1、瀘州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室瀘州醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室 劉佳佳劉佳佳20010年年4月月親和層析及沉淀被認(rèn)為是分離純化酶及親和層析及沉淀被認(rèn)為是分離純化酶及蛋白質(zhì)的強(qiáng)有力的技術(shù)手段，這種方法可蛋白質(zhì)的強(qiáng)有力的技術(shù)手段，這種方法可以較經(jīng)濟(jì)有效地使用配基，能夠大規(guī)模、以較經(jīng)濟(jì)有效地使用配基，能夠大規(guī)模、快速、快速、特異性特異性地分離、純化酶及蛋白質(zhì)。地分離、純化酶及蛋白質(zhì)。 蛋白質(zhì)（酶）存在于一切生物體中，是蛋白質(zhì)（酶）存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)的執(zhí)行者，擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)、防御、調(diào)控及

2、記憶、識(shí)別等多種生理功動(dòng)、防御、調(diào)控及記憶、識(shí)別等多種生理功能。能。蛋白質(zhì)分離純化是用蛋白質(zhì)分離純化是用生物工程下游技術(shù)生物工程下游技術(shù)從混從混合物之中分離純化出所需要得到的目的蛋白質(zhì)的合物之中分離純化出所需要得到的目的蛋白質(zhì)的方法。蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)是當(dāng)代生物產(chǎn)業(yè)和生方法。蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)是當(dāng)代生物產(chǎn)業(yè)和生命科學(xué)研究當(dāng)中的核心技術(shù)。該技術(shù)難度和成本命科學(xué)研究當(dāng)中的核心技術(shù)。該技術(shù)難度和成本均高；例如一個(gè)生物藥品的成本均高；例如一個(gè)生物藥品的成本75%都花在下游都花在下游蛋白質(zhì)分離純化當(dāng)中。蛋白質(zhì)分離純化當(dāng)中。 生物工程上游技術(shù)生物工程上游技術(shù): :是理論的研究是理論的研究, , 技術(shù)的開發(fā)

3、等技術(shù)的開發(fā)等, , 如：基因工程、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究等。如：基因工程、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能研究等。 生物工程下游技術(shù)：生物工程下游技術(shù)：一般包括產(chǎn)物（一般為蛋白質(zhì)）一般包括產(chǎn)物（一般為蛋白質(zhì)）的預(yù)處理及分離純化；產(chǎn)品的成型加工和質(zhì)量監(jiān)控等一的預(yù)處理及分離純化；產(chǎn)品的成型加工和質(zhì)量監(jiān)控等一系列單元操作和過程中的主要技術(shù)系列單元操作和過程中的主要技術(shù), ,其中其中生化產(chǎn)物及發(fā)生化產(chǎn)物及發(fā)酵產(chǎn)物的分離純化是其核心內(nèi)容酵產(chǎn)物的分離純化是其核心內(nèi)容。下游技術(shù)是生物工程。下游技術(shù)是生物工程重要組成部分重要組成部分, ,是生物高科技技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵，是生物高科技技術(shù)實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵，如：酶工程如：酶工程

4、 , , 發(fā)酵工程等（提取干擾素、胰島素和酶發(fā)酵工程等（提取干擾素、胰島素和酶等）。等）。 從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。義。工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。芽糖、糊精以及糖漿等。 醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病

5、。 基因工程的需要：基因工程的需要：DNA合成酶、合成酶、RNA逆轉(zhuǎn)錄酶等。逆轉(zhuǎn)錄酶等。 分離蛋白質(zhì)常用的純化方法有分離蛋白質(zhì)常用的純化方法有超速離心超速離心和梯度密度離心法、和梯度密度離心法、鹽析法、電泳、凝膠過鹽析法、電泳、凝膠過濾（分子篩）、離子交換層析、親和層析以濾（分子篩）、離子交換層析、親和層析以及高效液相色譜等方法及高效液相色譜等方法 。親和沉析技術(shù)。親和沉析技術(shù)是純化各種生物大分子最有效的方法之一。是純化各種生物大分子最有效的方法之一。 超速離心超速離心 是分離亞細(xì)胞及蛋白質(zhì)大分子的有效手是分離亞細(xì)胞及蛋白質(zhì)大分子的有效手段，往往是進(jìn)一步純化的第一次過篩。超速離心又分段，往往是

