1、肺炎鏈球菌檢測(cè)方法及耐藥研究(一)【關(guān)鍵詞】 肺炎鏈球菌 檢測(cè)方法 耐藥研究肺炎鏈球菌（Streptococcus Pneumoniae, SP）是兒科社區(qū)獲得性感染的主要病原菌之一，它可引起兒童肺炎、腦膜炎、敗血癥、中耳炎、鼻竇炎。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全球每年約有超過(guò)120萬(wàn)人死于SP感染性疾病，其中大多數(shù)為2歲以下兒童1。早期有效的抗生素治療可大大降低病死率，因此在臨床工作中，應(yīng)用快速、可靠的診斷技術(shù)檢測(cè)SP感染，及早使用有效抗生素治療顯得尤為重要。近年來(lái)SP分離株對(duì)青霉素、頭孢菌素、大環(huán)內(nèi)酯類等多種抗菌藥物耐藥性在全球呈普遍上升趨勢(shì)，SP耐藥性的擴(kuò)散及多重耐藥菌株的出現(xiàn)成為臨床上引起廣泛關(guān)注的

2、問(wèn)題。1 SP檢測(cè)方法1.1 細(xì)菌培養(yǎng)在臨床實(shí)踐中，對(duì)社區(qū)獲得性肺炎患者通過(guò)應(yīng)用常規(guī)的檢測(cè)方法來(lái)確定病原菌仍存在許多障礙。從血液或胸腔積液培養(yǎng)分離獲得SP仍然作為診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但它的陽(yáng)性率僅10%30%，甚至更低2。SP可定植于健康人群的鼻咽部及不充足或不恰當(dāng)?shù)奶禈?biāo)本使得基于痰培養(yǎng)的診斷標(biāo)準(zhǔn)飽受爭(zhēng)議。此外，近1/3的患者進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)前已接受了抗生素治療，這又降低了這種傳統(tǒng)的檢測(cè)手段的敏感性。若通過(guò)一些創(chuàng)傷性操作所獲得的標(biāo)本（如支氣管灌洗液、肺穿刺獲得的肺組織等）培養(yǎng)分離得到SP，則對(duì)病原學(xué)的診斷具有決定性意義。但是，由于創(chuàng)傷性技術(shù)需要專業(yè)人員進(jìn)行操作并且有發(fā)生并發(fā)癥的可能，因此不作為常規(guī)檢查

3、。雖然細(xì)菌培養(yǎng)所需要等待的時(shí)間較長(zhǎng)（一般35 d），可能出現(xiàn)假陰性的結(jié)果（后者與標(biāo)本量過(guò)少、已接受抗生素治療或不理想的實(shí)驗(yàn)室條件均有關(guān)），但由于它是進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及對(duì)流行株進(jìn)行流行病學(xué)分析的基礎(chǔ)，因此該技術(shù)在臨床上仍有不可取代的地位。1.2 免疫層析法免疫層析法（ICT）是目前廣泛用于SP診斷的快速方法。其檢測(cè)的抗原為Cpolysaccharide抗原，是位于細(xì)菌細(xì)胞壁的C多糖，為SP各血清型所共有。由于ICT以尿樣為檢測(cè)對(duì)象，故又稱為尿抗原檢測(cè)法。目前世界各國(guó)采用的是美國(guó)緬因州波特蘭Binax公司生產(chǎn)的Binax NOWICT試劑盒。這是個(gè)非常簡(jiǎn)便的方法，只需15 min便可完成。該方法推薦使

