1、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)免疫細(xì)胞化學(xué)，與免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry）相同，它 是組織化學(xué)的分支，它是用標(biāo)記的特異性抗體（或抗原）對組織內(nèi)抗原（或抗體）的分布進行組織和細(xì)胞原位檢測技術(shù)。免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多肽和蛋白質(zhì)），對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)(immunocytochemistry)。抗原和抗體的要求· 具有特異性高和親和力強的抗體是

2、實驗成功的首要條件。 對抗體的要求：純度高、比活性強；· 高度特異性抗體的獲得，取決于抗原的純度。 對抗原的要求：純度高，免疫原性強，穩(wěn)定無變化?？乖?(antigen, Ag)· 抗原的概念：凡是在機體內(nèi)引起體液免疫和(或)細(xì)胞免疫反應(yīng)的物質(zhì)，稱為抗原?？乖哂袃蓚€方面的特性： 免疫原性：引起機體產(chǎn)生抗體和(或)致敏淋細(xì)胞的特性； 免疫反應(yīng)性：抗原能與相應(yīng)的抗體及致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異的結(jié)合或反應(yīng)的特性。· 根據(jù)抗原是否顯示免疫原性分為： 完全抗原：分子量較大，一般在10kDa以上，并具有較復(fù)雜的化學(xué)組成。· 免疫原性最強的是蛋白質(zhì)抗原，多糖次之；脂類和

3、核酸必需和蛋白質(zhì)及多糖形成復(fù)合物才具有良好的免疫原性。 半抗原：又稱為不完全抗原，分子量較小。例如：某些短肽、多糖、類脂和藥物等。· 半抗原必需與載體結(jié)合，才能獲得免疫原性。載 體· 通常是具有高度免疫原性的大分子物質(zhì)，具有將免疫原性傳遞給耦聯(lián)的半抗原能力。 常用的載體有鑰孔血藍(lán)蛋白(keyhole limpet hemocyanin，KLH)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)、卵白蛋白(Ovalbumin，OVA)等。 用戊二醛或碳化二亞胺作為交聯(lián)劑通過功能基團-NH2、-COOH等將半抗原結(jié)合到載體上。結(jié)合比例為5kDa結(jié)合525個分子

4、的小肽。（三）抗體 (antibody, Ab)1、抗體的概念： 免疫球蛋白· 機體受到抗原刺激后，由漿細(xì)胞合成并分泌出一類具有與抗原發(fā)生特異性結(jié)合的球蛋白，被稱為抗體。 抗體主要存在于血清內(nèi)； 抗體都是免疫球蛋白，但免疫球蛋白并不一定都是抗體。 免疫球蛋白根據(jù)重鏈的結(jié)構(gòu)及抗原特異性不同分為五種，既IgG、 IgD、IgE、 IgA、IgM。2、免疫組化實驗中常用的抗體：單克隆抗體和多克隆抗體。·單克隆抗體：是一個B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，是應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動物制備的。特異性強、抗體產(chǎn)量高。· 多克隆抗體：是將純化后的抗原直接免疫動物后，從動物血中所獲得

5、的免疫血清，是多個B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。 特異性低，會產(chǎn)生抗體的交叉反應(yīng)。 多克隆抗體廣泛應(yīng)用于石蠟包埋組織切片，可減少假陰性染色機會。 抗原與抗體的結(jié)合，要求量保持一定比例，當(dāng)抗原或抗體過量時，是不能聚合成大顆粒。3、抗體的制備多克隆抗體的制備· 動物的選擇· 佐劑(adjuvant)· 免疫方法· 免疫劑量· 抗體效價的測定· 放血或定期抽血(1) 動物的選擇選擇什么動物來免疫取決于：· 所需抗血清的量 小鼠只能提供1.01.5ml的血液，而山羊能提供幾升。· 能供免疫用的抗原量 小鼠50mg足夠，

6、而山羊需要幾毫克。(1) 動物的選擇(續(xù))· 動物的品系：免疫動物與提供抗原的動物之間的種系差異越大越好。 例如哺乳動物的抗原可選擇非哺乳動物來制備抗體。 常用的動物有兔、羊、馬、豬等，以兔(新西蘭兔，年輕，健壯，體重在2.5kg左右，雄性)為最常用。(2) 佐劑 (adjuvant)· 一般可溶性抗原注射后，迅速從注射部位擴散、吸收代謝。佐劑可延長潴留時間，且延長免疫刺激作用。因此在制備抗體的過程中，常將抗原和佐劑一起注射。· 最常用的佐劑是弗氏佐劑，又分為:弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant) 弗氏完全佐劑(Fre