6、進(jìn)一步純化的第一次過篩。超速離心又分差速離心差速離心和和梯度離心梯度離心。用超速離心或梯度離心分離和。用超速離心或梯度離心分離和純化抗原只是一種根據(jù)蛋白的比重特點(diǎn)分離的方法，純化抗原只是一種根據(jù)蛋白的比重特點(diǎn)分離的方法，除個(gè)別成分外，極難將某一抗原成分分離出來。目前除個(gè)別成分外，極難將某一抗原成分分離出來。目前僅用于少部分大分子抗原，如僅用于少部分大分子抗原，如IgMIgM、C1qC1q、甲狀腺球蛋甲狀腺球蛋白等，以及一些比重較輕的抗原蛋白如載脂蛋白白等，以及一些比重較輕的抗原蛋白如載脂蛋白A A、B B等。對(duì)于大量的中、小分子量蛋白質(zhì)，多不適宜用超等。對(duì)于大量的中、小分子量蛋白質(zhì)，多不適宜用

7、超速及梯度密度離心作為純化手段。速及梯度密度離心作為純化手段。 鹽析沉淀法鹽析沉淀法 是最古老而又經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化是最古老而又經(jīng)典的蛋白質(zhì)純化分離技術(shù)。由于方法簡(jiǎn)便、有效、不損害蛋白分離技術(shù)。由于方法簡(jiǎn)便、有效、不損害蛋白抗原活性等優(yōu)點(diǎn)，至今仍被廣泛應(yīng)用?？乖钚缘葍?yōu)點(diǎn)，至今仍被廣泛應(yīng)用。 鹽析法原理鹽析沉淀法的原理鹽析沉淀法的原理 因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是親水性大分子，所以在水溶液中有雙電因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是親水性大分子，所以在水溶液中有雙電層結(jié)構(gòu)的水合膜，來保證分子的溶解度平衡并穩(wěn)定存在。層結(jié)構(gòu)的水合膜，來保證分子的溶解度平衡并穩(wěn)定存在。 當(dāng)加入鹽時(shí)，鹽會(huì)電離成離子態(tài)，離子的電性破壞了蛋白當(dāng)加入鹽時(shí)，鹽會(huì)電離

8、成離子態(tài)，離子的電性破壞了蛋白質(zhì)的雙電層的水合膜結(jié)構(gòu)，從而使其沉降，析出。質(zhì)的雙電層的水合膜結(jié)構(gòu)，從而使其沉降，析出。 加入濃酸和濃堿是不行的，苛性的環(huán)境將使蛋白質(zhì)變性。加入濃酸和濃堿是不行的，苛性的環(huán)境將使蛋白質(zhì)變性。 凝膠過濾和離子交換層析凝膠過濾和離子交換層析 凝膠過濾凝膠過濾又稱凝膠柱層析、分子篩層析，利用微孔凝又稱凝膠柱層析、分子篩層析，利用微孔凝膠，將不同分子量的成分分離。膠，將不同分子量的成分分離。離子交換層析離子交換層析是利用一是利用一些帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附帶相反電荷的蛋白些帶離子基團(tuán)的纖維素或凝膠，吸附帶相反電荷的蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)按帶電荷不同或量的差異分成不同的組分

9、。質(zhì)，將蛋白質(zhì)按帶電荷不同或量的差異分成不同的組分。這兩種層析如能共同應(yīng)用或者反復(fù)應(yīng)用其中的一種，皆這兩種層析如能共同應(yīng)用或者反復(fù)應(yīng)用其中的一種，皆可將某一蛋白質(zhì)從一復(fù)雜的組分中純化出來?？蓪⒛骋坏鞍踪|(zhì)從一復(fù)雜的組分中純化出來。 凝膠過濾凝膠過濾( (分子篩層析分子篩層析) )圖示圖示1凝膠過濾凝膠過濾( (分子篩層析分子篩層析) )圖示圖示2 2 離子交換層析柱離子交換層析柱親和層析親和層析 是利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分是利用生物大分子的生物學(xué)特異性，即生物分子間所具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。子間所具有的專一性親和力而設(shè)計(jì)的層析技術(shù)。 例如例如抗原和抗體（抗原和抗體（免疫

10、免疫親和層析親和層析）、 酶和酶抑制劑（或配酶和酶抑制劑（或配體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊體）、酶蛋白和輔酶、激素和受體等之間有一種特殊的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結(jié)合成復(fù)合的親和力，在一定條件下，它們能緊密地結(jié)合成復(fù)合物。如果將復(fù)合物的一方固定在不溶性載體或共價(jià)結(jié)物。如果將復(fù)合物的一方固定在不溶性載體或共價(jià)結(jié)合在一種惰性的微珠上，則可從溶液中專一地分離和合在一種惰性的微珠上，則可從溶液中專一地分離和提純另一方。與上述其他純化方法相比，親和層析能提純另一方。與上述其他純化方法相比，親和層析能產(chǎn)生相當(dāng)高的純化作用。另外，此法的優(yōu)點(diǎn)是迅速，產(chǎn)生相當(dāng)高的純化作用。另外，此法