4、用的標(biāo)本為標(biāo)準(zhǔn)的非濃縮尿樣。將拭子條浸入尿樣后置于檢測(cè)卡中，再加入6滴試劑，15 min后出現(xiàn)1條色帶的為陰性，2條色帶的為陽(yáng)性結(jié)果3。該試劑盒在臨床診斷中具有較好的敏感性和特異性。據(jù)現(xiàn)有的報(bào)道敏感性為67%92%（大多為75%85%），特異性為90%100%。該試劑盒同樣可用于檢測(cè)胸腔積液、腦脊液和支氣管灌洗液。20022006年，西班牙的Jose M. Porcel等人采用該試劑盒對(duì)患者的胸水進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)敏感性為70.6%，特異性為93.3%。該方法較突出的優(yōu)點(diǎn)是抗生素的使用并不影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，因此它不能用于評(píng)價(jià)抗生素治療效果。在感染后1月內(nèi)該試驗(yàn)均可陽(yáng)性，這也造成了那些反復(fù)感染的

5、病例被誤診的潛在可能性。特別在兒童中，由于SP的定植造成該試驗(yàn)非特異性陽(yáng)性的問(wèn)題已逐漸引起了關(guān)注。盡管該試驗(yàn)在SP感染的兒童中敏感性較高，但在尿抗原檢測(cè)呈陽(yáng)性的病例中仍有7%15%的病例沒(méi)有SP感染的臨床證據(jù)4。ICT雖然在SP鼻咽攜帶者中存在假陽(yáng)性結(jié)果，但由于ICT標(biāo)本采集簡(jiǎn)便，不具創(chuàng)傷性，不受先前抗生素治療干擾，具有較高的敏感性和特異性，15 min便可完成檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，是快速診斷SP感染的簡(jiǎn)便方法。1.3 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）敏感性高，特異性強(qiáng)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR可對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行可重復(fù)定量檢測(cè)，在擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中至少收集一次熒光數(shù)據(jù)，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，從而增加PCR

6、的敏感性和特異性。20012004年，Alban Le Monnier等5對(duì)社區(qū)獲得性肺炎患者的胸腔積液進(jìn)行SP16S rDNA基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該試驗(yàn)的敏感性為77%。在抗生素治療初期，PCR不受其干擾，因此為早期診斷提供了較可靠的依據(jù)。然而，與ICT相比，PCR是一種復(fù)雜、耗時(shí)的檢測(cè)方法，還未完全標(biāo)準(zhǔn)化，從而妨礙其成為SP臨床診斷方法，主要作為實(shí)驗(yàn)研究的技術(shù)方法。2 耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制2.1 內(nèi)酰胺類抗生素在上個(gè)世紀(jì)四、五十年代，當(dāng)青霉素被應(yīng)用于臨床初期，SP對(duì)青霉素是相當(dāng)敏感的。當(dāng)時(shí)大部分菌株的青霉素MIC 0.0150.03 mg/L。上世紀(jì)60年代，在澳大利亞和新幾內(nèi)亞，部分SP出現(xiàn)了對(duì)

7、青霉素敏感性降低的現(xiàn)象，分離出對(duì)青霉素耐藥的SP（penicillinresistant streptococcus pneumoniae, PRSP）。70年代末，南非報(bào)道了對(duì)青霉素高水平耐藥的菌株，這些菌株的青霉素MIC高達(dá)24 mg/L。在美國(guó)，SP對(duì)青霉素的耐藥情況在70年代及80年代初沒(méi)有顯著的變化，持續(xù)保持在10%或更低。但在80年代末及整個(gè)90年代，SP對(duì)青霉素的耐藥性發(fā)生了戲劇性的變化，不敏感率顯著增加。有報(bào)道稱，在19932004年，耐藥菌株增加了近30倍。亞洲地區(qū)耐藥性病原監(jiān)測(cè)網(wǎng)（ANSORP）的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明SP對(duì)青霉素的耐藥率為29.4%，不敏感率為52.4%6。2000

8、2002年兒童鼻咽部分離887株SP對(duì)青霉素耐藥率為6.4%，青霉素不敏感率39.9%7。2001年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)（National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS）判斷SP對(duì)青霉素耐藥的標(biāo)準(zhǔn)是：MIC2 mg/L為耐藥；MIC 0.121.0 mg/L為中度耐藥；0.06 mg/L為敏感。青霉素耐藥的產(chǎn)生是由于細(xì)胞壁上一種或多種青霉素結(jié)合蛋白（PBP）的改變，這種改變同樣可以影響到PBP與整個(gè)內(nèi)酰胺類抗生素的結(jié)合8。如果抗生素在感染部位有足夠濃度的話，這種耐藥機(jī)制即可被克服。在呼吸道感染的情況下，只要給予適當(dāng)