7、und's complete adjuvant)弗氏不完全佐劑(Freund's incomplete adjuvant, FIA)· 是由油劑(石蠟油或植物油)與乳化劑(羊毛脂或Tween80)混合而成，比例為1:1、2:1、3:1或5:1，可根據(jù)需要而定，通常2:1。· 使用時與水溶性抗原按1:1比例充分混合，使抗原分散在佐劑中形成油包水乳劑。弗氏完全佐劑 (Freund's complete adjuvant, FCA)· 在弗氏不完全佐劑中加入活卡介苗或死的結(jié)核分枝桿菌(終濃度為220mg/ml)，即成為FCA。· 免疫動

8、物時，將弗氏佐劑與抗原按體積 1:1 混合乳化后(油包水)注入動物。 一般首次注射時用完全佐劑乳化，第二次或第三次注射時用不完全佐劑或不用佐劑。佐劑與抗原乳化的方法· 研磨法：適于制備大量的佐劑抗原 先將不完全佐劑加熱，取1.73ml放人無菌玻璃研缽內(nèi)；緩緩滴入0.23ml活卡介苗，邊滴邊按同一方向研磨，使菌體完全分散。 按同樣方法滴人抗原，每加一滴應(yīng)研磨至小滴消失。滴加抗原的速度要慢，待抗原全部加人后，應(yīng)成為乳白色粘稠的油包水乳劑。· 缺點：研缽壁上粘附大量乳劑，抗原損失較大，對微量或難得抗原不宜采用。佐劑與抗原乳化的方法(續(xù))· 注射器混合法 將等量的完全佐劑

9、和抗原分別吸人兩個5ml注射器內(nèi)，然后插入三通管內(nèi)，交替推動針管混勻，往復(fù)操作直至形成粘稠的乳劑為止。· 優(yōu)點：無菌操作，節(jié)省抗原或佐劑。· 缺點：不易乳化，時間長。佐劑與抗原乳化的方法(續(xù))· 快速乳化法：利用超聲波粉碎器可快速乳化抗原和佐劑混合物。 將抗原和佐劑按所需量加入一離心管中，置于超聲波粉碎器上，粉碎頭浸入液面下 0.5cm，離瓶底0.5cm左右，以免打碎離心管。 每次乳化 1015s，然后置冰箱lmin左右。反復(fù)乳化34次即可完全乳化。管內(nèi)殘余量800r/min離心510min收集。· 優(yōu)點：簡單、快速、節(jié)省材料。乳化劑的鑒定·

10、判斷乳化是否充分，可將一滴乳化好的液體滴在水面上(冷水中)，如能長時間保持圓珠形而不散開，表示乳化達(dá)到要求。(3) 免疫方法免疫途徑· 常有靜脈、腹腔、肌肉、皮下、皮內(nèi)、淋巴結(jié)、腳掌等注射。· 一般采用多點注射方法 常在足、掌、腋窩淋巴結(jié)周圍、背部兩側(cè)、頜下、耳后等處的皮內(nèi)或皮下。 皮內(nèi)易引起細(xì)胞免疫反應(yīng)，有利于提高抗體的效價。(3) 免疫方法免疫途徑 (續(xù))· 幾點說明： 大動物一般不用腹腔注射 顆?？乖褪褂米魟r不能靜脈注射 抗原寶貴可采用淋巴結(jié)內(nèi)微量注射法，只需10100mg抗原即可獲得較好的免疫效果。 皮內(nèi)注射較困難，特別是天冷時更難注入。(3) 免疫方

11、法次數(shù)及間隔時間· 次數(shù)一般為23次(初次免疫和加強免疫) 首次注射后，1015天再加強注射； 劑量同首次或為首次的一半，用不全佐劑或不用佐劑。· 間隔時間，一般而言，動物越大，間隔越長 豚鼠、大鼠為78天，兔子為1015天，羊為1428天； 第三次注射的間隔時間更長些，效果更好。舉例1：家兔的免疫· 初次免疫 用50200mg Ag加入FCA，在背部皮下注射68點，每點0.10.2ml，也可肌肉內(nèi)或皮內(nèi)注射；· 兩周后，加強免疫 將50200mg Ag于PBS或FIA中，在肌肉、皮下、靜脈或腹腔內(nèi)注射；· 抗體效價的檢測：加強免疫一周后，耳緣

