吐溫、PEG-400等助溶劑，皂苷或其他可能引起溶血的成份者，應(yīng)進(jìn)行多個(gè)稀釋度的溶血試驗(yàn)，以確證沒有溶血作用的濃度。如確實(shí)需要提高藥物劑量，在犬靜脈給藥時(shí)可考慮采用具有細(xì)胞膜穩(wěn)定作用的葡萄糖注射液作為溶劑，或增加給藥體積，同時(shí)控制給藥速度。筆者進(jìn)行過一枝黃花注射液的急性毒性預(yù)試，給小鼠iv 0.1ml/10g體重的2.0g

5、生藥/ml的受試驗(yàn)物（20g/kg），給藥后四小時(shí)內(nèi)除活動(dòng)減少外，未見其它異常改變，次日10只小鼠全部死亡。進(jìn)行溶血試驗(yàn)后表明本2.0g生藥/ml一枝黃花注射液有明顯溶血作用，1.0g生藥/ml有輕度溶血作用。再次采用1.0g生藥/ml，給小鼠iv0.2ml/10g體重（20g/kg），結(jié)果僅有30%動(dòng)物出現(xiàn)死亡。因溶血作用，對(duì)于同是20g/kg的給藥劑量，只因藥物濃度的不同，結(jié)果可存在很大的差別。 2刺激性 對(duì)于樣品中存在皂苷、揮發(fā)油、具有刺激性的助溶劑等成份，在濃度增加時(shí)勢必增加刺激性。具有刺激性的受試藥物，長毒試驗(yàn)采用肌肉注射易出現(xiàn)肌肉組織變性、壞死，特別是用藥周期較長者；對(duì)于一些大鼠腹

6、腔注射中出現(xiàn)扭體反應(yīng)或犬靜脈注射出現(xiàn)紅腫的樣品，在長毒試驗(yàn)中均要注意刺激性對(duì)最后試驗(yàn)結(jié)果的最后影響。具有制劑刺激性的受試藥物對(duì)大鼠的腹腔注射影響大于犬的靜脈注射，原因是藥物在腹腔中停留時(shí)間較長，對(duì)腹腔內(nèi)各臟器與腹腔粘膜長期反復(fù)刺激易出現(xiàn)腹腔內(nèi)的臟系數(shù)增加、臟器粘連、甚至臟器變性壞死等病變，還有可能引起非腹腔內(nèi)容的臟器改變。 中藥注射劑的刺激性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大，可直接影響到對(duì)藥物安全性的評(píng)價(jià)。我們曾做過一個(gè)用40%PEG-400做溶劑的難溶性中藥注射液的急性毒性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明溶劑的LD50與含藥物樣品的LD50極為相近。另進(jìn)行清開靈凍干粉急性毒性試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)給小鼠iv1.82g/ml可見明顯

7、的刺激反應(yīng)，小鼠在給藥過程即可死亡，解剖可見肺臟明顯充血，進(jìn)行稀釋一倍后反應(yīng)明顯減輕，兩倍稀釋后未見動(dòng)物死亡，原因可能是方中高濃度的去膽氧酸和膽酸引起。可見刺激性可明顯影響毒理試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于含有人參、黃芪、三七等含皂苷成份藥材或石昌蒲、金銀花、柴胡等含有大量揮發(fā)油成份藥材的受試藥物在試驗(yàn)中應(yīng)注重刺激性問題。我們實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行了注射用參麥凍干粉和參芪注射液長期毒性試驗(yàn)均存在大鼠長毒試驗(yàn)中高、中劑量組肝、脾、腎等臟器系數(shù)明顯增加，但未見明顯病理改變，部分動(dòng)物出現(xiàn)腹腔臟器粘連，劑量相關(guān)性明顯。在犬的靜脈注射中未見臟器系數(shù)增加，但高、中劑量組犬腎小管出現(xiàn)濁腫、水樣變、輕度壞死等病理改變。對(duì)具有刺激性的受試

