1、流感的相關(guān)知識及實驗室檢測流感的相關(guān)知識及實驗室檢測陳憲楷陳憲楷2018.5.24流感的相關(guān)知識回顧流感的相關(guān)知識回顧1流感病毒的實驗室檢測流感病毒的實驗室檢測2流感病毒亞型的鑒定流感病毒亞型的鑒定3實驗室檢測的相關(guān)影響因素分析實驗室檢測的相關(guān)影響因素分析4C流感病毒流感病毒流感的相關(guān)知識回顧流感的相關(guān)知識回顧1 流感流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。人類的流行性感冒病毒人類的流行性感冒病毒(influenza,(influenza,簡稱流感），簡稱流感），屬正粘液病毒科，分屬正粘液病毒科，分 A A（甲）、（甲）、 B B（乙）、（乙）、C C（丙）

2、（丙）三型，呈三型，呈球形球形或或絲狀絲狀，是一種造成人類及動物患，是一種造成人類及動物患流行性感冒的流行性感冒的負(fù)鏈負(fù)鏈RNARNA病毒。病毒。流感病毒的基因組流感病毒的基因組RNA與NP構(gòu)成RNP基因組由基因組由8 8個短的單鏈個短的單鏈 RNA RNA構(gòu)成，包含構(gòu)成，包含1111個基因，編碼個基因，編碼1111個蛋白：個蛋白：血凝素血凝素(HA), (HA), 神經(jīng)氨酸酶神經(jīng)氨酸酶(NA),(NA),核蛋白核蛋白(NP), M1, M2(NP), M1, M2，NS1, NS2NS1, NS2（ NEP NEP：核輸出蛋白），：核輸出蛋白），PA, PB1PA, PB1（聚合酶基團(tuán)（聚合

3、酶基團(tuán)1), PB1-F21), PB1-F2和和 PB2 PB2。甲型甲型流感流感致病性強(qiáng)致病性強(qiáng)哺乳類動物哺乳類動物（豬，鯨魚，（豬，鯨魚，馬，海豹和貓）或馬，海豹和貓）或禽類禽類都會被廣泛感染都會被廣泛感染容易發(fā)生突發(fā)性變異，容易發(fā)生突發(fā)性變異，從而引起普遍性流感，從而引起普遍性流感，世界性大流行世界性大流行丙型丙型流感流感以散在形式出現(xiàn)，以散在形式出現(xiàn)，主要侵襲嬰幼兒，主要侵襲嬰幼兒，一般不引起流行。一般不引起流行。乙型乙型流感流感只會感染只會感染人類人類和和海豹海豹有限的宿主導(dǎo)致有限的宿主導(dǎo)致不會發(fā)生重大突變，不會發(fā)生重大突變，呈呈局限性流行局限性流行NPNP（核蛋白）和（核蛋白）和

4、MPMP基質(zhì)蛋白基質(zhì)蛋白(M1)(M1)抗原性穩(wěn)定，具有型特異性，抗原性穩(wěn)定，具有型特異性，將流感將流感分分 A A（甲）、（甲）、 B B（乙）、（乙）、 c c（丙）三型（丙）三型甲乙型流感主要亞型甲乙型流感主要亞型血凝素血凝素(HA)(HA)和神經(jīng)氨酸酶和神經(jīng)氨酸酶(NA)(NA)抗原結(jié)構(gòu)極易發(fā)生變異，有亞抗原結(jié)構(gòu)極易發(fā)生變異，有亞型的特異性型的特異性，是甲型流感病毒分亞型的主要依據(jù)是甲型流感病毒分亞型的主要依據(jù), ,甲型流感甲型流感命名通常會遵照命名通常會遵照 HNHN的規(guī)則的規(guī)則命名，命名，H H代表血凝素，可分為代表血凝素，可分為1616個個亞型；亞型；N N代表神經(jīng)氨酸酶，有代表

5、神經(jīng)氨酸酶，有9 9個亞型。會季節(jié)性在人群中出個亞型。會季節(jié)性在人群中出現(xiàn)的亞型通常為現(xiàn)的亞型通常為H1H1，2 2和和3 3，以及，以及N1N1和和2 2 根據(jù)乙型流感病毒表面根據(jù)乙型流感病毒表面血凝素蛋白的抗原特征血凝素蛋白的抗原特征主要分為主要分為B B型型(Yamagata)(Yamagata)和和B B型型(Victoria).(Victoria).根據(jù)國家流感中心報道，今年監(jiān)測到的流感病毒以根據(jù)國家流感中心報道，今年監(jiān)測到的流感病毒以甲型甲型H1N1H1N1亞亞型型和和乙型（乙型（YamagataYamagata）系為主，并且總體上甲型系為主，并且總體上甲型H1N1H1N1亞型的比

