1、激光拉曼光譜法Laser Raman spectroscopy一、一、激光拉曼法光譜概述激光拉曼法光譜概述二、激光拉曼光譜原理二、激光拉曼光譜原理三、激光拉曼光譜儀三、激光拉曼光譜儀四、激光拉曼光譜分析法的應(yīng)用四、激光拉曼光譜分析法的應(yīng)用17:24:39一、激光拉曼光譜法概述Rayleigh散射：彈性碰撞：無能量交換，僅改變方向。Raman散射：非彈性碰撞：方向改變且有能量交換。Rayleigh散射Raman散射 h E0E1=1=0h 0h 0h 0h 0 + E1 + h 0E0 + h 0h( 0 - )激發(fā)虛態(tài) E0基態(tài)， E1振動激發(fā)態(tài)； E0 + h0 ， E1 + h0 激發(fā)虛態(tài)

2、。17:24:39The Nobel Prize in Physics 1930 “for his work on the scattering of light and for the discovery of the effect named after him” Sir Chandrasekhara Venkata Raman (1888 1970) Calcutta University Calcutta, India 1928年印度物理學(xué)家年印度物理學(xué)家Raman 發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)，1930年獲諾貝爾獎，年獲諾貝爾獎，1960年快速發(fā)展年快速發(fā)展17:24:39拉曼（拉曼（C.V. Ram

3、an）于）于1928年首次發(fā)現(xiàn)的。年首次發(fā)現(xiàn)的。 19281940年，受到廣泛的重視，曾是研究分子結(jié)構(gòu)的年，受到廣泛的重視，曾是研究分子結(jié)構(gòu)的主要手段。這是因為可見光分光技術(shù)和照相感光技術(shù)已主要手段。這是因為可見光分光技術(shù)和照相感光技術(shù)已經(jīng)發(fā)展起來的緣故；經(jīng)發(fā)展起來的緣故；19401960年，拉曼光譜的地位一落千丈。主要是因為年，拉曼光譜的地位一落千丈。主要是因為拉曼效應(yīng)太弱（約為入射光強的拉曼效應(yīng)太弱（約為入射光強的10-6），并要求被測樣），并要求被測樣品的體積必須足夠大、無色、無塵埃、無熒光等等。所品的體積必須足夠大、無色、無塵埃、無熒光等等。所以到以到40年代中期后，紅外技術(shù)的進(jìn)步和商

4、品化更使拉曼年代中期后，紅外技術(shù)的進(jìn)步和商品化更使拉曼光譜的應(yīng)用一度衰落；光譜的應(yīng)用一度衰落；拉曼散射效應(yīng)的進(jìn)展：拉曼散射效應(yīng)的進(jìn)展：17:24:391960年以后，激光技術(shù)的發(fā)展使拉曼技術(shù)得以復(fù)年以后，激光技術(shù)的發(fā)展使拉曼技術(shù)得以復(fù)興。這是由于激光器輸出的激光具有很好的興。這是由于激光器輸出的激光具有很好的單色單色性、方向性，且強度很大性、方向性，且強度很大，因而它們成為獲得拉，因而它們成為獲得拉曼光譜的近乎理想的光源，特別是連續(xù)波曼光譜的近乎理想的光源，特別是連續(xù)波氬離子氬離子激光器激光器。于是拉曼光譜學(xué)的研究又變得非?；钴S。于是拉曼光譜學(xué)的研究又變得非?；钴S了，其研究范圍也有了很大的擴展

5、。隨探測技術(shù)了，其研究范圍也有了很大的擴展。隨探測技術(shù)的改進(jìn)和對被測樣品要求的降低，目前在物理、的改進(jìn)和對被測樣品要求的降低，目前在物理、化學(xué)、醫(yī)藥、工業(yè)等各個領(lǐng)域拉曼光譜得到了廣化學(xué)、醫(yī)藥、工業(yè)等各個領(lǐng)域拉曼光譜得到了廣泛的應(yīng)用，越來越受研究者的重視。除擴大了所泛的應(yīng)用，越來越受研究者的重視。除擴大了所研究的物質(zhì)的品種以外，在研究燃燒過程、探測研究的物質(zhì)的品種以外，在研究燃燒過程、探測環(huán)境污染、分析各種材料等方面拉曼光譜技術(shù)也環(huán)境污染、分析各種材料等方面拉曼光譜技術(shù)也已成為很有用的工具。已成為很有用的工具。17:24:39拉曼光譜技術(shù)的優(yōu)點拉曼光譜技術(shù)的優(yōu)點 提供快速、簡單、可重復(fù)、且更重要