12、靜脈采血 抗體效價測定可用環(huán)狀沉淀試驗、瓊脂雙向擴散法等方法。前者抗體效價在1:4000以上，后者在1:16以上，即可采血，取血清進一步提純。舉例2：微量抗原淋巴結(jié)內(nèi)注射免疫家兔· 一般選擇2.53.0kg的新西蘭種公兔 先在其兩腳墊注射完全福氏佐劑0.2ml(卡介苗每兔合5mg)； 10天后，見胭窩淋巴結(jié)腫大，然后將抗原注射至腫大的淋巴結(jié)內(nèi)，第一次注射抗原用完全福氏佐劑混合乳化； 以后每隔20天用不完全福氏佐劑乳化抗原，以同樣方法加強2次，各次注射的抗原均為2550mg； 末次注射兩周后兔耳放血測價 (可達(dá)1:128)。舉例3：豚鼠和大鼠的免疫· 初次免疫 用10100m

13、g Ag加入FCA，在背部皮內(nèi)注射46點，每點 0.lml，也可肌肉內(nèi)或皮下注射；· 加強免疫 每隔 78天，將1050mg Ag于 PBS或FIA中。在肌肉、皮下或靜脈注射；· 抗體效價的檢測(4) 免疫劑量· 抗原性強的抗原量應(yīng)小，過大反會引起免疫抑制；· 免疫周期長的動物可少量多次注射，短的可大量少次。(4) 免疫劑量 (續(xù))· 各種動物首次免疫抗原劑量和加強免疫的劑量(5) 抗體效價的檢測多采免疫雙向擴散法【基本原理】· 指抗原和抗體在同一凝膠內(nèi)都擴散，彼此相遇后形成特異性的沉淀線。 將抗原與抗體分別加入同一凝膠板中兩個相隔一

14、定間距的小孔內(nèi)，使兩者進行相互擴散，當(dāng)抗原抗體濃度之比相適宜時，彼此相遇形成一白色弧狀沉淀線。· 優(yōu)缺點：簡便，但敏感性較低，易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。免疫雙向擴散法的操作步驟· 將玻璃板用水洗凈后用75%乙醇沖洗，晾干后放在水平臺上備用。· 將l % agar 融化后，置56°C水浴。· 在玻璃板上鋪膠，約1.5mm 厚，凝固后打孔(直徑 3rnm)，孔間距10mm。· 中心孔加5ml 抗原樣品，周圍孔內(nèi)每孔加5ml 抗血清(抗體預(yù)先作系列倍比稀釋即 1:2、1:4、1:8、1:16、1:32等比例)。· 凝膠板置濕盒內(nèi)，室溫擴散

15、24h。· 觀察結(jié)果?？贵w效價檢測的其它方法· 環(huán)狀沉淀試驗，需較多的抗血清，現(xiàn)已很少用；·對流免疫電泳，比瓊脂免疫雙擴散法敏感，較簡便、實用；·酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)。(6) 放血或定期抽血常用以下3種方法· 頸動脈放血法：放血量較多，動物不易中途死亡。例如：2.5kg白兔可放血約80ml。家兔、山羊、綿羊等動物采血常用此法。· 心臟采血法：常用于家兔、豚鼠、大白鼠、雞等小動物，但操作不當(dāng)易引起動物死亡。· 靜脈采血：家兔可用耳緣靜脈采血；山羊、綿羊、馬和驢可用頸靜脈采血，這種放血法可隔日1次，有時可采集多量血液