6、亞型的比例例超過超過B B（YamagataYamagata）系。甲型）系。甲型H3N2H3N2亞型和亞型和B B（VictoriaVictoria）系以）系以低水平共同流行。低水平共同流行。 我國流感流行現(xiàn)狀及亞型我國流感流行現(xiàn)狀及亞型不僅在中國，在歐洲一些國家和地區(qū)，今冬流行的流感病毒不僅在中國，在歐洲一些國家和地區(qū)，今冬流行的流感病毒優(yōu)勢毒株是優(yōu)勢毒株是B B型（型（YamagataYamagata），這一毒株沉寂已久，普通人群），這一毒株沉寂已久，普通人群對它的免疫基本缺失對它的免疫基本缺失圖圖. . 中國流感病毒檢出率及其亞型分布中國流感病毒檢出率及其亞型分布流感的季節(jié)性流行流感的季

7、節(jié)性流行冬春季冬春季夏季夏季冬春季冬春季長江以南長江以南長江以北長江以北流感病毒在我國的活動規(guī)律流感病毒在我國的活動規(guī)律南北南北存在明顯的差異存在明顯的差異。高高峰期峰期1.1.流感患者流感患者2.2.隱性感染隱性感染者者1.1.近距離飛近距離飛沫傳播沫傳播2.2.接觸傳播接觸傳播流感的流行病學(xué)流感的流行病學(xué)傳染源傳染源傳播途徑傳播途徑病毒變異快病毒變異快6565歲以上老年人、歲以上老年人、嬰幼兒、嬰幼兒、慢性病患者慢性病患者反復(fù)感染反復(fù)感染并發(fā)癥并發(fā)癥感染流感的一般臨床表現(xiàn)：感染流感的一般臨床表現(xiàn)：流感一般急性起病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱流感一般急性起病，主要表現(xiàn)為發(fā)熱( (可達(dá)可達(dá)39-40)39

8、-40)，伴畏寒、寒戰(zhàn)、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)酸痛、極度乏力、食伴畏寒、寒戰(zhàn)、頭痛、肌肉關(guān)節(jié)酸痛、極度乏力、食欲減退等全身癥狀，常有咽痛、咳嗽，可有鼻塞、流欲減退等全身癥狀，常有咽痛、咳嗽，可有鼻塞、流涕，也可有嘔吐、腹瀉等癥狀。涕，也可有嘔吐、腹瀉等癥狀。一般來講，流感全身癥狀比普通感冒重。流感為一般來講，流感全身癥狀比普通感冒重。流感為自自限性疾病限性疾病，發(fā)病，發(fā)病3-43-4天后體溫逐漸消退，全身癥狀天后體溫逐漸消退，全身癥狀好轉(zhuǎn)。重癥病例可導(dǎo)致慢性基礎(chǔ)病加重，也可出現(xiàn)好轉(zhuǎn)。重癥病例可導(dǎo)致慢性基礎(chǔ)病加重，也可出現(xiàn)病毒性肺炎、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷等并發(fā)癥。病毒性肺炎、心臟和神經(jīng)系統(tǒng)損傷等并發(fā)癥。流

9、感病毒的實驗室檢測流感病毒的實驗室檢測2流感病毒的實驗室檢測流感病毒的實驗室檢測采集標(biāo)本類型：采集標(biāo)本類型： 常規(guī)特殊常規(guī)特殊咽拭子咽拭子 鼻咽鼻咽/ /呼吸道吸取物呼吸道吸取物鼻拭子鼻拭子 鼻洗液、含漱液鼻洗液、含漱液 血清血清 呼吸道灌洗液呼吸道灌洗液實驗前處理實驗前處理流感標(biāo)本采集流感標(biāo)本采集采集時間：采集時間：病人發(fā)病的病人發(fā)病的頭頭3 3天天內(nèi)采集，最好是內(nèi)采集，最好是24h24h內(nèi)內(nèi)咽拭子采集咽拭子采集咽拭子咽拭子用滅菌棉簽（最好用聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子）擦拭用滅菌棉簽（最好用聚丙烯纖維頭的塑料桿拭子）擦拭雙雙側(cè)咽扁桃體及咽后壁側(cè)咽扁桃體及咽后壁，將棉簽頭部浸入含將棉簽頭部浸入含

10、3-4ml3-4ml采集液的采集液的管中，尾部棄去，旋緊管蓋。管中，尾部棄去，旋緊管蓋。注意：采樣前注意：采樣前1h1h內(nèi)不要進(jìn)食和飲水，采樣液中嚴(yán)禁加入抗內(nèi)不要進(jìn)食和飲水，采樣液中嚴(yán)禁加入抗生素生素標(biāo)本的處理和保存標(biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐袠?biāo)本采集后應(yīng)立即放入適當(dāng)?shù)牟蓸右褐械蜏乇４娴蜏乇４?，常用的采樣，常用的采樣液有：液有：PH 7.4-7.6PH 7.4-7.6的的HanksHanks液或液或MEMMEM標(biāo)本應(yīng)在標(biāo)本應(yīng)在44保存保存2424小時內(nèi)小時內(nèi)送至實驗室，實驗室對收到的標(biāo)本最送至實驗室，實驗室對收到的標(biāo)本最好好24244848小時小時內(nèi)進(jìn)行檢測或接種。內(nèi)進(jìn)行檢測或接種。如不

