1、生物工程學報 2009, May 25; 25(5): 786-792姚丹丹, 劉立明, 李江華, 華兆哲, 堵國成, 陳堅OUTLINE摘要簡介研究材料與方法結果與討論結論摘 要: : 研究了乙醇和研究了乙醇和H H2 2O O2 2 脅迫對芽孢桿菌脅迫對芽孢桿菌( (Bacillus Bacillus sp.) WSHDZ-01 sp.) WSHDZ-01 過量合成過氧化氫酶過量合成過氧化氫酶(Catalase, (Catalase, 簡稱簡稱CAT)CAT)的影響。的影響。在Bacillus sp.WSHDZ-01 培養(yǎng)體系中添加2.0%(V/V)乙醇, 胞內過氧化氫酶酶活達到11151

2、U/mL, 是對照組的2.5倍。而在培養(yǎng)體系中添加0.3%(V/V)H2O2, 則使胞內過氧化氫酶不斷分泌到胞外,胞外酶占總酶活比率增加至27%。基于上述發(fā)現(xiàn),分別以不添加脅迫物(a)、乙醇脅迫(b)、H2O2 脅迫(c)為對照,在培養(yǎng)體系中維持持續(xù)的乙醇和H2O2 脅迫,結果表明:1)胞外酶比例達82.5%;2)發(fā)酵周期縮短為42 h,比對照a延長了6 h,比對照b和c分別縮短了8h和6h;3)生產強度達到470 U/(mLh), 比對照a提高了18.6%,為過氧化氫酶工業(yè)化生產奠定了基礎。過氧化氫酶簡介過氧化氫酶(Catalase, 簡稱CAT)通過催化H2O2分解為H2O 與O2 而作為

3、一種酶類清除劑廣泛應用于紡織、食品、醫(yī)藥、臨床等行業(yè), 具有反應條件溫和、催化效率高等優(yōu)點。前期研究中通過營養(yǎng)和環(huán)境條件優(yōu)化, 顯著提高了Bacillus sp. WSHDZ-01發(fā)酵生產過氧化氫酶的酶活, 但難以進一步提高酶活。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的核心原因在于沒有深入理解生物體系過量積累過氧化氫酶的機理。過氧化氫酶在生物體內以鐵卟啉為輔基, 催化H2O2 分解而清除體內的H2O2, 使細胞免受活性氧的毒害, 是生物防御體系的關鍵酶之一?；诖? 作者考慮: 能否將細胞置于活性氧脅迫的非正常生長環(huán)境下, 促使微生物細胞為了抵御這一脅迫而不斷過量合成過氧化氫酶？常見的思路是在培養(yǎng)體系中添加乙醇和H2O

4、2 。Bacillus sp.WSHDZ-01 能利用乙醇為唯一碳源微弱生長, 并進而在體內生成活性氧3(圖1),基于這一思路, 作者研究了乙醇(內源)和H2O2 脅迫(外源)對Bacillus sp. WSHDZ-01 過量合成胞內和胞外酶的影響, 并證實了同時采用內外源氧化脅迫的策略能有效地促進過氧化氫酶生產。研究材料與方法結果與討論當乙醇濃度為2.0% (V/V),與未添加的對照組比較, 過氧化氫酶總酶和胞內酶活分別提高了126%和150%. Bacillussp.WSHDZ-01 能利用乙醇為唯一碳源微弱生長。然而, 圖2 表明, 細胞濃度隨著乙醇濃度的增加而逐漸降低, 當乙醇濃度為1

5、.0%和2.0%時, 細胞濃度分別下降13%和16.2%。這表明乙醇的添加對菌體生長有一定抑制作用。1.乙醇促進胞內過氧化氫酶合成進一步分析添加2.0%乙醇后每隔20 min 胞內酶活和總酶活的變化情況(圖3)發(fā)現(xiàn), 隨著乙醇脅迫時間延長, 胞內酶活占總酶活的比例不斷增加。乙醇促進Bacillus sp.WSHDZ-01 過量合成過氧化氫酶的可能機制在于:1) 作為碳源促進細胞生長; 2) 在細胞內生成大量活性氧, 迫使細胞過量合成過氧化氫酶以清除活性氧所引起的毒性。1.乙醇促進胞內過氧化氫酶合成2 乙醇持續(xù)脅迫加強CAT 的合成圖4 乙醇消耗速率(A)與添加時間(B)對過氧化氫酶發(fā)酵的影響圖