6、的是無損傷的定提供快速、簡單、可重復(fù)、且更重要的是無損傷的定性定量分析，它無需樣品準(zhǔn)備，樣品可直接通過光纖性定量分析，它無需樣品準(zhǔn)備，樣品可直接通過光纖探頭或者通過玻璃、石英、和光纖測量。此外探頭或者通過玻璃、石英、和光纖測量。此外 1 、由于水的拉曼散射很微弱，拉曼光譜是研究水溶、由于水的拉曼散射很微弱，拉曼光譜是研究水溶液中的生物樣品和化學(xué)化合物的理想工具。液中的生物樣品和化學(xué)化合物的理想工具。 2 、拉曼一次可以同時覆蓋、拉曼一次可以同時覆蓋50-4000波數(shù)的區(qū)間，可對波數(shù)的區(qū)間，可對有機物及無機物進(jìn)行分析。相反，若讓紅外光譜覆蓋有機物及無機物進(jìn)行分析。相反，若讓紅外光譜覆蓋相同的區(qū)間

7、則必須改變光柵、光束分離器、濾波器和相同的區(qū)間則必須改變光柵、光束分離器、濾波器和檢測器檢測器17:24:39 3、 拉曼光譜譜峰清晰尖銳，更適合定量研究、數(shù)據(jù)庫拉曼光譜譜峰清晰尖銳，更適合定量研究、數(shù)據(jù)庫搜索、以及運用差異分析進(jìn)行定性研究。在化學(xué)結(jié)構(gòu)分搜索、以及運用差異分析進(jìn)行定性研究。在化學(xué)結(jié)構(gòu)分析中，獨立的拉曼區(qū)間的強度可以和功能集團(tuán)的數(shù)量相析中，獨立的拉曼區(qū)間的強度可以和功能集團(tuán)的數(shù)量相關(guān)。關(guān)。4 、因為激光束的直徑在它的聚焦部位通常只有、因為激光束的直徑在它的聚焦部位通常只有0.2-2毫毫米，常規(guī)拉曼光譜只需要少量的樣品就可以得到。這是米，常規(guī)拉曼光譜只需要少量的樣品就可以得到。這是

8、拉曼光譜相對常規(guī)紅外光譜一個很大的優(yōu)勢。而且，拉拉曼光譜相對常規(guī)紅外光譜一個很大的優(yōu)勢。而且，拉曼顯微鏡物鏡可將激光束進(jìn)一步聚焦至曼顯微鏡物鏡可將激光束進(jìn)一步聚焦至20微米甚至更小，微米甚至更小，可分析更小面積的樣品。可分析更小面積的樣品。5 、共振拉曼效應(yīng)可以用來有選擇性地增強大生物分子、共振拉曼效應(yīng)可以用來有選擇性地增強大生物分子特個發(fā)色基團(tuán)的振動，這些發(fā)色基團(tuán)的拉曼光強能被選特個發(fā)色基團(tuán)的振動，這些發(fā)色基團(tuán)的拉曼光強能被選擇性地增強擇性地增強1000到到10000倍。倍。17:24:391 瑞利散射與拉曼散射光線通過試樣，透射仍為主體波長遠(yuǎn)小于粒徑，小部分散射散射：僅改變方向，波長不變。