11、的優(yōu)點(diǎn)是迅速，有時(shí)僅一步即可達(dá)到純化的目的。有時(shí)僅一步即可達(dá)到純化的目的。 親和純化親和純化(affinity purification)是是基于目標(biāo)分子與固定化配體的特異基于目標(biāo)分子與固定化配體的特異性相互作用性相互作用(如：抗原如：抗原-抗體抗體)。親和。親和技術(shù)可用來從混和物中分離特定分技術(shù)可用來從混和物中分離特定分子。子。捕獲目標(biāo)分子用于相互作用研捕獲目標(biāo)分子用于相互作用研究究, 或從反應(yīng)體系中去除某一成分?；驈姆磻?yīng)體系中去除某一成分。免疫親和純化是一種分離各種生物大分子最有效的方法免疫親和純化是一種分離各種生物大分子最有效的方法特點(diǎn)：特點(diǎn)：1、高純化率，通常為常規(guī)純化的、高純化率，通

12、常為常規(guī)純化的1,000-10,000倍以上。倍以上。2、由于內(nèi)在的背景限制，如目標(biāo)抗原量非常稀少，需與其他方法結(jié)、由于內(nèi)在的背景限制，如目標(biāo)抗原量非常稀少，需與其他方法結(jié) 合才能獲得均質(zhì)性產(chǎn)物。合才能獲得均質(zhì)性產(chǎn)物。3、快速純化抗原，層析柱?？芍貜?fù)使用。可按照不同規(guī)模進(jìn)行，半、快速純化抗原，層析柱常可重復(fù)使用?？砂凑詹煌?guī)模進(jìn)行，半 天內(nèi)即可完成。天內(nèi)即可完成。4、不僅適用于純化抗原，也可用來分離經(jīng)過初步純化的抗體，乃至、不僅適用于純化抗原，也可用來分離經(jīng)過初步純化的抗體，乃至 所有能與相應(yīng)配體有效結(jié)合的生物分子。所有能與相應(yīng)配體有效結(jié)合的生物分子。5、抗體與其相應(yīng)抗原結(jié)合具有高度親和力和特

13、異性，能大量分離天、抗體與其相應(yīng)抗原結(jié)合具有高度親和力和特異性，能大量分離天 然狀態(tài)或近似天然狀態(tài)的抗原。然狀態(tài)或近似天然狀態(tài)的抗原。6、需要適當(dāng)純化的抗體，不是所有的抗體都適用于免疫親和層析，、需要適當(dāng)純化的抗體，不是所有的抗體都適用于免疫親和層析， 但一旦獲得一種性能良好的抗體，純化過程就簡(jiǎn)單、快速、可靠但一旦獲得一種性能良好的抗體，純化過程就簡(jiǎn)單、快速、可靠 。 7、不能用于定量測(cè)定。、不能用于定量測(cè)定。 免疫親和純化技術(shù)發(fā)展歷史：免疫親和純化技術(shù)發(fā)展歷史：最早是將抗體作為一種結(jié)合劑最早是將抗體作為一種結(jié)合劑用于免疫親和純化，根據(jù)其自身交聯(lián)產(chǎn)生大量多聚體和不用于免疫親和純化，根據(jù)其自身交

14、聯(lián)產(chǎn)生大量多聚體和不溶性基質(zhì)原理收集抗原。隨后利用抗體與惰性微珠共價(jià)結(jié)溶性基質(zhì)原理收集抗原。隨后利用抗體與惰性微珠共價(jià)結(jié)合，雖然這是一種簡(jiǎn)單的結(jié)合，但抗體的許多反應(yīng)性因缺合，雖然這是一種簡(jiǎn)單的結(jié)合，但抗體的許多反應(yīng)性因缺乏定位作用或抗體的過量結(jié)合而喪失。通過研究發(fā)現(xiàn)，抗乏定位作用或抗體的過量結(jié)合而喪失。通過研究發(fā)現(xiàn)，抗體與體與蛋白蛋白A A和和蛋白蛋白G G微珠共價(jià)連接后更容易與抗原結(jié)合。將微珠共價(jià)連接后更容易與抗原結(jié)合。將具有良好抗原結(jié)合特性且來源廣泛的各種單克隆抗體制成具有良好抗原結(jié)合特性且來源廣泛的各種單克隆抗體制成免疫親和層析柱，已成為一種最適用和有效的純化方法。免疫親和層析柱，已成為