8、藥，除考慮藥物因素外還應(yīng)考慮輔料原因，如同輔料有關(guān)試驗(yàn)應(yīng)增加溶劑對(duì)照組，同時(shí)考慮增加給藥體積或一日給藥次數(shù)來減少藥物刺激性對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)價(jià)。 3過敏反應(yīng) 在Beagle犬長毒試驗(yàn)中常發(fā)現(xiàn)靜脈給藥過程中出現(xiàn)嘔吐、流涎、腹瀉等消化道反應(yīng)，部分試驗(yàn)還伴有皮膚潮紅，眼瞼、耳朵水腫增厚，皮疹等過敏癥狀，嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)休克，反應(yīng)不嚴(yán)重者一般在停藥30min-60min后可恢復(fù)正常。有上述反應(yīng)的大部分受試藥物在豚鼠全身過敏和大鼠被動(dòng)皮膚過敏試驗(yàn)中均未表現(xiàn)出過敏反應(yīng)。經(jīng)了解這些樣品中多數(shù)有采用助溶劑，以吐溫-80用得最多。為確證助溶劑可否引起過敏反應(yīng)，我們采用含0.5%的吐溫-80的生理鹽水注射液給Beagle

9、犬進(jìn)行滴注，在注射5-6min（滴速30d/min）后即可出現(xiàn)明顯的過敏癥狀，隨給藥量的增加反應(yīng)加重，在此停止滴注60min后一般可恢復(fù)正常。次日我們給同一批Beagle犬注射不含吐溫的生理鹽水注射液50ml，未見任何異常反應(yīng)。第三日再次給于含吐溫的生理鹽水注射液，又出現(xiàn)上述癥狀。可以肯定Beagle犬對(duì)吐溫很敏感，這點(diǎn)同文獻(xiàn)中報(bào)道一致的1-2。在此之后我們進(jìn)行一清熱解毒注射液長毒試驗(yàn)時(shí)又出現(xiàn)類似現(xiàn)象，同委托方溝通后將助溶劑吐溫-80從制劑中去除后，試驗(yàn)全過程未出現(xiàn)頭面部、耳朵、腹部等皮膚發(fā)紅、流涎、煩躁不安等過敏反應(yīng)。 故當(dāng)出現(xiàn)過敏反應(yīng)時(shí)，則應(yīng)從藥物處方、提取工藝、制劑處方等方面分析可能引起

10、過敏原因。如是藥物原因應(yīng)建議委托者考慮進(jìn)行開發(fā)的可行性或考慮改進(jìn)工藝解決過敏問題；如是輔料引起異常，除考慮給藥濃度因素外，應(yīng)考慮更改輔料。 上述三方面問題，在中藥注射液長期毒性試驗(yàn)中是經(jīng)常遇到的問題。因此對(duì)毒理學(xué)試驗(yàn)用藥樣品非常有必要進(jìn)行制劑安全性試驗(yàn)研究，如在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)異常者，應(yīng)及時(shí)同樣品提供者聯(lián)系，了解樣品的制備情況，分析具體原因。委托方經(jīng)常會(huì)因保密處方或工藝而不愿告訴毒理試驗(yàn)者，這非常不利于試驗(yàn)的順利開展，正確評(píng)價(jià)藥物的安全性。雙方共同考慮原因所在，確定進(jìn)一步研究方案，這樣才有利于達(dá)到長期毒性試驗(yàn)?zāi)康陌l(fā)現(xiàn)毒性反應(yīng)、尋找毒性靶器官和確定安全劑量，二、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)過程中常見的問題 各類

