1、1 NR2BNR2B在小鼠骨癌痛中的作用及在小鼠骨癌痛中的作用及機制研究機制研究 中南大學湘雅三醫(yī)院 黃 東 教授 2 目前，全球癌癥患者的數(shù)量呈 骨癌痛的具體機制 癌性疼痛成為影響癌癥病人生活 質(zhì)量的一個嚴重問題。 在癌痛中又以骨癌痛最為嚴重和最難以控制。3臨床上，癌痛表現(xiàn)為進行性加重，常伴隨有爆發(fā)痛；癌痛與炎性痛和神經(jīng)病理性痛存在著不同的外周和中樞機制1 。 如癌痛：膠質(zhì)細胞增生肥大；GFAP 1 : Honore P. Neuroscience, 2000, 98: 585598.4 NMDA受體活化是反復傷害性刺激誘發(fā)中樞敏化 的基礎，是持續(xù)性疼痛產(chǎn)生和維持的關鍵 2 。 大量研究證實

2、：NMDA受體的亞基NR2B在炎性痛、 神經(jīng)病理痛中參與了傷害性信息傳遞，在疼痛調(diào) 制及痛覺敏化 的形成和維持中發(fā)揮重要作用 3 。2 : Petrenko. Anesth Analg. 2003, 97(4): 1108-1116. 3 : Nagy GG. Eur J Neurosci, 2004, 20 (12): 3301 - 3312.（一）（一）5 研究顯示，MAPK信號通路在神經(jīng)可塑性和炎癥 反應的細胞信號轉(zhuǎn)導過程中起重要作用4 。 增生肥大的星形膠質(zhì)細胞能釋放大量膠質(zhì)纖維酸 性蛋白（GFAP），骨癌痛的產(chǎn)生和維持與脊髓 星形膠質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)和功能的變化密切相關1 。4 : De L

3、eo JA. Pain, 2006, 122 (122): 17221. （二）（二）6研究癌痛的確切機制，需要適當?shù)膭游锬Ｐ?，現(xiàn)有動物模型仍顯不足。小鼠骨癌痛模型的優(yōu)勢肺癌是臨床骨轉(zhuǎn)移較多見的一種腫瘤，且小鼠在腫瘤 學及神經(jīng)系統(tǒng)研究方面具有獨特的優(yōu)勢。小鼠作為實驗模型，較經(jīng)濟適用本實驗參照Schwei等的方法，將Lewis肺癌細胞接種 于C57BL/6小鼠股骨骨髓腔，建立一個全新的骨癌痛 模型。7我們從如下四個方面加以研究：1、建立一個小鼠骨癌痛新模型2、NR2B在骨癌痛小鼠前扣帶回和脊髓中的分 布與表達3、脊髓NR2B基因沉默對小鼠骨癌痛的影響4、MAPK信號通路介導的NR2B在小鼠骨癌痛

4、中 的作用機制8 實施方案：檢測癌痛小鼠脊髓和前扣帶回NR2B的表達和分布，分析小鼠NR2B的表達和小鼠疼痛行為學關系。應用RNA干擾技術(shù)，沉默骨癌痛小鼠NR2B基因；通過對比干擾組小鼠與癌痛組小鼠NR2B的表達以及兩組小鼠疼痛行為學，從而闡明NR2B是否在癌痛的發(fā)生與維持中起重要作用。9對比骨癌痛小鼠NR2B基因沉默前后，MAPK 信號通路及其介導的下游信號分子表達的相應改變；研究MAPK 信號通路中信號分子表達的相應改變與GFAP的關聯(lián)性；探索MAPK信號通路在小鼠骨癌痛中的可能作用機制。10選用清潔級雄性選用清潔級雄性C57BL/6小鼠小鼠模型組模型組一般情一般情況觀察況觀察行為學行為學