16、。(6) 放血或定期抽血 (續(xù))· 采血過程中，動作要輕柔，盡量避免溶血· 血液凝固后，及時離心收集血清，否則細(xì)胞溶解釋放的雜蛋白(例如蛋白水解酶)將污染抗體并將抗體水解，降低效價；· 加疊氮化鈉，分裝，低溫保存，也可加一定的保護劑如BSA、甘油等。· 標(biāo)本制備恰當(dāng)，是免疫組化成功的首要條件· 免疫組化對組織和細(xì)胞標(biāo)本的要求 保持所檢標(biāo)本原有的結(jié)構(gòu)、形態(tài)； 在原位最大程度地保持待測抗原(或抗體)的免疫活性，既不淬滅、流失或彌散，也不被隱蔽。·免疫組化的組織和細(xì)胞標(biāo)本，制作流程與常規(guī)處理方法基本相同，但對組織、細(xì)胞的處理又有其特殊要求及

17、注意事項。 各種抗原由于其含量及特性的差異對標(biāo)本處理方式常有不同要求，因此要選擇適用于本實驗的最佳方法。免疫組化中常用的組織和細(xì)胞標(biāo)本· 組織標(biāo)本石蠟切片 冰凍切片· 細(xì)胞標(biāo)本 組織印片細(xì)胞培養(yǎng)片(細(xì)胞爬片) 細(xì)胞涂片石蠟切片· 石蠟切片是制作組織標(biāo)本最常用、最基本的方法 最大優(yōu)點是組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察； 石蠟塊還能長期存檔，供回顧研究。·石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原顯現(xiàn)有一定的影響，但可通過某些措施予以改善，因而它是大多數(shù)免疫組化中首選的組織標(biāo)本制作方法。1、取材的特殊要求及注意事項· 標(biāo)本新鮮：一般在2h以

18、內(nèi)進行，超過2h，組織將有不同程度的自溶，其抗原或變性消失，或嚴(yán)重彌散。· 取材部位：除取病灶或含待檢抗原部位外，還應(yīng)取病灶與正常交界處，即所取組織切片中同時應(yīng)有抗原陽性和陰性區(qū)，以形成自身對照。細(xì)胞壞死后，不僅抗原彌散或消失，而且常引起非特異著色，干擾觀察，因此取材時應(yīng)盡可能避開壞死區(qū)。1、取材的特殊要求及注意事項(續(xù))· 避免擠壓：取材時組織受擠壓可使邊緣部細(xì)胞形態(tài)改變并加深非特異著色，因而取材時應(yīng)使用鋒利的刀刃； 鑷取組織動作要輕； 經(jīng)窺鏡直接鉗取的組織往往有過度擠壓，觀察結(jié)果時應(yīng)有所考慮。2、固定及常用的固定液· 取材后的組織需立刻投于固定劑中 固定使組織

19、和細(xì)胞的蛋白質(zhì)凝固，終止內(nèi)源性或外源性酶反應(yīng)，防止組織自溶或異溶，以保持原有結(jié)構(gòu)和形態(tài)； 對免疫組化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或彌散。· 常用固定液：固定劑品種很多，但大多屬于醛類和醇類。其固定原理不同，各有優(yōu)缺點。 醛類（常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）醇類（常用乙醇） 其它 （丙酮）(1) 醛類·甲醛(福爾馬林)應(yīng)用最廣 原理：形成分子間的交聯(lián)，影響蛋白構(gòu)型而使之固定。 優(yōu)點：形態(tài)結(jié)構(gòu)保存好，且穿透性強，組織收縮少。 缺點：· 甲醛放置過久可氧化為甲酸，使溶液pH降低，影響染色；·醛基與抗原蛋白的氨基交聯(lián)形成羧甲基，使抗原決定簇的三維構(gòu)象出

20、現(xiàn)空間障礙；· 分子間交聯(lián)形成的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)可能部分或完全掩蓋某些抗原決定簇，使之不能充分暴露?？稍斐杉訇幮缘娜旧Y(jié)果。 注意事項：· 縮短固定時間，降低固定溫度(4°C)，為此組織塊不宜過厚。· 改用中性緩沖福爾馬林，以pH值7.27.4 0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液配制成10%甲醛固定液，減少固定液pH的變化。· 固定后充分水洗以減少分子間交聯(lián)。· 切片在作免疫組化染色前，先經(jīng)預(yù)處理使抗原再現(xiàn)(抗原修復(fù))。· 戊二醛： 穿透性強，微細(xì)結(jié)構(gòu)保存好，但對抗原有一定影響，常與其他固定劑聯(lián)合用作免疫電鏡固定液。·多聚甲

