1、高效液相色譜法測定淀粉類食品中丙烯酰胺研究2002年4月,瑞典斯德哥爾摩大學(xué)的MargaretaTornqvist教授首次在油炸及焙烤的馬鈴薯和谷物類食品中發(fā)現(xiàn)了具有神經(jīng)毒性的潛在致癌物-丙烯酰胺（Acrylamide）,這是國際上首次從食品中檢出高含量的丙烯酰胺1。這次在食品中檢出足以對人體健康產(chǎn)生危害的量,引起了包括世界衛(wèi)生組織等國際機構(gòu)的重視。世界衛(wèi)生組織在瑞士日內(nèi)瓦召開關(guān)于丙烯酰胺專家會議,專門商討食物中丙烯酰胺問題的重要性。食品中丙烯酰胺的產(chǎn)生機理,目前基本得到確認的是由食品中天門冬酰胺和還原性糖在高溫加熱過程中通過美拉德反應(yīng)（Maillardreaction）而生成,食品加熱到12

2、0以上即可發(fā)現(xiàn)丙烯酰胺的生成,加工方式對丙烯酰胺的產(chǎn)生影響很大2,3。由于丙烯酰胺已被WHO國際癌癥研究中心（IRAC）列為可能致癌物質(zhì)4,動物實驗和體外細胞實驗都證明丙烯酰胺可導(dǎo)致遺傳物質(zhì)的改變和癌癥的發(fā)生5。因此該研究目前已引起包括歐盟、FAO、WHO等政府和國際組織的廣泛關(guān)注。但這些研究均處于剛起步階段。在我國,到目前為止,僅見有關(guān)食品中丙烯酰胺的新聞報道,具體的研究還是空白。食品中丙烯酰胺的檢驗已列為我國“十五”國家重大科技專項“食品安全關(guān)鍵技術(shù)”課題,衛(wèi)生部食品安全計劃也將食品中丙烯酰胺檢測方法的建立和我國食品丙烯酰胺分布調(diào)查作為一個重要部分。目前,國際上食品中丙烯酰胺測定方法主要為

3、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法兩種方法,對儀器設(shè)備要求較高。本文在查閱文獻6-8的基礎(chǔ)上建立了食品中痕量丙烯酰胺的高效液相色譜測定法,采用固相萃取法對樣品進行凈化,該法簡單、快速、靈敏、準確,適合批量檢測。通過對實際樣品進行檢驗,取得了令人滿意的效果?，F(xiàn)報告如下:1實驗部分1.1本島津LC-10A高效液相色譜儀，配二極管陣列檢測器；離心沉淀機，05000r/min;0.45am水系針筒式微孔濾膜過濾器;Milli-Qplus超純水系統(tǒng)（美國密理博公司）；丙烯酰胺標準，純度大于99%（美國Sigma公司）。丙烯酰胺儲備液濃度為1000mg/L甲醇溶液,存放于-20冰箱中,丙烯酰胺

4、標準應(yīng)用液濃度為1.0mg/L的水溶液（臨用新配）;LC-C18PK/54固相萃取小柱（美國Supelco公司）。試劑除注明外均為分析純。試驗用水為二次蒸餾超純水。1. 2色譜條件色譜柱：美國Aglient公司AglientXDB反相C18柱,20cmx4.6mmi.d.,5心m；流動相甲醇：水（體積比為5:95），流速0.8ml/min;柱溫40C;檢測波長210nm;光譜掃描波長190nm370nm;進樣體積5lo1. 3樣品處理稱取均質(zhì)化食品樣品約2.00g于20ml塑料離心管中,加水至10ml,旋渦振蕩20min,4000r/min離心20min，取上?t液（避開油層）5ml經(jīng)0.45

5、am水系針筒式微孔濾膜過濾器過濾后，取1.5ml濾液過事先用甲醇和水處理過的SPE小柱，棄去最初0.5ml流出液，收集流出液進樣測定。2結(jié)果與討論2. 1儀器條件的選擇比較了幾種流動相，分別為甲醇、甲醇：水(10:90)、甲醇：水(5:95)甲醇:乙酸:水(0.5:0.1:99.4),發(fā)現(xiàn)甲醇：水(5:95)條件下丙烯酰胺和樣品中干擾物能達到較好基線分離；在0.2ml/min2.0ml/min范圍內(nèi)改變流動相流速，發(fā)現(xiàn)在流速為0.6ml/min1.20ml/min丙烯酰胺出峰時間合適，峰形較好；對丙烯酰胺標準溶液用紫外光譜儀進行掃描，其在210nm處有個最大吸收峰(圖3);進樣量大可提高測定的