9、劑量的藥物，大部分的SP對(duì)內(nèi)酰胺類抗生素，比如靜脈滴注頭孢曲松和口服阿莫西林仍然保持敏感。2.2 大環(huán)內(nèi)酯類和林可霉素類抗生素SP對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的耐藥率在近2030年間迅速增長(zhǎng)。Alexander Project9研究結(jié)果顯示，19982000年全球紅霉素耐藥率為24.6%。亞洲國(guó)家耐藥程度比歐美國(guó)家嚴(yán)重，ANSORP的監(jiān)測(cè)結(jié)果表明，19982001年亞洲地區(qū)對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥的SP（macrolideresistant streptococcus pneumoniae, MRSP）占59.3%10。我國(guó)北京、上海、廣州三家兒童醫(yī)院上呼吸道感染患兒鼻咽部SP紅霉素耐藥率為84.3%6。S

10、P對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的藥敏試驗(yàn)分為三種情況：敏感（MIC1 mg/L）、低度耐藥（MIC 132 mg/L）和高度耐藥（MIC64 mg/L）。低度耐藥和高度耐藥的臨床特點(diǎn)即對(duì)現(xiàn)有的所有大環(huán)內(nèi)酯類藥物均出現(xiàn)耐藥，兩者不同之處在于前者對(duì)林可霉素通常敏感。兩者的耐藥機(jī)制也有所不同：低度耐藥常常由mefA基因介導(dǎo)，耐藥表型為M型（即對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類耐藥而對(duì)林可霉素類敏感）；高度耐藥常常由ermB基因介導(dǎo)，耐藥表型為MLSB型（即對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素類和鏈陽(yáng)霉素B類均耐藥）。M型的耐藥機(jī)制為泵出機(jī)制，即將細(xì)胞內(nèi)的大環(huán)內(nèi)酯類藥物移至細(xì)胞外；MLSB型的耐藥機(jī)制為核糖體靶位修飾機(jī)制，主要由SP產(chǎn)生甲基酶使核糖體亞

11、基中的腺嘌呤發(fā)生雙甲基化，從而阻止大環(huán)內(nèi)酯類、林可霉素、鏈陽(yáng)霉素B等抗生素與之結(jié)合。美國(guó)在20002004年對(duì)MRSP菌株的觀察性研究中發(fā)現(xiàn)，在11 576株菌株中，M表型占主導(dǎo)地位（65.7%），而MLSB表型在研究過(guò)程中由初期的9.7%上升至18.4%11。而在全球的其它地區(qū)MLSB表型仍較為流行。2.3 喹諾酮類抗生素大部分SP對(duì)喹諾酮類藥物保持較高的敏感性，但近期南非報(bào)道了當(dāng)?shù)貎伤Y(jié)核病醫(yī)院，在用喹諾酮類藥物治療多重耐藥結(jié)核病的過(guò)程中，12例病例發(fā)生了對(duì)左氧氟沙星耐藥的SP的侵襲性感染12。喹諾酮類抗生素所攻擊的目標(biāo)是DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV，它們對(duì)DNA超螺旋結(jié)構(gòu)和細(xì)胞的增殖是至