9、 彈性碰撞無能量交換瑞利散射不變垂直方向觀測,原波長兩側(cè)還有散射光非彈性碰撞，有能量交換，波長有變化拉曼散射變二、 拉曼光譜原理（一） Raman散射與Raman位移17:24:391 1. . Raman散射散射Raman散射的兩種躍遷能量差： E=h(0 - )產(chǎn)生stokes線；強；基態(tài)分子多。 E=h(0 + )產(chǎn)生反stokes線；弱。Raman位移：Raman散射光與入射光頻率差。Raman散射與Raman位移17:24:392. Raman位移 (1) 對不同物質(zhì)： 不同。 (2) 對同一物質(zhì)： 與入射光頻率無關(guān)；表征分子振-轉(zhuǎn)能級的特征物理量；定性與結(jié)構(gòu)分析的依據(jù)；分子振-轉(zhuǎn)光

10、譜；與紅外光譜互補。 (3) Raman散射的產(chǎn)生：光電場E中，分子產(chǎn)生誘導(dǎo)偶極矩，即 = E 分子極化率，分子電子云分布改變的難易程度。17:24:39=| 0 s |, 即散射光頻率與激發(fā)光頻之差。v取決于分子振動能級的改變，所以他是特征的。適用于分子結(jié)構(gòu)分析與入射光波長無關(guān)17:24:393.3.紅外活性和拉曼活性振動紅外活性和拉曼活性振動紅外活性振動紅外活性振動 .永久偶極矩；極性基團(tuán)。 .瞬間偶極矩；非對稱分子。 紅外活性振動-伴有偶極矩變化的振動可以產(chǎn)生紅外吸收譜帶。拉曼活性振動拉曼活性振動 誘導(dǎo)偶極矩 = E 非極性基團(tuán)，對稱分子。 拉曼活性振動-伴隨有極化率變化的振動。 對稱分

11、子： 對稱振動拉曼活性。不對稱振動紅外活性 Eeer17:24:39(二) Raman光譜CCl4的的Ramam光譜圖光譜圖 17:24:391. Raman光譜特點(1) (1) 拉曼光譜記錄的是拉曼光譜記錄的是stoke stoke 線。線。(2) 測量相對單色激發(fā)光頻率的位移。測量相對單色激發(fā)光頻率的位移。 把入射光頻率位置作為零，頻率位移(拉曼位移)的數(shù)值正好對應(yīng)于分子振動或轉(zhuǎn)動能級躍遷的頻率。(3) 激發(fā)光是可見光，在可見光區(qū)測分子振動光譜。激發(fā)光是可見光，在可見光區(qū)測分子振動光譜。(4) 拉曼光譜中的基團(tuán)振動頻率和紅外光譜相同。拉曼光譜中的基團(tuán)振動頻率和紅外光譜相同。 酮羰基的伸縮

12、振動在紅外光譜中位于1710cm-1附近，而拉曼光譜中總在（1710土3）cm-1。 17:24:392 拉曼光譜的譜圖特征由拉曼光譜可以獲得有機化合物的各種結(jié)構(gòu)信息：2）紅外光譜中，由CN，CS，SH伸縮振動的譜帶較弱或強度可變，而拉曼光譜中則是強譜帶。3）強極性基團(tuán)在拉曼中是弱譜帶如極性基因CO在紅外中是強譜帶，而在Raman中是弱譜帶。 1）同種原子非極性鍵SS，CC，NN，CC, 強拉曼譜帶， 隨單鍵雙鍵三鍵譜帶強度增加。17:24:394）環(huán)狀化合物的對稱呼吸振動常常是最強的拉曼譜帶。形成環(huán)狀骨架的鍵同時振動。5）在拉曼光譜中， XYZ，CNC，OCO這類鍵的對稱伸縮振動是強譜帶，反

13、之，非對稱伸縮振動是弱譜帶。紅外光譜與此相反。6）CC伸縮振動譜帶在拉曼光譜中強，紅外光譜中弱。17:24:397）醇和烷烴的拉曼光譜是相似的。 I. CO鍵與CC鍵的力常數(shù)或鍵的強度沒有很大差別。 II. 羥基和甲基的質(zhì)量僅相差2單位。 III.與CH和NH譜帶比較，OH拉曼譜帶較弱。17:24:393. 3. 紅外與拉曼譜圖對比紅外與拉曼譜圖對比紅外光譜：基團(tuán)；拉曼光譜：分子骨架測定。17:24:39紅外與拉曼譜圖對比紅外與拉曼譜圖對比17:24:394 拉曼光譜與紅外光譜的關(guān)系同同屬分子振(轉(zhuǎn))動光譜異：紅外分子對紅外光的吸收強度由分子偶極距決定異：拉曼分子對激光的散射強度由分子極化率決