21、醛(常用4%)： 可用于免疫電鏡；也可用于免疫熒光染色。· 主要檢測組織內(nèi)一些性能嬌弱的抗原特別是細(xì)胞表面抗原，例如各類淋巴細(xì)胸分化決定簇(CD)、主要組織相容性抗原等。(2) 醇類· 最常用的醇類固定劑是乙醇。 其固定作用：使細(xì)胞內(nèi)蛋白、糖類發(fā)生沉淀。 優(yōu)點：穿透性強、抗原性保存好。 缺點：·脫水性強，易引起組織收縮、變硬，影響切片質(zhì)量，因而乙醇固定時間不宜過長(2h內(nèi))。· 乙醇使蛋白變性的作用輕，固定后可再溶解；染色過程中，溫育時間長，抗原可流失而減弱反應(yīng)強度。(3) 其它固定劑·丙酮： 對抗原性的保存好，但脫水性更強，較少 用于組織標(biāo)本

22、，但細(xì)胞爬片常用丙酮固定。3、抗原修復(fù)原因· 常規(guī)的石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定，結(jié)果使得： 抗原性物質(zhì)形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇； 蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。· 要求：在染色時，需要先進行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài)。3、抗原修復(fù)方法· 化學(xué)方法· 加熱方法 水浴加熱法 微波照射法 高壓加熱法 酸水解法(1) 化學(xué)方法· 主要是通過一些酶的作用，使抗原決定簇暴露。常用的酶有：胰蛋白酶、胃蛋白酶等。胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%0.1%，消化時間為37°C，104

23、0min，主要用于細(xì)胞內(nèi)抗原的顯示； 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.1%0.4%，消化時間為37°C、30180min，主要用于細(xì)胞間質(zhì)抗原的顯示。· 例如：Laminin、CollagenIV(2) 水浴加熱法· 將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，加熱至沸騰，持續(xù)1015分鐘。 優(yōu)點：操作簡單、經(jīng)濟，適用于所有的實驗室， 缺點：對封閉牢固的抗原決定簇暴露不理想。(3) 微波照射法· 將玻片放入裝有抗原修復(fù)液的容器中，置微波爐加熱至95以上，持續(xù)l015分鐘，冷卻后，按免疫組化染色步驟進行。· 此方法由于微波場內(nèi)極性分子、離子高速運動，撞擊交聯(lián)的

24、網(wǎng)鏈，使抗原異常的構(gòu)想恢復(fù)正常，且因分子運動產(chǎn)熱、效率高、時間短，對抗原再現(xiàn)效果好。(4) 高壓加熱法暴露抗原· 將玻片浸入抗原修復(fù)液內(nèi)，置高壓鍋中高壓23min，可取得極好的效果。· 由于高壓下受熱均勻，特別使用于大批量標(biāo)本的染色。(1) 酸水解法· 酸水解可使交聯(lián)斷裂、暴露抗原。· 將玻片浸入1mol/L HCl 溶液中，室溫作用20min(溫度升高，作用時間縮短)。· 此法能增強特異性染色，降低背景，但需注意水解過度將破壞抗原性及形態(tài)結(jié)構(gòu)。加熱法的注意事項· 達(dá)到規(guī)定的溫度(9295°C以上)；· 維持一定的

25、時間；· 避免切片干涸 (抗原可能完全丟失)；· 加熱后必須經(jīng)過室溫自然冷卻2030分鐘，使未折疊的蛋白分子鏈恢復(fù)天然構(gòu)型；· 修復(fù)液： 最常用的是pH6.0的0.01mol/L的枸櫞酸鹽緩沖液； 最新研究表明堿性修復(fù)液更有效，推薦使用1mM的EDTA緩沖液(pH8.0)。4、載玻片的處理·抗原修復(fù)過程中，由于高溫、高壓等諸多固素的影響，極易造成脫片。為防止脫片，常用粘附劑處理載玻片。 新載玻片上有油污，要用洗液浸泡1224h，自來水沖洗后再用蒸餾水清洗；用綢布擦干或烤箱烤干。清潔的載玻片再用粘附劑處理。· 常用的粘附劑有：APES（3-氨丙基