15、一種最適用和有效的純化方法。親和層析技術(shù)最先是由親和層析技術(shù)最先是由CuatrecasasCuatrecasas等人建立（等人建立（19681968年）。年）。 BCX2003P2.PPT 影響免疫親和層析純化效果的因素影響免疫親和層析純化效果的因素抗原初始相對(duì)濃度（即純度）：抗原初始相對(duì)濃度（即純度）：是決定最終產(chǎn)物純度是決定最終產(chǎn)物純度極為重要的因素。極為重要的因素。抗原與抗體的親和力：抗原與抗體的親和力：是免疫親和純化層析過程中最是免疫親和純化層析過程中最麻煩的問題。高親和力抗體麻煩的問題。高親和力抗體（10-8 mol/L)能在能在1 h以內(nèi)以內(nèi)達(dá)到有效的分離，而低親和力的抗體達(dá)到有效

16、的分離，而低親和力的抗體(10-6 mol/L）即即使在高濃度時(shí)也不能結(jié)合溶液中的全部抗原。使用針使在高濃度時(shí)也不能結(jié)合溶液中的全部抗原。使用針對(duì)同一抗原多個(gè)表位的多克隆抗體以增強(qiáng)親和力的方對(duì)同一抗原多個(gè)表位的多克隆抗體以增強(qiáng)親和力的方法固然可結(jié)合較多的抗原，但增加了洗脫的困難性。法固然可結(jié)合較多的抗原，但增加了洗脫的困難性。只有當(dāng)所需的最終產(chǎn)物為變性蛋白時(shí)，才選用識(shí)別多只有當(dāng)所需的最終產(chǎn)物為變性蛋白時(shí)，才選用識(shí)別多個(gè)表位的抗體。個(gè)表位的抗體。免疫親和純化的關(guān)鍵：免疫親和純化的關(guān)鍵：高親和力與容易洗脫的優(yōu)高親和力與容易洗脫的優(yōu)化組合?；M合。常見錯(cuò)誤是將低親和力和容易洗脫等同看待。常見錯(cuò)誤是將

17、低親和力和容易洗脫等同看待。1親和層析支持物的選擇親和層析支持物的選擇: :作為親和層析支持物須作為親和層析支持物須符合以下要求：符合以下要求：非特異性吸附低；非特異性吸附低；液體通過液體通過時(shí)流速要快；時(shí)流速要快；在各種在各種pH和高濃度鹽溶液中穩(wěn)和高濃度鹽溶液中穩(wěn)定；定；必須有合適的、豐富的化學(xué)基團(tuán)，能有效必須有合適的、豐富的化學(xué)基團(tuán)，能有效地與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié)合；地與蛋白質(zhì)或其它化合物結(jié)合；必須帶有豐富必須帶有豐富的微孔，以增加結(jié)合容量。的微孔，以增加結(jié)合容量。符合以上符合以上5個(gè)條件的個(gè)條件的支持物有瓊脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其支持物有瓊脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其中常用

18、的是瓊脂糖珠（中常用的是瓊脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。）。 2配體的選擇配體的選擇:所謂配體系指具有親和性的雙方，作為免疫親所謂配體系指具有親和性的雙方，作為免疫親和層析專指抗原與抗體。良好的配體必須具備以下和層析專指抗原與抗體。良好的配體必須具備以下3個(gè)條件。個(gè)條件。（1）抗原或抗體必須單一特異性：抗原或抗體必須單一特異性：抗原或抗體的純化效果決定于固相中抗原或抗體的純化效果決定于固相中配體的純度。配體的純度。（2）抗原與抗體之間必須有強(qiáng)的親和力：抗原與抗體之間必須有強(qiáng)的親和力：這種親和力決定于抗原決定簇這種親和力決定于抗原決定簇的性質(zhì)和數(shù)量。對(duì)抗體來說還決定于抗體來源動(dòng)物

19、的種類和免疫時(shí)間，如的性質(zhì)和數(shù)量。對(duì)抗體來說還決定于抗體來源動(dòng)物的種類和免疫時(shí)間，如馬抗血清親和力較低，免疫血清親和力較高；免疫時(shí)間短的親和力低。但馬抗血清親和力較低，免疫血清親和力較高；免疫時(shí)間短的親和力低。但是，親和力太強(qiáng)也不利，因?yàn)榻怆x抗原抗體復(fù)合物所需要的條件就要強(qiáng)烈是，親和力太強(qiáng)也不利，因?yàn)榻怆x抗原抗體復(fù)合物所需要的條件就要強(qiáng)烈，從而可造成蛋白質(zhì)的變性。例如用低，從而可造成蛋白質(zhì)的變性。例如用低pH（1.52.5）或高鹽（如或高鹽（如6 mol/L鹽酸胍）可使部分抗原或抗體活性降低或喪失。鹽酸胍）可使部分抗原或抗體活性降低或喪失。（3）配體必須有一個(gè)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)基團(tuán)：配體必須有一個(gè)適當(dāng)