11、有關(guān)新藥研究專著中均有長期毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)方面的內(nèi)容，單從文獻(xiàn)資料看長期毒性試驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)較簡單，實(shí)則是個(gè)很難的問題，因它不但關(guān)系到多方面專業(yè)知識(shí)，還同實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)有著很大關(guān)系。對(duì)于首次進(jìn)行毒理學(xué)研究或經(jīng)驗(yàn)不足者易照搬書上內(nèi)容，在測不出LD50時(shí)高劑量就設(shè)為臨床用藥的50倍或一味追求毒性劑量，而對(duì)藥物的本身及將來臨床用藥的實(shí)際情況未加考慮，此類研究方案得出的研究結(jié)果不但達(dá)不到毒理學(xué)研究真正目的，且往往在試驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)各種各樣的問題。中藥新藥研究技術(shù)要求對(duì)中藥注射劑進(jìn)行了專項(xiàng)要求；藥品注冊管理辦法將中藥注射劑單獨(dú)歸為七類，并在說明中強(qiáng)調(diào)大小水針、輸液及凍干粉之間的劑量改進(jìn)均納入新藥要求；新的指導(dǎo)原則即將出

12、臺(tái)等均增加了中藥注射劑毒理學(xué)研究的難度。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)驗(yàn)過程中更應(yīng)考慮周全，以免投入大量的時(shí)間和費(fèi)用后得出的結(jié)果卻不能充分反應(yīng)受試藥物的毒性，為臨床用藥提供毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而要從頭再來。 1劑量設(shè)計(jì) 長期毒性試驗(yàn)劑量設(shè)計(jì)一般原則3是高劑量組原則上要求動(dòng)物產(chǎn)生明顯的或嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，低劑量略高于藥效學(xué)中的有效劑量但應(yīng)不出現(xiàn)毒性反應(yīng)，再設(shè)一個(gè)出現(xiàn)輕度毒性反應(yīng)的中間劑量。在1993年衛(wèi)生部藥政局頒發(fā)的中藥新藥研究指南中對(duì)大鼠劑量設(shè)計(jì)方面的要求有一條是“如果急性毒性試驗(yàn)結(jié)果毒性很低，測不出LD50。也未見毒性應(yīng)者，可設(shè)高、低兩個(gè)劑量組，高劑量組一般為擬用于臨床劑量的50倍以上（有因難時(shí)，可適當(dāng)減少劑量

13、）并應(yīng)高于藥效學(xué)試驗(yàn)之高劑量。”，對(duì)犬也有類似規(guī)定。有的研究者怕做出毒性或?yàn)榱藵M足委托者的要求，特別是在受試藥物價(jià)格較高時(shí)，就根據(jù)這條高劑量僅進(jìn)行相當(dāng)于臨床用量的50倍，或略高于50倍的劑量（以60倍為高劑量居多）。筆者認(rèn)為此條規(guī)定是基于兩方面原因，一方面是對(duì)于毒性較小的中藥制劑，長毒劑量設(shè)計(jì)過高沒有實(shí)際意義；另一方面是一些原三、四類口服制劑中有些藥材不經(jīng)提取直接打粉入藥或只是粗提，限于溶解度或給藥體積，無法做到較高劑量給藥。對(duì)于中藥注射劑，特別是進(jìn)行過多次處理，提取有效部位或有效成份的，劑量要達(dá)到高于擬用臨床劑量的50倍或上百倍多數(shù)情況下是可以做到的。對(duì)此，長毒試驗(yàn)中高劑量一般以出現(xiàn)明顯毒性

14、反應(yīng)為宜，如藥物毒性確實(shí)很小，如銀杏葉注射劑，高劑量可設(shè)為有效劑量的10-15倍。如果高劑量設(shè)計(jì)較低，即便出現(xiàn)一些輕度毒性反應(yīng)，也不能為臨床用藥提供充分的毒理學(xué)信息。中藥注射液以用于急、重癥者為多，且臨床適應(yīng)癥較多。臨床上對(duì)不同癥候的疾病用藥劑量差別較大，如用于治療休克的參麥注射液4-6臨床上對(duì)不同原因的休克與休克的不同時(shí)期用量相差很大，可以從一次用量20ml至100ml。如在臨床前是按20ml進(jìn)行劑量設(shè)計(jì)，則不能支持臨床的100ml用量。 不同研究者對(duì)劑量設(shè)計(jì)原則理解不同，另有些研究者為了做出毒性結(jié)果，一味增加劑量，高劑量達(dá)到臨床擬用量的兩三百倍，組間劑量比又不大，如高、中、低三個(gè)劑量組采用