26、三乙氧基硅烷） Polv-L-Lysine（多聚賴氨酸） 鉻明膠溶液APES(3-aminopropyltriethoxysilane)3-氨丙基三乙氧基硅烷· 現(xiàn)用現(xiàn)配。用純丙酮或甲醇配制2%APES(v/v);· 將洗凈的玻片浸于此液中2030秒鐘；· 取出稍停片刻，再入純丙酮酮溶液洗去未結(jié)合的APES，置通風(fēng)櫥中晾干或60°C烤箱烤干。Polv-L-Lysine (多聚賴氨酸)· 將清潔玻片浸于100mg/ml(10%w/v)的多聚賴氨酸溶液中(去離子水稀釋)，37°C放置30min，然后60°C烤箱烘烤1h或室溫過夜

27、干燥。裝盒備用。鉻明膠溶液·試劑：鉻明礬(chrome alum) 0.25g明膠(gelatine) 2.5g蒸餾水500ml· 先將鉻明礬溶解于40°C少量蒸餾水中，再加入明膠及蒸餾水，可在70 °C水浴中使明膠溶化，攪拌均勻后，即可使用。如有殘渣，可過濾后再用。· 用時稍加溶化，切片浸入23min，過夜晾干。冰凍切片· 冰凍切片是指將組織在冷凍狀態(tài)下直接切片。· 在切片前組織不經(jīng)過任何化學(xué)藥品處理或加熱過程。 縮短了制片時間 抗原性不受損失· 對穩(wěn)定性差的抗原，如淋巴細(xì)胞表面抗原尤其適合。· 組織凍

28、結(jié)過程中，細(xì)胞內(nèi)、外的水分會形成冰晶，凍結(jié)的速度愈慢，冰晶顆粒愈大，可嚴(yán)重影響組織、細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。因此制備凍塊時要求低溫、速凍。1、冰凍組織塊的常用方法· 液氮中冰凍：組織投入液氮中 (一196°C)中1020sec；· 干冰中加入丙酮(或異戊烷)，液體立即氣化起泡，溫度降至一70°C ，將組織投入，若在干冰丙酮中置一盛有異戊烷的容器，組織投入該容器內(nèi)結(jié)凍則更好； 上述組織在速凍時應(yīng)浸埋于OCT包埋劑或甲基纖維素糊狀液內(nèi)，以保護組織。 制成凍塊后若需保存，應(yīng)以鋁箔或塑料薄膜封包，貯存于-70 °C冰箱。2、切片· 供免疫組化用的冰凍

29、切片同樣要求附貼平整，并有連續(xù)性。·載玻片也應(yīng)清潔無油污，但一般無需涂抹粘附劑；· 切片時，使用恒溫冷凍切片機，在箱內(nèi)溫度-25 °C 。切片厚度一般為48mm。3、切片后處理· 切好的冰凍切片，室溫下自然晾干12h后，入4°C丙酮固定10min，待干燥后作免疫組化染色或封存于-20。· 冰凍切片由于切片技術(shù)要求較高，不易得到連續(xù)性很好的切片，其形態(tài)結(jié)構(gòu)亦不如石蠟片，且凍塊和切片不便于長期貯存，因此冰凍切片的應(yīng)用受限。組織印片· 將潔凈載玻片輕壓于已暴露病灶的新鮮組織切面，細(xì)胞即粘附于玻片，晾干后浸入冷丙酮或醋酸-乙醇固定1

30、0min，自然干燥后染片或-20保存。細(xì)胞培養(yǎng)片(細(xì)胞爬片)· 貼壁細(xì)胞培養(yǎng)時，置蓋片于培養(yǎng)瓶中，使細(xì)胞在蓋片上生長，達(dá)適當(dāng)密度后取出固定(丙酮-20°C固定1020min)，再進行免疫染色。 蓋片的處理方法同載玻片的處理，但泡酸時間2h即可。 為了防止細(xì)胞脫片，可用多聚賴氨酸處理。細(xì)胞涂片· 大多數(shù)細(xì)胞涂片由細(xì)胞懸液制成，包括： 血液、尿液、腦脊液； 體腔積液； 組織穿刺吸取，如骨髓、淋巴結(jié)或其他實質(zhì)性組織懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞或貼壁細(xì)胞經(jīng)消化后形成的懸液。細(xì)胞涂片 (續(xù))· 細(xì)胞涂片的方法： 手涂法· 將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)到106/ml左右，可直接涂于載