20、的化學(xué)基團(tuán)：這個(gè)基團(tuán)不參與配體和大分子的這個(gè)基團(tuán)不參與配體和大分子的特異結(jié)合，但可用來連接支持物，而且這種連接不應(yīng)當(dāng)影響配體與大分子特異結(jié)合，但可用來連接支持物，而且這種連接不應(yīng)當(dāng)影響配體與大分子結(jié)合的親和性。結(jié)合的親和性。3抗原或抗體與支持物的結(jié)合將抗原抗原或抗體與支持物的結(jié)合將抗原或抗體結(jié)合到支持物上的方法目前有或抗體結(jié)合到支持物上的方法目前有20多多種，但可歸結(jié)為載體結(jié)合法、物理吸附法、種，但可歸結(jié)為載體結(jié)合法、物理吸附法、交聯(lián)法和網(wǎng)絡(luò)法交聯(lián)法和網(wǎng)絡(luò)法4類。類。 結(jié)合法的一般步驟是先活化支持物上的結(jié)合法的一般步驟是先活化支持物上的功能基團(tuán)，然后將抗原或抗體連接到這些活功能基團(tuán)，然后將抗原

21、或抗體連接到這些活化的基團(tuán)上。用來發(fā)生交聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)必須化的基團(tuán)上。用來發(fā)生交聯(lián)的化學(xué)反應(yīng)必須足夠溫和，不致使抗原或抗體遭到破壞。交足夠溫和，不致使抗原或抗體遭到破壞。交聯(lián)后，要徹底清洗支持物，以除去剩下的未聯(lián)后，要徹底清洗支持物，以除去剩下的未交聯(lián)的物質(zhì)。交聯(lián)的物質(zhì)。 最常用的支持物是最常用的支持物是Separose 4B，將此支持物與溴化氰將此支持物與溴化氰在在pH11時(shí)進(jìn)行處理，則能使支持物活化。此時(shí)溴化氰與支持時(shí)進(jìn)行處理，則能使支持物活化。此時(shí)溴化氰與支持物上的羥式反應(yīng)形成氨基甲酸酯基團(tuán)。加入溴化氰的量取決物上的羥式反應(yīng)形成氨基甲酸酯基團(tuán)。加入溴化氰的量取決于支持物的量。如果希望取代程

22、度提高，則加入溴化氰的量于支持物的量。如果希望取代程度提高，則加入溴化氰的量也要提高。交聯(lián)時(shí)首先要注意加入抗原或抗體的濃度。通常也要提高。交聯(lián)時(shí)首先要注意加入抗原或抗體的濃度。通常在交聯(lián)反應(yīng)混合物中的交聯(lián)蛋白質(zhì)濃度應(yīng)是親和分離濃度的在交聯(lián)反應(yīng)混合物中的交聯(lián)蛋白質(zhì)濃度應(yīng)是親和分離濃度的2030倍。這樣，溴化氰濃度也必須提高到倍。這樣，溴化氰濃度也必須提高到 200 mg/ml凝膠。凝膠。若希望最終產(chǎn)物含量較少，所加入的溴化氰也應(yīng)減少。交聯(lián)若希望最終產(chǎn)物含量較少，所加入的溴化氰也應(yīng)減少。交聯(lián)時(shí)的時(shí)的pH也應(yīng)注意，也應(yīng)注意，pH9.510時(shí)，活化的瓊脂糖珠很不穩(wěn)定。時(shí)，活化的瓊脂糖珠很不穩(wěn)定。降低降