15、4:2:1進(jìn)行遞減，則低劑量為臨床擬用量的四五十倍大有可能。結(jié)果三個(gè)劑量均出現(xiàn)毒性反應(yīng)，試驗(yàn)結(jié)果難以為臨床提供安全用藥劑量。無論是劑量過高，還是偏低均不能達(dá)到長期毒性試驗(yàn)?zāi)康?。為了真正達(dá)到毒理學(xué)試驗(yàn)?zāi)康?，在劑量設(shè)計(jì)時(shí)一定要綜合考慮急性毒性試驗(yàn)結(jié)果、長期毒性預(yù)試驗(yàn)結(jié)果、藥物已有的其它研究結(jié)果及處方相近藥物的臨床用藥情況，確定合理的用藥劑量。對(duì)毒性較大的受試藥物，預(yù)試驗(yàn)顯得尤為重要；對(duì)于毒性較小的受試藥物高劑量可采用最大給藥量或采用藥效學(xué)同種動(dòng)物有效劑量的10-15倍進(jìn)行。低劑量可參照藥效學(xué)試驗(yàn)，而中劑量可采用高劑量的1/3-1/5或采用高、低劑量的幾何均數(shù)。也可借鑒于袁伯俊等人7歸納的半數(shù)致死量

16、法、最大耐受量法，等效劑量法等幾種方法。 2用藥周期 中藥新藥研究技術(shù)要求規(guī)定中藥注射劑長期毒性用藥周期為臨床療程的3-4倍，嚙齒類一般不超過6個(gè)月，非嚙齒類不超過9個(gè)月。臨床上需反復(fù)長期用藥者按最長周期進(jìn)行。對(duì)于中藥注射劑一般人第一反應(yīng)是試驗(yàn)進(jìn)行6個(gè)月或9個(gè)月難以做到或不可能做到。為減少研究難度往往按較低的要求進(jìn)行設(shè)計(jì)，特別是對(duì)于一些長療程的藥物，如癌癥、肝炎方面的注射劑。筆者認(rèn)為不能僅根據(jù)臨床研究方案中的療程來設(shè)計(jì)試驗(yàn)周期，如用于治療冠心病的藥物，臨床療程定一般為2周，如僅按三倍周期進(jìn)行為期6周的試驗(yàn)是達(dá)到臨床實(shí)驗(yàn)用藥要求的。而新藥上市后臨床常會(huì)用到3周或更長一些，如復(fù)方丹參注射液、香丹注

17、射液、血栓通注射液等，臨床用藥3周者大有所在。因此，我們認(rèn)為應(yīng)結(jié)合臨床實(shí)際應(yīng)用情況考慮試驗(yàn)周期，如對(duì)于中風(fēng)、胸痹的藥物，以進(jìn)行3個(gè)月長毒為宜。筆者見過北京某單位完成一中藥抗腫瘤注射液的長期毒性試驗(yàn)，根據(jù)研究單位最初提供的臨床療程為一個(gè)月而設(shè)三個(gè)月，但在最后臨床方案中是連續(xù)用藥兩個(gè)療程為一個(gè)觀察期（中藥臨床研究指導(dǎo)原則規(guī)定抗腫瘤治療藥一般療程不少于兩個(gè)月），這樣臨床試驗(yàn)實(shí)際上用藥時(shí)間是兩個(gè)月?？梢娙齻€(gè)月的長期毒性資料不能支持用藥兩個(gè)月的臨床試驗(yàn)的。為此，作為一項(xiàng)毒理學(xué)研究的方案設(shè)計(jì)者應(yīng)結(jié)合藥物實(shí)際情況從多方面考慮長毒用藥周期的設(shè)計(jì)是十分重要的。 3給藥方法 一般大鼠進(jìn)行長期連續(xù)靜脈注射較難實(shí)施，