31、玻片上，但要均勻、不重疊。· 圖片范圍應(yīng)小于1cm直徑，以節(jié)約試劑。 涂片機涂片法· 將細(xì)胞樣品制成2×1056/ml 細(xì)胞懸液，吸取50100ml (12×1045cells) 加入涂片機內(nèi)，1000rpm離心2min后細(xì)胞就均勻分布于玻片上。根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法、免疫酶標(biāo)法、親和組織化學(xué)法。免疫熒光法【原理】· 用于免疫熒光的標(biāo)記物是小分子的熒光素，可標(biāo)記抗體或抗原； 免疫熒光技術(shù)·熒光素經(jīng)某種特定波長的光照射激發(fā)后，能發(fā)射出一種比激發(fā)光波波長更長而且能量較低的熒光，籍此可作定位觀察或示蹤；· 借助于熒光顯微鏡

32、進行觀察。1、常用的熒光素· (1) 異硫氰酸熒光素 (Fluorescein Isothiocyanate, FITC)· (2) 四甲基異硫氰酸羅丹明 (Tetramethyl Rhodamine Isothiocyanate, TRITC)· (3) 四乙基羅丹明 (RB200)· (4) 碘化丙啶 (propidium iodide, PI)(1) 異硫氰酸熒光素(FITC)· 易溶于水和乙醇。· 最大吸收光譜為490495nm，最大發(fā)射光譜為 520530nm呈翠綠色熒光，分子量 389.4。· 在堿性條件下，F(xiàn)I

33、TC的異硫氰酸基在水溶液中與Ig的自由氨基形成共價鍵，成為標(biāo)記的熒光抗體。一個lgG分子上最多能標(biāo)記1520個FITC分子。(2) 四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)· 最大吸收光譜550nm，最大發(fā)射光譜620nm，呈紅色熒光，分子量為444。· 與蛋白質(zhì)結(jié)合的方式同F(xiàn)ITC。(3) 四乙基羅丹明(RB200)· 不溶于水，易溶于乙醇和丙酮。· 最大吸收光譜為570nm，最大發(fā)射光譜為595600nm，呈橙紅色熒光，分子量為580。· RB200在五氯化磷(PCl5)作用下轉(zhuǎn)變成磺酰氯(SO2Cl)，在堿性條件下，易與蛋白質(zhì)的賴氨酸e-氨基反

34、應(yīng)而標(biāo)記在蛋白分子上。(4) 碘化丙啶(PI)· 是常用的DNA熒光標(biāo)記探針，可作為FITC的胞核對比染色。· PI可嵌入到雙鏈DNA和RNA堿基對中并與之結(jié)合，但對堿基無特異性選擇。· 最大吸收光譜是493nm，最大發(fā)射光譜是630nm，呈紅色熒光。2、熒光抗體的保存· 一要防止抗體失活，二要保持熒光素不脫落和不受激發(fā)猝滅。 一般認(rèn)為04°C可保存12年，-20°C可保存34年。 要小量分裝，防止反復(fù)凍融。 保存前需加防腐劑 (濃度為1:500010000的硫柳汞或1:10005000疊氮化鈉) 。3、免疫熒光的染色方法·

35、免疫熒光染色法常用的有 直接法 間接法j原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng) (用來檢測未知抗原)。k直接免疫熒光法的操作步驟· 標(biāo)本的處理： 細(xì)胞涂片、細(xì)胞爬片浸入冷丙酮或4%的多聚甲醛固定10min，然后用0.0lM PBST (含0.l%TritonX-100 pH 7.4) 漂洗5min × 3/次； 石蠟切片經(jīng)脫蠟、梯度酒精脫水后，進行抗原修復(fù)，然后用0.01M PBST漂洗5min × 3/次；· 2%BSA或10%BSA37°C濕盒內(nèi)封閉30min· 抗體染色： 在標(biāo)本片上滴加適當(dāng)稀釋的熒光標(biāo)記抗體(1:

36、8或1:16稀釋)，放在濕盒中，37°C孵育30min；k直接免疫熒光法的操作步驟(續(xù))· 0.0lmol/L PBS(pH 7.4) 漂洗5min × 3/次，不時震蕩(洗去多余游離的熒光素標(biāo)記的抗體)。· 緩沖甘油封片 分析純無熒光的甘油9份+ pH 9.2，0.2M碳酸鹽緩沖液1份配制。· 鏡檢：在熒光顯微鏡下觀察。· 優(yōu)點：方法簡便、特異性高，非特異性熒光染色少。· 缺點：敏感性偏低；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。若檢測多種抗原需制備多種相應(yīng)的熒光標(biāo)記抗體。m直接免疫熒光法的注意事項· 對熒光標(biāo)