23、低pH，也就減少了能反應(yīng)的配體濃度，交聯(lián)量就會(huì)減少。也就減少了能反應(yīng)的配體濃度，交聯(lián)量就會(huì)減少。 親和層析中常用小分子抗原或其它化合物與支持物交聯(lián)，親和層析中常用小分子抗原或其它化合物與支持物交聯(lián)，由于載體空間的位阻而影響了與抗原或其它親和物的結(jié)合，由于載體空間的位阻而影響了與抗原或其它親和物的結(jié)合，產(chǎn)生了所謂的產(chǎn)生了所謂的無效吸附無效吸附。另外，。另外，Sepharose 4B交聯(lián)時(shí)要求有交聯(lián)時(shí)要求有一游離的氨基，如果該抗原有具氨基則難于交聯(lián)?；谶@兩一游離的氨基，如果該抗原有具氨基則難于交聯(lián)?；谶@兩個(gè)原因，通常在瓊脂糖與抗原之間接上不同長(zhǎng)度的個(gè)原因，通常在瓊脂糖與抗原之間接上不同長(zhǎng)度的“

24、手臂手臂”。必要時(shí)這些必要時(shí)這些“手臂手臂”末端可接上游離氨基，以與不帶氨基的末端可接上游離氨基，以與不帶氨基的配基偶聯(lián)。常用的帶配基偶聯(lián)。常用的帶“手臂手臂”瓊脂糖有氨基瓊脂糖（二亞瓊脂糖有氨基瓊脂糖（二亞胺）、羧基瓊脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰瓊脂糖（胺）、羧基瓊脂糖（琥珀酸酐）、溴乙酰瓊脂糖（0-溴乙酰溴乙酰-N羧基琥珀酰胺）、重氮鹽衍生物瓊脂糖和疏基瓊脂糖等。羧基琥珀酰胺）、重氮鹽衍生物瓊脂糖和疏基瓊脂糖等。這些帶這些帶“手臂手臂”的瓊脂糖有商品供應(yīng)，使用極為方便。的瓊脂糖有商品供應(yīng)，使用極為方便。 親和純化的多克隆抗體親和純化的多克隆抗體 單克隆抗體單克隆抗體信號(hào)強(qiáng)度信號(hào)強(qiáng)度(抗體結(jié)合容

25、量）抗體結(jié)合容量） 非常好非常好 視抗體而異，但應(yīng)該非常好視抗體而異，但應(yīng)該非常好特異性特異性 非常好非常好 非常好非常好優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 洗脫峰形易分辨（已知），洗脫峰形易分辨（已知）， 應(yīng)用不受限制，特異性強(qiáng)應(yīng)用不受限制，特異性強(qiáng) 特異性強(qiáng)特異性強(qiáng)缺點(diǎn)缺點(diǎn) 制備困難，應(yīng)用受限制備困難，應(yīng)用受限 需要篩選合適的抗體需要篩選合適的抗體 注：不推薦將未經(jīng)純化的多克隆抗體或混合的單克隆抗體用于免疫親和純化。注：不推薦將未經(jīng)純化的多克隆抗體或混合的單克隆抗體用于免疫親和純化。 免疫親和純化層析的基本操作步驟：免疫親和純化層析的基本操作步驟：交聯(lián)交聯(lián)結(jié)合結(jié)合洗脫洗脫1、將抗體與基質(zhì)（微珠）共價(jià)交聯(lián)并制備抗體親

26、和層析柱。、將抗體與基質(zhì)（微珠）共價(jià)交聯(lián)并制備抗體親和層析柱。2、將抗原結(jié)合到抗體、將抗原結(jié)合到抗體-基質(zhì)微珠上?；|(zhì)微珠上。3、抗原的洗脫。、抗原的洗脫。 親和層析條件的選擇：親和層析條件的選擇：（1）支持物與抗原或抗體結(jié)合后，還可能有多余的活性基團(tuán)，）支持物與抗原或抗體結(jié)合后，還可能有多余的活性基團(tuán)， 為了封為了封閉這些殘基團(tuán)，必須用無關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過一次柱，以封閉活性基團(tuán)閉這些殘基團(tuán)，必須用無關(guān)蛋白質(zhì)或三乙醇胺過一次柱，以封閉活性基團(tuán)。（2）去掉未結(jié)合及結(jié)合不牢固的蛋白質(zhì)。）去掉未結(jié)合及結(jié)合不牢固的蛋白質(zhì)。 先用先用0.2 mol/L NaHCO2（含含0.1 mol/L NaC1，

27、pH 9.0）洗脫洗脫23個(gè)柱體積，再用解脫劑處理一次親和個(gè)柱體積，再用解脫劑處理一次親和層析柱。層析柱。（3）解脫劑有多種：常用的有）解脫劑有多種：常用的有0.2 mol/L pH 2.8 甘氨酸甘氨酸HC1緩沖液、緩沖液、0.1mol/L pH2.4甘氨酸緩沖液、甘氨酸緩沖液、7 mol/L脲、脲、5 mol/L NaI、3 mol/L硫氰酸硫氰酸鉀（或鈉）、鉀（或鈉）、1 mol/L乙酸、乙酸、6 mol/L鹽酸胍、鹽酸胍、0.2 mol/L KC1等。作為抗原等。作為抗原抗體解脫劑，最多用的是抗體解脫劑，最多用的是3 mol/L硫氰酸鉀（或鈉）及硫氰酸鉀（或鈉）及0.1 mol/L p