6、靈敏度，但實驗中發(fā)現(xiàn)，當進樣量達到10心1以上時，峰形將發(fā)生分散、拖尾等現(xiàn)象。綜合考慮，我們確定測定的色譜條件為：流動相為甲醇：水(5：95)，流速0.80ml/min，柱溫40C,檢測波長210nm;進樣量為5心1,測定結(jié)果令人滿意。此條藉卜件下丙烯酰胺的保留時間為4.95min，標準及樣品色譜圖分別見圖1和圖2。圖1丙烯酰酸標準色詡圖食品樣品色濯圖2. 2萃取條件確定比較了活性炭和C18固相萃取小柱等幾種萃取吸附劑。發(fā)現(xiàn)活性炭吸附劑對強極性丙烯酰胺有很好的保留特性，對樣品中待測物有較大的濃縮作用，但由于其對食品樣品中所有成份均有吸附作用，因此對樣品中共存的干擾物質(zhì)分離效果較差；固相萃取小柱

7、對丙烯酰胺基本無吸附，而對樣品液中共存物質(zhì)有較好的保留，可有效地除去樣品液中蛋白質(zhì)等干擾物質(zhì)，缺點是對樣品液中待測物質(zhì)無濃縮作用。由于食品中共存物質(zhì)對測定有一定的干擾，影響測定結(jié)果的穩(wěn)定性，且對色譜柱壽命影響較大，而本研究方法的靈敏度基本上可達到不必濃縮即可對食品樣品中丙烯酰胺進行測定的要求，因此本研究采用C18固相萃取小柱對樣品進行純化處理。我們對高中低三種不同濃度的丙烯酰胺標準溶液各七份分別同時進行直接測定和過固相萃取柱后測定，發(fā)現(xiàn)兩種處理方法的測定結(jié)果之間無顯著性差異，丙烯酰胺的回收率在95%以上，因此實際測定時采用對標準溶液直接測定的標準曲線進行定量。固相萃取時采用真空泵抽濾時，我們發(fā)

8、現(xiàn)回收率相對常壓下過濾有不同程度的下降，因此實際應(yīng)用中采用自然濾過，這樣樣品處理時稍微延長，但測定結(jié)果較好。2. 3標準曲線的繪制將標準應(yīng)用液分別配制為0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,7.0,10.0ag/ml等不同濃度的丙烯酰胺標準溶液進樣分析，以質(zhì)量濃度（心g/mi）為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線。線性方程y=76647.74x-6569.00，相關(guān)系數(shù)r為0.9981，峰面積與質(zhì)量濃度之間有良好的線性關(guān)系2. 4定性方法采用標準物質(zhì)的保留時間和峰掃描光譜純度對照兩種方式對樣品峰進行準確定性。由于不少物質(zhì)在210nm波長處有吸收，只有同時滿足兩個條件的物質(zhì)，我們才認定為待測

9、的丙烯酰胺。丙烯酰胺的掃描光譜圖見圖3。m2M3M3ft圖3丙烯酰族縈外掃描光灌圖2. 5方法的回收率和精密度對六份樣品分別采用高、中、低三個濃度水平進行了丙烯酰胺的加標回收實驗，結(jié)果見表1。從表中可看出，樣品加標回收率在80.0%115.0%之間,平均加標回收率為97.3%，相對標準偏差為7.54%。取低濃度標準溶液(0.10ag/ml)、中等濃度標準溶液(5.0ag/ml)和高濃度標準溶液(10.0ag/ml)各1ml,分別取七份，分別按樣品處理方法處理后進行測定，每個標準測定3次并取平均值計算精密度，測得變異系數(shù)結(jié)果見表2表1回收率剿定結(jié)果樣品編號加標量（白皮實測含量（ft/回收率（%）

10、樣品1L00期SS0樣晶15.04.6292.4樣品1L06.39PL3樣品21.01.0410+0樣品25.097,6樣品27.099.1樣品3L01.02102,0樣品35.04.7935.8樣品3306應(yīng)95A樣品41.00.8080.0樣品45.04.8096.0樣品47.06.7796_7樣品5101.081080樣品55.04.8797_4樣品57.06.7095.7樣品61.0L1S115.0樣品65.05.031006樣品67_06.7896_9表2精一度測定結(jié)果（n=7）標準濃度口組mi）蜂面積均值蜂面積標推差變異系數(shù)（）0.10867241535.345.035376712

11、0283.4010.078276L336584.302.6方法檢測限進空白樣，以基線3倍噪聲值在標準曲線查得結(jié)果計算，測得方法檢出限為0.01ng，定量下限為0.01ng，按測定方法取樣品量2g計算,本方法最低檢出量為0.01心g/g（即10ng/g）。2. 7干擾試驗食品中常見成份淀粉、蔗糖、蛋白質(zhì)、金屬、非金屬等共存物，在前處理階段多已除去，因而對測定不會造成干擾；由于丙烯酰胺在酸性條件下易發(fā)生水解反應(yīng)，導(dǎo)致測定結(jié)果偏低，因此pH值對測定結(jié)果有一定影響，中性條件下測定結(jié)果穩(wěn)定。食品樣品pH多在近中性范圍，測定實際樣品時可不考慮樣品pH值的影響，對于加工過程中加有食醋等pH值較低的食物，處理前可用NaOH等溶液調(diào)節(jié)至近中性,不影響測定;含油較多的食品樣品,在提取前用正己烷預(yù)先提取一次以除去大部分油脂,可防止油脂的干