5、測定測定內(nèi)容內(nèi)容1技術(shù)路線技術(shù)路線熱滅活組熱滅活組PBS組組正常對照組正常對照組放射學放射學檢查檢查組織學組織學檢測檢測自發(fā)痛行自發(fā)痛行為觀察為觀察機械性觸機械性觸誘發(fā)痛誘發(fā)痛11選用清潔級雄性選用清潔級雄性C57BL/6小鼠小鼠癌痛組癌痛組一般情一般情況觀察況觀察行為學行為學測定測定內(nèi)容內(nèi)容2技術(shù)路線技術(shù)路線假手術(shù)組假手術(shù)組正常對照組正常對照組實時定量實時定量PCR檢測檢測NR2B的的表達表達免疫組化檢測免疫組化檢測NR2B的表達的表達及分布及分布自發(fā)痛行自發(fā)痛行為觀察為觀察機械性觸機械性觸誘發(fā)痛誘發(fā)痛Western Blot檢測檢測NR2B的的表達表達12選用清潔級雄性選用清潔級雄性C57

6、BL/6小鼠小鼠癌痛組癌痛組一般情一般情況觀察況觀察行為學行為學測定測定內(nèi)容內(nèi)容3技術(shù)路線技術(shù)路線干擾組干擾組干擾對照組干擾對照組實時定量實時定量PCR檢測檢測NR2B的的表達表達自發(fā)痛行自發(fā)痛行為觀察為觀察機械性觸機械性觸誘發(fā)痛誘發(fā)痛Western Blot檢測檢測NR2B的的表達表達13選用清潔級雄性選用清潔級雄性C57BL/6小鼠小鼠正常組正常組一般情一般情況觀察況觀察行為學行為學測定測定內(nèi)容內(nèi)容4技術(shù)路線技術(shù)路線干擾組干擾組干擾對照組干擾對照組實時定量實時定量PCR檢測檢測NR2B、SP、c-fos和和GFAP基因基因的的表達表達自發(fā)痛行自發(fā)痛行為觀察為觀察機械性觸機械性觸誘發(fā)痛誘發(fā)痛

7、Western Blot檢測檢測NR2B，p-ERK，p-p38和和GFAP的表達的表達癌痛組癌痛組14結(jié)結(jié) 果果15 體重和一般狀況體重和一般狀況 圖1：觀察期內(nèi)各組小鼠體重的變化162.行為學測試行為學測試 圖2：自發(fā)痛行為觀察 圖3：機械性觸誘發(fā)痛測定17 3. 放射學檢測放射學檢測圖4：模型組小鼠不同時間段術(shù)側(cè)股骨X片結(jié)果: A為腫瘤細胞接種前攝片；B為接種后第7天； C為接種后第15天；D為接種后第23天。18 組織學觀察組織學觀察 骨髓腔內(nèi)可見較多腫瘤細胞骨髓腔內(nèi)大量腫瘤細胞浸潤且骨小梁破壞腫瘤細胞侵犯周圍肌肉骨髓腔破壞，腫瘤細胞穿破骨組織A:接種第7天模型組小鼠股骨切片 B:接種

8、第15天模型組小鼠股骨切片C:1接種第23天模型組小鼠股骨切片 C2:接種第23天模型組小鼠股骨 周圍肌肉組織病檢結(jié)果圖6：模型組小鼠術(shù)側(cè)股骨下段不同時間段的HE染色（HE400）19行為學、放射學、組織學三方面證實： C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接種Lewis肺癌細胞，能成功制備小鼠骨癌痛模型，且此模型穩(wěn)定、重復性好，與人類骨癌痛高度相似。 本研究我們首次選用來源廣泛、致瘤作用強的 Lewis肺癌細胞，接種于C57BL/6小鼠股骨骨髓 腔，建立了一個新的小鼠骨癌痛模型。205、實時熒光定量PCR檢測前扣帶回和脊髓NR2B的表達前扣帶回NR2B的表達前腦扣帶回NR2BmRNA 相對表達量21脊