28、H 2.4甘甘氨酸緩沖液。氨酸緩沖液?？贵w親和層析柱的制備：抗體親和層析柱的制備：抗體與固相基質(zhì)的連接：抗體與固相基質(zhì)的連接：1、最常用的基質(zhì)為蛋白、最常用的基質(zhì)為蛋白A和蛋白和蛋白G微珠，微珠， 可與抗體的可與抗體的Fc功能區(qū)特異結(jié)合。功能區(qū)特異結(jié)合。2、將抗體直接與一種活性微珠（表達(dá)活、將抗體直接與一種活性微珠（表達(dá)活 性的反應(yīng)基團(tuán)）連接。性的反應(yīng)基團(tuán)）連接。 抗體與微珠的結(jié)合方法抗體與微珠的結(jié)合方法試劑試劑 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)缺點(diǎn) 與抗體結(jié)合的基團(tuán)與抗體結(jié)合的基團(tuán)蛋白A 抗體定向確切， 粒柱還能與其他無關(guān) 二甲基庚二酸酯 -NH2 容易結(jié)合 的抗體結(jié)合，昂貴 蛋白G 抗體定向確切， 粒柱還能

29、與其他無關(guān) 二甲基庚二酸酯 -NH2 容易結(jié)合 的抗體結(jié)合，昂貴 活性微珠 價(jià)廉，不結(jié)合 抗體無定向性，且常 羰基二咪唑 -NH2 其他無關(guān)抗體 因過量結(jié)合而損傷 溴化氰 -NH2 羥基丁二酰亞胺 -NH2 碘乙酰基 -NH2 氯化tresyl -NH2,-SH從免疫親和層析柱上洗脫抗原：從免疫親和層析柱上洗脫抗原：理想的理想的洗脫峰形為一清晰的尖峰，用單一的緩沖液處理洗脫峰形為一清晰的尖峰，用單一的緩沖液處理后可使抗原完全釋放。探索最佳的洗脫條件是一后可使抗原完全釋放。探索最佳的洗脫條件是一項(xiàng)積累經(jīng)驗(yàn)的工作。項(xiàng)積累經(jīng)驗(yàn)的工作。有三種方法：有三種方法： 1、用較強(qiáng)烈的條件處理、用較強(qiáng)烈的條件處

30、理; 2、加入模擬結(jié)合位點(diǎn)的飽和量小分子化合物、加入模擬結(jié)合位點(diǎn)的飽和量小分子化合物; 3、使用一種能引起構(gòu)象改變而使抗原釋出的、使用一種能引起構(gòu)象改變而使抗原釋出的 試劑。試劑。 洗滌液和洗脫液的選擇洗滌液和洗脫液的選擇免疫沉淀技術(shù)是利用抗體與相應(yīng)抗原免疫沉淀技術(shù)是利用抗體與相應(yīng)抗原的高親和力特性作為檢出和結(jié)合溶液中的高親和力特性作為檢出和結(jié)合溶液中靶分子的方法，通過將抗原聚集在惰性靶分子的方法，通過將抗原聚集在惰性微珠上，可以簡(jiǎn)單快速的將抗原純化微珠上，可以簡(jiǎn)單快速的將抗原純化1000-10000倍。倍。 免疫沉淀免疫沉淀 (Immunoprecipitation)免疫沉淀的應(yīng)用：免疫沉淀

31、的應(yīng)用： 1、目標(biāo)抗原的純化。、目標(biāo)抗原的純化。 2、確定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。、確定蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量。 3、測(cè)定蛋白質(zhì)抗原半壽期。、測(cè)定蛋白質(zhì)抗原半壽期。 4、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的測(cè)定。、蛋白質(zhì)翻譯后修飾的測(cè)定。 5、研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。、研究蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用。 6、蛋白質(zhì)內(nèi)在或相關(guān)酶活性的測(cè)定。、蛋白質(zhì)內(nèi)在或相關(guān)酶活性的測(cè)定。 7、裂解物特定抗原的清除。、裂解物特定抗原的清除。免疫沉淀的特點(diǎn)：免疫沉淀的特點(diǎn)：1、確定抗原的存在、質(zhì)量、大小、轉(zhuǎn)換、修飾及相關(guān)性；、確定抗原的存在、質(zhì)量、大小、轉(zhuǎn)換、修飾及相關(guān)性；2、多個(gè)步驟共需、多個(gè)步驟共需1/2-1天；天；3、半定量