12、關(guān)重要的。SP對(duì)喹諾酮類的耐藥是由于染色體的促旋酶gyrA基因和（或）拓?fù)洚悩?gòu)酶IVparC基因發(fā)生突變?cè)斐傻?。任何一個(gè)基因突變，往往表現(xiàn)對(duì)喹諾酮類呈低水平耐藥；而兩個(gè)基因均發(fā)生突變，則表現(xiàn)為高水平耐藥，即對(duì)喹諾酮類多種抗生素發(fā)生耐藥。2.4 四環(huán)素類抗生素SP對(duì)四環(huán)素類抗生素的耐藥是通過(guò)tet介導(dǎo)的核糖體蛋白形成的，而tet基因往往攜帶接合性轉(zhuǎn)座子或質(zhì)粒，造成了耐藥性在細(xì)菌間的擴(kuò)散。tet基因在人類、動(dòng)物及周圍環(huán)境中的多種細(xì)菌中被證實(shí)，而在SP中主要為tet (M), 偶爾可以發(fā)現(xiàn)tet (O)。該基因編碼胞質(zhì)蛋白，從而保護(hù)細(xì)菌的核糖體免受四環(huán)素類抗生素的攻擊。由于tet (M)和erm (

13、B)基因定植于同一染色體的接合性轉(zhuǎn)座子，因此對(duì)四環(huán)素類的耐藥性與對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥性有一定的相關(guān)性13。據(jù)近期美國(guó)報(bào)道的對(duì)20002004年近40 000株SP的觀察性研究發(fā)現(xiàn)，四環(huán)素類的耐藥率為14.6%15.9%，并且該耐藥率有每年輕度下降的趨勢(shì)11。3 結(jié)束語(yǔ)由于耐藥SP感染大量增加，多重耐藥SP感染已成為全球面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。ICT是診斷SP感染快速、可靠的方法，并可以為治療贏得時(shí)間。因此，必須合理使用抗生素，加強(qiáng)耐藥監(jiān)測(cè)，在耐藥株高度流行區(qū)域，對(duì)高危人群使用SP多價(jià)結(jié)合疫苗以及開(kāi)發(fā)新型抗生素是解決SP耐藥的有效措施?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1World Health Organization. P

14、neumococcal conjugated vaccine for childhood immunizationWHO position paper J. Wkly Epidemiol Rec, 2007, 82: 93104.2Campbell SG, Marrie TJ, Anstey R, et al. The contribution of blood cultures to the clinical management of adult patients admitted to the hospital with communityacquired pneumonia: a pr

15、ospective observational study J. Chest, 2003, 123: 11421150.3Smith MD, Derrington P, Evans R, et al. Rapid diagnosis of bacteremic pneumococcal infections in adults by using the Binax NOW Streptococcus pneumoniae urinary antigen test: a prospective, controlled clinical eva luation J. J Clin Microbio

16、l, 2003, 41: 28102813.4Neuman MI, Harper MB. eva luation of a rapid urine antigen assay for detection of invasive pneumococcal disease in children J. Pediatrics, 2003, 112: 12791282.5Alban LM, Etienne C, JeanRalph Z, et al. Microbiological Diagnosis of Empyema in Children: Comparative eva luations b

17、y Culture, Polymerase Chanin Reaction, and Pneumococcal Antigen Detection in Pleural Fluids J. Clinical Infectious Dis, 2006, 42: 11351145.6Song JH, Jung SI, Ko KS, et al. High preva lence of antimicrobial resistance among clinical Streptococcus pneumoniae isolates in Asia J. Antimicrob Agents Chemo

18、ther, 2004, 48: 21012107.7Yao K, Shen X, Yu S, et al. Antimicrobial resistance and serotypes of nasopharyngeal strains of Streptococcus pneumoniae in Chineses children with acute respiratory infections J. J Int Med Res, 2007, 35: 253267.8Hakenbeck R, Kaminski K, Konig A, et al. Penicillinbinding pro

19、teins in lactamresistant Streptococcus pneumoniae J. Microb Drug Resist, 1999, 5: 9199.9Jacobs MR, Felmingham D, Appelbaum PC, et al. The Alexander Project Group. The Alexander Project 19982000: susceptibility of pathogens isolated from communityacquired respiratory tract infection to commonly used antimicrobial agents J. J Antimicrob Chemother, 2003, 52: 229246.10Song JH, Chang HH, Suh JY, et al. Macrolide r