6、4B), 發(fā)現(xiàn)與對照組(未添加)比較, 過氧化氫酶總酶活分別提高了54%、37%和16%;這一結果表明, 持續(xù)的乙醇脅迫能更有效地提高過氧化氫酶的合成效率?；诙啻畏峙砑右掖寄苊黠@提高CAT 產量以及不同階段乙醇的消耗速率(圖4A),作者分階段恒速流加乙醇以使Bacillus sp.WSHDZ-01 處于持續(xù)活性氧脅迫下, 結果如圖5A、5B 所示, 過氧化氫酶總酶活(28 990 U/mL)和胞內酶活(9691 U/mL)均達到最大值。2. H2O2 促進胞外過氧化氫酶合成考慮到微生物細胞合成CAT 的生理機制是抵御活性氧的傷害, 為了進一步促進CAT 的生成,將對數(shù)生長后期(12 h)的

7、Bacillus sp.WSHDZ-01 細胞置于不同濃度H2O2(0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和0.5%(V/V)脅迫下, 以研究培養(yǎng)體系中H2O2 脅迫對細胞生長和過氧化氫酶合成的影響, 結果如圖6 所示。由上圖可知過氧化氫酶酶活和單位細胞產酶的能力均隨著H2O2 脅迫濃度(00.3%, V/V)的增加而不斷提高,而細胞濃度則呈下降趨勢(圖6A)。添加0.3%(V/V)H2O2使總酶活提高到9254 U/mL (圖6A), 較對照組(未添加H2O2)提高了43.5%。繼續(xù)增加H2O2 濃度則導致總酶活不斷下降。另一方面,H2O2 脅迫起始時間同樣影響細胞合成過氧化氫酶的能力(圖6

8、B):1)0h H2O2 脅迫明顯抑制細胞生長和產酶能力(數(shù)據(jù)未列出);2)對數(shù)生長后期(12 h)后, 隨著H2O2 脅迫時間的延遲, 過氧化氫酶總酶活逐漸下降;3) H2O2 脅迫的最佳時間為12 h; 4)與乙醇類似, 持續(xù)低劑量的H2O2 脅迫能有效地提高過氧化氫酶酶活。如前所述, H2O2 脅迫顯著提高過氧化氫酶酶活,其可能機理在于添加過氧化氫是否促進了過氧化氫酶向胞外分泌的能力呢？為此, 作者分析了添加H2O2 2080 min 后胞內外過氧化氫酶酶活的變化,如圖7 所示。與乙醇脅迫比較, 添加過氧化氫后胞內過氧化氫酶的積累與對照組相比沒有明顯提高(圖7A), 而胞外酶活則明顯地提

9、高, 且隨著脅迫時間的延長而不斷增加(圖7B), H2O2 脅迫80 min 后,胞外酶活達到2500 U/mL, 比20、40、60 min 分別提高了92%、25%和8.7%。這一結果表明, 在H2O2脅迫下, Bacillus sp.WSHDZ-01 在胞內合成大量過氧化氫酶并能有效的將其分泌到胞外, 從而促進了過氧化氫酶總酶活的提高。2.4 內外源脅迫促進過氧化氫酶積累基于持續(xù)乙醇脅迫促使Bacillus sp.WSHDZ-01在胞內過量合成過氧化氫酶, 而連續(xù)H2O2 脅迫則使胞內過氧化氫酶快速高效地分泌到胞外。那么能否在促使細胞大量合成胞內過氧化氫酶的同時采用H2O2 脅迫促使酶分

10、泌到胞外, 從而實現(xiàn)過氧化氫酶的高效生產？以不添加乙醇和H2O2(a); 乙醇脅迫(b); H2O2 脅迫(c) 為對照, 研究了Bacillus sp.WSHDZ-01 在持續(xù)乙醇和H2O2 脅迫下過量合成過氧化氫酶(3 L 發(fā)酵罐)的過程, 結果如下圖8 所示。發(fā)現(xiàn)混合添加脅迫物時:1)1)發(fā)酵10 h 后胞內酶活迅速提高, 在28 h 達到最大值11 000 U/mL,而在H2O2 的脅迫下胞內酶活雖達10 480 U/mL,但發(fā)酵周期延長了20 h,生產強度大幅降低;2)2)促使胞內過氧化氫酶高效分泌到胞外, 胞外酶占總酶活比例達到82.5%, 比對照a、b、c分別提高了59%、16.5%、31%。乙醇連續(xù)脅迫下胞外酶活占總酶活的比例最低, 胞外酶活達到最高值的時間延長至50 h;3)3)發(fā)酵進行到34 h 時過氧化氫酶開始快速向胞外分泌, 44 h 時胞外酶活占總酶活的80%;4)4)發(fā)酵周期為42 h, 比對照a 延長了6 h,比對照b 和c 分別縮短了8h和6h;5)5)過氧化氫酶生產強度達到470 U/(mLh), 比不添加脅迫物的情況提高了18.6%。結論結論采用活性氧脅迫Bacillus sp. WSHDZ-01 過量合成過氧化氫酶發(fā)現(xiàn), 在培養(yǎng)體系添加2.0%(V/V)乙醇能有效地促進胞內過氧化氫酶的合成, 而添加0.3%(V/V) H2O2 則使過