11、能在如不能在48h48h內(nèi)檢測或接種，標(biāo)本應(yīng)置于內(nèi)檢測或接種，標(biāo)本應(yīng)置于-70-70保存保存實驗室生物安全要求實驗室生物安全要求01季節(jié)性流感病毒分離鑒定在生物安全季節(jié)性流感病毒分離鑒定在生物安全級實驗室進(jìn)行。級實驗室進(jìn)行。03用滅活的抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測時可以在用滅活的抗原進(jìn)行血清學(xué)檢測時可以在生物安全生物安全級實驗室進(jìn)行級實驗室進(jìn)行流感病毒分離鑒定及其它檢測過程中所有能流感病毒分離鑒定及其它檢測過程中所有能夠產(chǎn)生感染性氣溶膠的過程必須在生物安全夠產(chǎn)生感染性氣溶膠的過程必須在生物安全級實驗室的生物安全柜里操作。級實驗室的生物安全柜里操作。0203常見的流感病毒實驗室檢測方法常見的流感病毒實驗室

12、檢測方法檢測方法檢測方法靈敏度靈敏度特異性特異性優(yōu)點優(yōu)點缺點缺點分子診斷分子診斷（RT-PCRRT-PCR）高高高高病毒含量低的病毒含量低的標(biāo)本檢出率高，標(biāo)本檢出率高，耗時短耗時短培養(yǎng)法培養(yǎng)法（細(xì)胞培養(yǎng)法、（細(xì)胞培養(yǎng)法、雞胚培養(yǎng)法）雞胚培養(yǎng)法）低低高高在分子生物學(xué)在分子生物學(xué)問世前，一直問世前，一直是流感實驗室是流感實驗室診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，至今仍不可取至今仍不可取代代陽性檢出率低，陽性檢出率低，漏檢率高，耗漏檢率高，耗時長，技術(shù)要時長，技術(shù)要求高求高快速試紙條法快速試紙條法（金標(biāo)法）（金標(biāo)法）較低較低較高較高操作簡單，耗操作簡單，耗時短，不需儀時短，不需儀器設(shè)備，適用器設(shè)備，適用于快

13、速篩查于快速篩查存在假陰性，存在假陰性，漏檢率高，只漏檢率高，只能鑒定出流感能鑒定出流感病毒病毒A A、B B型，型，不能進(jìn)行亞型不能進(jìn)行亞型鑒定鑒定血清學(xué)檢測血清學(xué)檢測（血凝抑制試血凝抑制試驗驗）高高高高能夠鑒定亞型能夠鑒定亞型要求急性期和要求急性期和恢復(fù)期雙份血恢復(fù)期雙份血清，對于季節(jié)清，對于季節(jié)性流感僅限于性流感僅限于流行病學(xué)調(diào)查流行病學(xué)調(diào)查及回顧性診斷及回顧性診斷季節(jié)性流感檢測流程季節(jié)性流感檢測流程臨床標(biāo)本采集臨床標(biāo)本采集接種接種MDCKMDCK細(xì)胞細(xì)胞接種雞胚接種雞胚紅細(xì)胞凝集抑制試驗，鑒定病毒紅細(xì)胞凝集抑制試驗，鑒定病毒紅細(xì)胞凝集試驗紅細(xì)胞凝集試驗流感病毒核酸檢測陽性流感病毒核酸檢

14、測陽性PCRPCR鑒定鑒定流感病毒亞型的鑒定流感病毒亞型的鑒定3紅細(xì)胞凝集試驗紅細(xì)胞凝集試驗1紅細(xì)胞凝集抑制試驗紅細(xì)胞凝集抑制試驗2流感病毒亞型的鑒定流感病毒亞型的鑒定流感病毒亞型的鑒定流程流感病毒亞型的鑒定流程紅細(xì)胞凝集試驗紅細(xì)胞凝集試驗4 4個凝集單位配制個凝集單位配制“回滴回滴”紅細(xì)胞凝集抑制試驗紅細(xì)胞凝集抑制試驗判定流感病毒型別判定流感病毒型別紅細(xì)胞凝集試驗（紅細(xì)胞凝集試驗（HAHA）lMDCKMDCK細(xì)胞或雞胚收獲的標(biāo)本分離物首先用雞、豚鼠或人紅細(xì)胞細(xì)胞或雞胚收獲的標(biāo)本分離物首先用雞、豚鼠或人紅細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗（進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗（HAHA），確定病毒滴度），確定病毒滴度l 原