14、定紅外：適用于研究不同原子的極性鍵振動 OH, CO，CX拉曼：適用于研究同原子的非極性鍵振動 NN, CC互補17:24:39拉曼光譜與紅外光譜的關(guān)系O=C=O對稱伸縮O=C=O反對稱伸縮偶極距不變無紅外活性極化率變有拉曼活性極化率不變無拉曼活性偶極距變有紅外活性17:24:39拉曼光譜與紅外光譜的關(guān)系互排法則：有對稱中心的分子其分子振動 對紅外和拉曼之一有活性，則另一非活性互允法則：無對稱中心的分子其分子振動 對紅外和拉曼都是活性的。結(jié)構(gòu)分析：H4C4N4拉曼C=C 1623 cm-1 強紅外C=C 1621 cm-1 強CCCNCNN H2N H217:24:39(三) 拉曼光譜選律 對

15、稱中心分子CO2，CS2等，選律不相容。 無對稱中心分子（例如SO2等），三種振動既是紅外活性振動，又是拉曼活性振動。SCSSCSSCS 1 2 3 4拉曼活性紅外活性紅外活性拉曼光譜拉曼光譜源于極化率變化源于極化率變化紅外光譜紅外光譜源于偶極矩變化源于偶極矩變化17:24:39三、激光拉曼光譜儀（結(jié)構(gòu)流程）（一）結(jié)構(gòu)流程（一）結(jié)構(gòu)流程激光光源激光光源、試樣池試樣池、單色器、檢測器。單色器、檢測器。17:24:39激光器最常用Ar激光器 488.0/514.5nm頻率高，拉曼光強大He-Ne激光器，波長632.8 nm 。試樣室發(fā)射透鏡 使激光聚焦在樣品上收集透鏡 使拉曼光聚焦在雙單色儀的入射

16、狹縫（二）主要部件17:24:39雙單色儀儀器心臟2個光柵，4個狹縫減少雜散收光檢測器 光電倍增管， 光子計數(shù)器17:24:39（三）傅里葉變換-拉曼光譜儀光源：Nd-YAG釔鋁石榴石激光器（1.064 m）。檢測器：高靈敏度的銦鎵砷探頭。17:24:39傅里葉變換傅里葉變換-拉曼光譜儀特點拉曼光譜儀特點特點：特點：（1）避免了熒光干擾；）避免了熒光干擾；（2）精度高；）精度高；（3）消除了瑞利譜線；）消除了瑞利譜線；（4）測量速度快。）測量速度快。17:24:39 當(dāng)激發(fā)光的頻率接近或等于試樣的電子吸收譜當(dāng)激發(fā)光的頻率接近或等于試樣的電子吸收譜帶的頻率時，發(fā)生共振拉曼效應(yīng)。帶的頻率時，發(fā)生共

17、振拉曼效應(yīng)。 當(dāng)激發(fā)光的頻率接近電子吸收譜帶的頻率時，當(dāng)激發(fā)光的頻率接近電子吸收譜帶的頻率時，稱為準(zhǔn)共振拉曼效應(yīng)。稱為準(zhǔn)共振拉曼效應(yīng)。 當(dāng)激發(fā)光的頻率等于電子吸收譜帶的頻率時，當(dāng)激發(fā)光的頻率等于電子吸收譜帶的頻率時，稱為嚴(yán)格的共振拉曼效應(yīng)。稱為嚴(yán)格的共振拉曼效應(yīng)。1 共振拉曼光譜RRS（四）發(fā)展 拉曼強度增萬至百萬倍，高靈敏度，宜定量 共振，高選擇性 可調(diào)染料激光器17:24:391.多譜線輸出的激光器（或可調(diào)諧的激光器）。多譜線輸出的激光器（或可調(diào)諧的激光器）。2.試試樣的濃度必須很低樣的濃度必須很低 避免產(chǎn)生熱分解作用，通常在10-8 molL-1左右。 共振拉曼散射的強度較普通拉曼譜帶的