32、到定量；、半定量到定量；4、敏感性取決于抗原的相對(duì)質(zhì)量及抗體的親和力；、敏感性取決于抗原的相對(duì)質(zhì)量及抗體的親和力；5、需要高親和力的抗體。、需要高親和力的抗體。 免疫沉淀的主要影響因素：免疫沉淀的主要影響因素：1、抗原原液的豐度、抗原原液的豐度2、抗體對(duì)抗原的親和力、抗體對(duì)抗原的親和力 合適抗體的選擇合適抗體的選擇 多克隆抗體多克隆抗體 單克隆抗體單克隆抗體 混合單克隆抗體混合單克隆抗體反應(yīng)強(qiáng)度 極好 極差到極好 極好特異性 良好 極好 極好，存在交叉反應(yīng)優(yōu)點(diǎn) 穩(wěn)定，多價(jià)反應(yīng) 特異，供應(yīng)不受限制 兼?zhèn)淙秉c(diǎn) 本底不易清除 需對(duì)抗原有高親和力 供應(yīng)不普遍免疫沉淀步驟：免疫沉淀步驟：一、抗原溶液的制

33、備一、抗原溶液的制備二、裂解物非特異性本底的預(yù)處理二、裂解物非特異性本底的預(yù)處理三、免疫復(fù)合物的形成與純化三、免疫復(fù)合物的形成與純化 /courses/genomics/IMPfolder/IMPQ.html一、抗原溶液的制備一、抗原溶液的制備1、裂解細(xì)胞：、裂解細(xì)胞： 細(xì)胞裂解過程中有多種蛋白酶釋放，會(huì)導(dǎo)致蛋細(xì)胞裂解過程中有多種蛋白酶釋放，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解從而影響免疫沉淀，解決方法有兩白質(zhì)的降解從而影響免疫沉淀，解決方法有兩種：低溫操作或加入蛋白酶抑制劑。種：低溫操作或加入蛋白酶抑制劑。 2、裂解液的選擇：、裂解液的選擇：裂解條件應(yīng)盡量溫

34、和，以保護(hù)抗體結(jié)合位點(diǎn)及裂解條件應(yīng)盡量溫和，以保護(hù)抗體結(jié)合位點(diǎn)及避免蛋白的溶解，但裂解條件又應(yīng)足夠劇烈，避免蛋白的溶解，但裂解條件又應(yīng)足夠劇烈，以保證抗原的定量釋放。對(duì)于去污劑的使用，以保證抗原的定量釋放。對(duì)于去污劑的使用，非離子型非離子型優(yōu)于離子型，低濃度優(yōu)于高濃度，單優(yōu)于離子型，低濃度優(yōu)于高濃度，單離子優(yōu)于混合型。免疫沉淀最常用的去污劑是離子優(yōu)于混合型。免疫沉淀最常用的去污劑是NP40和和RIPA，它們能釋放大部分可溶性的胞漿它們能釋放大部分可溶性的胞漿蛋白和核蛋白，而且不損傷染色體蛋白和核蛋白，而且不損傷染色體DNA。最好最好不要釋放不要釋放DNA，因其影響溶液的粘著性。因其影響溶液的粘

35、著性。 3、裂解原則：、裂解原則：在釋放盡可能多抗原、引起在釋放盡可能多抗原、引起盡可能少蛋白變性的前提下，將可溶性盡可能少蛋白變性的前提下，將可溶性抗原從基質(zhì)顆粒中分離出來，并且要避抗原從基質(zhì)顆粒中分離出來，并且要避免和消除大分子免和消除大分子DNA進(jìn)入溶液。進(jìn)入溶液。 4、裂解方法：、裂解方法：組織培養(yǎng)細(xì)胞的裂解：最普遍的問題是抗原不組織培養(yǎng)細(xì)胞的裂解：最普遍的問題是抗原不能完全從細(xì)胞中釋放。一般不推薦凍融法，因能完全從細(xì)胞中釋放。一般不推薦凍融法，因反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)過量降解，原因不明。機(jī)反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)過量降解，原因不明。機(jī)械性剪切（使用超聲波發(fā)生器、械性剪切（使用超聲波發(fā)生器、Dounce勻漿器、勻漿器、波特器和攪拌器等）特別適用于大體積制備或波特器和攪拌器等）特別適用于大體積制備或需避免