15、理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白原理：流感病毒顆粒表面的血凝素蛋白（HAHA）含有能結(jié)合并）含有能結(jié)合并識別紅細(xì)胞表面含識別紅細(xì)胞表面含唾液酸的唾液酸的糖蛋白或脂蛋白結(jié)構(gòu)糖蛋白或脂蛋白結(jié)構(gòu)，許多哺乳動，許多哺乳動物和禽的紅細(xì)胞表面均含有這兩種成分。因此流感病毒能與其物和禽的紅細(xì)胞表面均含有這兩種成分。因此流感病毒能與其結(jié)合并識別，產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有結(jié)合并識別，產(chǎn)生凝集現(xiàn)象。當(dāng)血清中有特異性抗體特異性抗體與病毒血與病毒血凝素結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn)凝素結(jié)合后，可以抑制凝集現(xiàn)象出現(xiàn)紅細(xì)胞紅細(xì)胞雞雞火雞火雞豚鼠豚鼠人人O型血紅型血紅細(xì)胞細(xì)胞馬馬適用范圍適用范圍流感和禽流流感和禽流感病毒感病

16、毒流 感 和 禽流 感 和 禽流感病毒流感病毒流感病毒流感病毒流感病毒流感病毒禽流感病毒禽流感病毒終 濃 度終 濃 度（）（）0.5（1%）0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.75（1.5%）/0.5（1%）0.5（1%）孔底部形孔底部形狀狀U或或V型型U或或V型型U型型U型型U型型孵育時間孵育時間30min30min45min45min60min細(xì)胞對照細(xì)胞對照細(xì)胞沉積成細(xì)胞沉積成圓點狀，傾圓點狀，傾斜時細(xì)胞向斜時細(xì)胞向下流成淚滴下流成淚滴狀狀細(xì) 胞 沉 積細(xì) 胞 沉 積成圓點狀，成圓點狀，傾 斜 時 細(xì)傾 斜 時 細(xì)胞 向 下 流胞 向 下 流成淚滴成淚滴狀狀細(xì)胞沉積成細(xì)

17、胞沉積成環(huán)狀環(huán)狀細(xì)胞沉積成細(xì)胞沉積成環(huán)狀環(huán)狀細(xì)胞沉積成細(xì)胞沉積成環(huán)狀環(huán)狀A(yù)HBCDEFG100ul病毒液病毒液50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul50ul稀釋完病毒液后加入稀釋完病毒液后加入50ul50ul紅細(xì)胞懸液紅細(xì)胞懸液50ulPBS稀釋病稀釋病毒毒加入配加入配制好的制好的紅細(xì)胞紅細(xì)胞懸液懸液充分混充分混勻，置勻，置室溫孵室溫孵育育30-30-6060分鐘分鐘觀察記觀察記錄結(jié)果錄結(jié)果操作簡圖操作簡圖病病毒毒原原液液1:21:21:128HA: 32HA128 HA:4紅細(xì)胞凝集試驗（紅細(xì)胞凝集試驗（HAHA）結(jié)果判讀）結(jié)果判讀HAHA滴

18、度滴度8 8，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制（，進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制（HIHI）試驗；）試驗；若傳若傳1 12 2代后，代后，HAHA滴度仍滴度仍88者，可應(yīng)用核酸檢測方法進(jìn)者，可應(yīng)用核酸檢測方法進(jìn)行鑒定行鑒定HAHA滴度滴度860 60 歲、體溫在歲、體溫在 38.0 38.9 38.0 38.9之間，之間，流感病毒陽性檢出率高于其他組；流感病毒陽性檢出率高于其他組；參考文獻(xiàn)參考文獻(xiàn)李珺李珺，劉亞楠劉亞楠，田國保田國保等等. .臨床實驗室流感病毒檢測的相關(guān)影響因素分析臨床實驗室流感病毒檢測的相關(guān)影響因素分析J.J.國際病毒學(xué)雜志國際病毒學(xué)雜志, ,20172017，2424（5 5）：）：331-335 ISTIC331-335 ISTIC張杰張杰 ，武晶晶，武晶晶 等等. .不同溫度和不同放置時間對總不同溫度和不同放置時間對總RNARNA提取濃度和純度的影響提取濃度和純度的影響J J 實驗技術(shù)與管理實驗技術(shù)與管理.2013,11.2013,11- - 有文獻(xiàn)報道：不同的放置時間和溫度會影響有文獻(xiàn)報道：不同的放置時間和溫度會影響RNARNA提取的質(zhì)提取的質(zhì)量濃度，但對量濃度，但對RNARNA純度和完整性無明顯影響。純