9、髓NR2B的表達圖5：脊髓NR2BmRNA 相對表達量22第14天前扣帶回NR2B的表達 A癌痛組前扣帶回100倍； B癌痛組前扣帶回區(qū)域200倍 C正常組前扣帶回100倍； D正常組前扣帶回區(qū)域200倍 E假手術(shù)組前扣帶回100倍；F假手術(shù)組前扣帶回區(qū)域200倍6、 免疫組化檢測前扣帶回和脊髓NR2B的表達前腦扣帶回NR2B的表達23 L4-L6脊髓NR2B的表達L4-L6脊髓NR2B的表達（200倍）術(shù)后第14天，L4-L6脊髓NR2B的表達術(shù)后第18天，L4-L6脊髓NR2B的表達癌痛組假手術(shù)組正常組癌痛組假手術(shù)組正常組24L4-L6脊髓NR2B的分布 癌痛組 正常組 假手術(shù)組 L4-L

10、6脊髓NR2B的分布（接種后14天）脊髓各層NR2B表達量在中央導水管、背角淺層、前角依次增多257、Western Blot檢測L4-6段脊髓NR2B的表達* 術(shù)后第14天各組小鼠脊髓NR2B 術(shù)后第18天各組小鼠脊髓NR2B的表達，A: 癌痛組B: 假手術(shù)組C: 正常組 的表達，A: 癌痛組B: 假手術(shù)組C: 正常組*26 1、癌痛組小鼠脊髓和前扣帶回中NR2B表達均明顯增加，脊髓各層表達量由大到小依次為前角、背角淺層、中央導水管周圍；且癌痛組NR2B表達上調(diào)的同時，疼痛行為學也有相應的改變。初步表明脊髓和前扣帶回中的NR2B表達增加與小鼠骨癌痛產(chǎn)生和維持存在一定相關性。 2、同一癌痛模型

11、中觀察到NR2B在脊髓和前扣帶回同時高表達，提示在癌痛的產(chǎn)生和維持中不僅激活了脊髓低位中樞，而且有腦部中樞的參與。 3、本研究初次發(fā)現(xiàn)NR2B在脊髓前角細胞表達呈強陽性，為下一步研究提供了新的思路。27圖3：癌痛組、干擾組和干擾對照組小鼠脊髓NR2BmRNA的相對表達量8、實時熒光定量PCR檢測小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達289、Western Blot檢測小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達 Western Blot檢測接種術(shù)后第14天 小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達 A:干擾組；B:干擾對照組；C:癌痛組NR2BGAPDHA B C* Western Blot檢測接種術(shù)后第18天

12、小鼠脊髓L4-6節(jié)段NR2B的表達 A:干擾組；B:干擾對照組；C:癌痛組NR2BGAPDH*291、 PEI/NR2B-siRNA復合物鞘內(nèi)注射后能使骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表達下調(diào)；2、骨癌痛小鼠脊髓中NR2B的表達下調(diào)與小鼠疼痛行為學減輕相一致，進一步證明NR2B在癌痛發(fā)生過程中起重要作用，可能是癌痛治療的有效靶點。3010、實時熒光定量PCR檢測小鼠脊髓NR2B、SP、 c-fos和GFAP基因的表達接種術(shù)后第14天，實時熒光定量PCR檢測各組小鼠脊髓NR2B、SP、GFAP、c-fos的相對表達量 注：圖示中NR2B組放大100倍，c-fos放大10倍3111、實時熒光定量PCR檢