18、強度增加104106倍，需要的試樣濃度很低，故在研究具有發(fā)色基團(tuán)的樣品和低濃度的生物樣品有很大應(yīng)用。 測量測量共振拉曼效應(yīng)時的注意點：共振拉曼效應(yīng)時的注意點：17:24:392 表面增強拉曼光譜SERS 試樣吸附在金屬表面上，增103106 表面與共振聯(lián)用檢測限1091012 mol/L1.保證使用環(huán)境：具備暗室條件；無強震動源、無強電磁干擾；不可受陽光直射。2.光學(xué)器件表面有灰塵，不允許接觸擦拭，可用氣球小心吹掉。3.實驗結(jié)束，首先取出樣品，關(guān)斷電源。4.注意激光器電源開、關(guān)機的順序正好相反。表面增強拉曼使用中的注意事項17:24:39四、 激光拉曼光譜法的應(yīng)用（一）（一） 拉曼光譜與紅外光

19、譜的比較拉曼光譜與紅外光譜的比較17:24:40（二）無機體系 優(yōu)于紅外，基于MOrg鍵的振動 MO也具有Raman活性 Raman譜證實： V(IV)是VO2不是V(OH)22 硼酸離解是B(OH)4-不是H2(BO)3 Raman光譜可求H2SO4等強酸的解離常數(shù)17:24:40（三）有機化合物 與紅外互補， Raman適骨架，IR適端基 C=C1900-1500vs-mo-wN=N芳取代1440-1410mo 振動 /cm-1 拉曼強度紅外強度 O-H 3650-3000ws17:24:40（四）在生命科學(xué)領(lǐng)域額 1、生物分子的鑒定與結(jié)構(gòu)表征 拉曼光譜技術(shù)在測量生物分子時,具有結(jié)構(gòu)信息量

20、大,測量速度快,操作方便等優(yōu)點,尤其是在測量DNA 水溶液時,幾乎不受水的干擾,故在DNA 的研究中非常直接和有效。通過對DNA 分子的拉曼光譜研究,可以從分子水平上了解遺傳、代謝、分化及癌變等過程的生命本質(zhì)。 2、藥物與生物分子的作用機理探討 藥物和生物大分子的相互作用機理可通過其拉曼光譜圖中新譜帶的出現(xiàn)，譜帶位移和譜帶強度變化等加以研究。 對藥物和生物大分子相互作用的研究,有助于加深理解藥物與生物大分子 的作用機理、探索新的有效的藥物。 實例：抗壞血酸主要是通過OH 的氫鍵和C2O 基團(tuán)與DNA的磷酸鹽、堿基及脫氧核酸供體原子發(fā)生相互作用。17:24:403、細(xì)胞、組織和器官的活體與體外檢

21、測 組織和細(xì)胞發(fā)生癌變總是從構(gòu)成它們的分子開始，癌變過程中組織和細(xì)胞發(fā)生癌變總是從構(gòu)成它們的分子開始，癌變過程中各種生物分子的構(gòu)型、構(gòu)象及各成分的構(gòu)成比例發(fā)生變化。這各種生物分子的構(gòu)型、構(gòu)象及各成分的構(gòu)成比例發(fā)生變化。這些早期變化不引起臨床癥狀且常規(guī)的臨床檢測手段往往難以發(fā)些早期變化不引起臨床癥狀且常規(guī)的臨床檢測手段往往難以發(fā)現(xiàn)，而拉曼光譜可反映分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)、振轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)，能夠從分現(xiàn)，而拉曼光譜可反映分子的精細(xì)結(jié)構(gòu)、振轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)，能夠從分子水平上檢測出這些變化，已成為早期診斷癌癥的潛在途徑。子水平上檢測出這些變化，已成為早期診斷癌癥的潛在途徑。 組織細(xì)胞在發(fā)生癌變后氨基酸、脂類、碳水化合物都可能發(fā)生組織細(xì)胞在發(fā)生癌變后氨基酸、脂類、碳水化合物都可能發(fā)生變化，可能成