18、而肌肉注射又有限于用藥體積（0.1-0.2ml/次），兩者多數(shù)采用腹腔注射或其它途徑代替，但在具體實(shí)驗(yàn)中存著用藥體積、給藥濃度、每周用藥次數(shù)等方法問題。特別是臨床用藥擬采用滴注方面的藥物，研究者為了減少工作量，常減小給藥體積，縮短單次給藥時(shí)間。對(duì)于藥理作用較強(qiáng)的受試藥物，特別是作用于心腦血管的藥物，如不注意給藥體積和速度，在給犬用藥時(shí)最容易出問題。常常有研究者向受試藥物提供者反應(yīng)藥物毒性太大，一用藥就出現(xiàn)惡心、嘔吐、血壓下降、心律失常、四肢發(fā)軟或休克等癥狀。筆者實(shí)驗(yàn)室曾進(jìn)行一用于腦出血的注射液長毒試驗(yàn)，第一次預(yù)試驗(yàn)時(shí)采用2ml/kg進(jìn)行推注，結(jié)果給藥還未進(jìn)行到一半時(shí)，Beagle犬已進(jìn)入休克狀

19、態(tài)，心率明顯減慢至每80多次、出現(xiàn)早搏，后改為8ml/kg進(jìn)行滴注，結(jié)果未出現(xiàn)異常。對(duì)于藥理作用較強(qiáng)、有刺激性或溶血性的藥物，應(yīng)盡可能注重給藥體積、給藥速度，以免因用藥方法引起毒性反應(yīng)而影響對(duì)受試藥物的評(píng)價(jià)。以筆者實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)，對(duì)于Beagle犬靜脈滴注10ml/kg或更大一些是可行的，一般藥物以30-60d/min為宜。 4檢測指標(biāo) 長期毒性試驗(yàn)中一般觀察，血液學(xué)和血液生化指標(biāo)，系統(tǒng)解剖和病理學(xué)檢查，對(duì)于非嚙齒類的大動(dòng)物心電圖、尿常規(guī)的檢查等常規(guī)指標(biāo)檢測我們一般不會(huì)遺漏。對(duì)作用靶器管和注射部分的觀察往往易被忽略。筆者曾看過一治療糖尿病視網(wǎng)膜與神經(jīng)病變的藥物的毒理申報(bào)資料，在病理學(xué)檢查中未進(jìn)行胰腺

20、、視神經(jīng)及視網(wǎng)膜的觀察。不少注射劑長期毒性資料中沒有注射部位的描述或病理結(jié)果，這是一項(xiàng)缺憾，其實(shí)這部分結(jié)果可很好地作為觀察連續(xù)給藥刺激性的數(shù)據(jù)。除對(duì)一些常規(guī)指標(biāo)的檢測外，對(duì)試驗(yàn)中出現(xiàn)異常的應(yīng)增加相應(yīng)指標(biāo)的測定，以便分析出現(xiàn)異常的真正原因，如對(duì)在犬試驗(yàn)中其發(fā)現(xiàn)血細(xì)胞下降時(shí)，最好增加骨髓分析。新的指導(dǎo)原則將增加檢測指標(biāo)的要求，在進(jìn)行方案設(shè)計(jì)時(shí)應(yīng)充分理解各項(xiàng)技術(shù)要求同時(shí)考慮受試藥物的作用特點(diǎn)，確定合理的檢測指標(biāo)。三、對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析描述 在一些新藥申報(bào)資料或毒理學(xué)文獻(xiàn)報(bào)告中可見以簡單描述試驗(yàn)結(jié)果為多，對(duì)出現(xiàn)變化指標(biāo)未加分析而是留給看資料人自行分析。還有對(duì)于體重、進(jìn)食量、血液檢查等變化雌雄動(dòng)物未分開統(tǒng)計(jì)；對(duì)發(fā)生變化的指標(biāo)只寫有無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義與標(biāo)明增加還是降低，對(duì)于變化原因未做進(jìn)一步的分析討論，或是增加一句均在正常范圍之內(nèi)，但并未提供本單位的正常值范圍。大體解剖和病理學(xué)檢查是存在問題最