13、測小鼠脊髓NR2B、SP、 c-fos和GFAP基因的表達接種術(shù)后第18天，實時熒光定量PCR檢測各組小鼠脊髓NR2B、SP、GFAP、c-fos的相對表達量 注：圖示中NR2B和c-fos組均放大100倍32 圖5：Western Blot檢測接種術(shù)后第18天 小鼠脊髓NR2B的表達 A: 正常組；B: 癌痛組；C: 干擾組；D: 干擾對照組*圖6：Western Blot檢測接種術(shù)后第14天 小鼠脊髓p-ERK的表達A: 正常組；B: 癌痛組；C: 干擾組；D: 干擾對照組3.1 接種術(shù)后第14天，檢測NR2B和p-ERK蛋白表達 NR2B GAPDHp-ERKGAPDH*12、Weste

14、rn Blot檢測接種術(shù)后第14天小鼠脊髓的NR2B，p-ERK ，p-p38和GFAP蛋白表達33 Western Blot檢測接種術(shù)后第14天 小鼠脊髓p-p38的表達 A: 正常組；B: 癌痛組；C: 干擾組；D: 干擾對照組* Western Blot檢測接種術(shù)后第14天 小鼠脊髓GFAP的表達A: 正常組；B: 癌痛組；C: 干擾組；D: 干擾對照組*13、接種術(shù)后第14天，檢測p-p38和GFAP蛋白表達GAPDHGFAP GAPDH34Western Blot檢測接種術(shù)后第18天 小鼠脊髓NR2B的表達 A: 正常組；B: 癌痛組；C: 干擾組；D: 干擾對照組Western B

15、lot檢測接種術(shù)后第18天 小鼠脊髓p-ERK的表達A: 正常組；B: 癌痛組；C: 干擾組；D: 干擾對照組 接種術(shù)后第18天，檢測NR2B和p-ERK蛋白表達14、 Western Blot檢測接種術(shù)后第18天小鼠脊髓的NR2B，p-ERK ，p-p38和GFAP蛋白表達NR2BGAPDH p-ERK GAPDH*35Western Blot檢測接種術(shù)后第18天 小鼠脊髓p-p38的表達 A: 正常組；B: 癌痛組；C: 干擾組；D: 干擾對照組Western Blot檢測接種術(shù)后第18天 小鼠脊髓GFAP的表達A: 正常組；B: 癌痛組；C: 干擾組；D: 干擾對照組接種術(shù)后第18天，檢

16、測p-p38和GFAP蛋白表達 p-p38 GAPDH GFAP GAPDH*361）癌痛小鼠的MAPK通路中相應信號分子p-ERK、p-p38、c-fos表達明顯上調(diào)；而NR2B的沉默可以下調(diào)MAPK通路中相應信號分子p-ERK、p-p38、c-fos表達；2）GFAP在癌痛小鼠中高表達，同時NR2B的調(diào)控可以影響GFAP的表達；37解除Mg2+ 對NMDA受體離子通道的阻斷作用結(jié)合到突觸后膜上配體門控離子型谷氨酸受體AMPA受體，Na+內(nèi)流NMDA受體激活，Ca2+內(nèi)流增加激活ERK，p38c-fos轉(zhuǎn)錄因子激活NR2B表達傷害性信號傳入脊髓背角，釋放大量谷氨酸傷害性信號傳入脊髓背角，釋放大量谷氨酸SP表達神經(jīng)元下游相關基因表達變化神經(jīng)膠質(zhì)細胞GFAP表達結(jié)合到膠質(zhì)細胞上AMPA受體激活ERK，p38直接導致膠質(zhì)細胞內(nèi)的GFAP大量表達導致癌痛導致癌痛我們推測癌痛產(chǎn)生的可能機制我們推測癌痛產(chǎn)生的可能機制3839結(jié)結(jié) 論論1. C57BL/6小鼠股骨骨髓腔接種Lewis肺癌細胞能成功制備小鼠骨癌痛新模型，此模型與人類骨癌痛具有相似性；2. NR2B在小鼠骨癌痛模型中呈高表達，且同一癌痛模型中觀察到NR2B在L4-L6段脊髓和前扣帶回同時高表達，提示在癌痛的產(chǎn)生和維持中不僅激活了脊髓低位中樞