37、記的抗體的稀釋：要保證抗體的蛋白有一定的濃度；· 一般稀釋度不應(yīng)超過1:20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察。m直接免疫熒光法的注意事項 (續(xù))· 染色溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化； 染色時間：從10 min到數(shù)小時，一般30 min； 染色溫度：多采用室溫(25°C)，高于37°C可加強染色效果，但對不耐熱的抗原(如流行性乙型腦炎病毒)可采用0-2°C的低溫，延長染色時間。 低溫染色過夜較37 °C 30 min效果好的多。m直接免疫熒光法的注意事項 (續(xù))· 試驗時需設(shè)置下列對照： 自

38、發(fā)熒光對照(空白對照)：標(biāo)本加0.01mol/L，pH7.4的PBS代替一抗。 陽性對照：用已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體。特異性對照(抑制試驗)：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。· 若標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強熒光，則為特異性陽性染色。m直接免疫熒光法的注意事項 (續(xù))· 一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象；· 經(jīng)熒光染色的標(biāo)本最好在當(dāng)天觀察，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降。(2) 間接法又稱為熒光抗-抗體法j 需要兩種抗體參與，即一抗和二抗(熒光素標(biāo)記)。一抗對標(biāo)本中的

39、抗原來說起抗體的作用，但對熒光標(biāo)記的二抗來說又起著抗原作用。 可用來檢測標(biāo)本中未知抗原，也可檢測血清中未知抗體。k間接免疫熒光法操作步驟· 標(biāo)本的處理及非特異染色的封閉同直接法；· 一抗染色： 加未標(biāo)記的特異性抗體(通常1:100稀釋，用0.01MpH7.4的PBS稀釋)，37°C作用30min或4°C過夜。· 0.01M PBST漂洗5min×3次(震蕩漂洗)；k間接免疫熒光法操作步驟(續(xù))· 加熒光標(biāo)記的二抗抗體，37°C濕盒避光作用30min。· 0.01M PBST避光漂洗5min×3次

40、(例如包上錫紙，在搖床上漂洗)；· 甘油緩沖液封片· 鏡檢· 優(yōu)點：敏感性較高，比直接法高10倍左右；制備一種熒光標(biāo)記抗體，可應(yīng)用于多種一抗；· 缺點：是參加反應(yīng)的因子較多，產(chǎn)生非特異性染色的機會增多。m間接免疫熒光法的注意事項· 熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察，或于4保存4h，時間過長 ，會使熒光減弱。· 每次試驗時 ，需設(shè)置以下三種對照： 陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物 熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物m間接免疫熒光法的注意事項(續(xù))· 標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤，避免干燥。

41、· 一抗和二抗應(yīng)始終保持在標(biāo)本片上，避免因放置不平使液體流失，從而造成非特異性熒光染色。免疫酶酶標(biāo)法【原理】· 以酶作為標(biāo)記物與外加底物作用后產(chǎn)生不溶性色素，沉積于抗原和抗體反應(yīng)的部位；· 酶降解底物的量與色澤濃度成正比。可反映被測定的抗原或抗體的量。1、常用的標(biāo)記酶及其顯色底物·辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)及底物· 堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, AP)及底物(1) 辣根過氧化物酶(HRP)及底物· HRP是應(yīng)用最廣的一種酶，來源于植物辣根，由無色的酶蛋白和深棕色的

42、鐵葉琳結(jié)合而成，分子量約40kDa，穩(wěn)定性好；· 底物為過氧化物和供氫體(DH2) 過氧化物：常用過氧化氫和過氧化氫尿素。供氫體：多用無色的還原型染料，通過反應(yīng)生成有色的氧化 型染料，最常用的供氫體是DAB。DAB (二氨基聯(lián)苯胺)· DAB本身無色，反應(yīng)后呈棕色，不溶于水，不易褪色，電子密度高，最為常用。· 目前已經(jīng)有商品化的試劑盒，使用起來非常方便。(2) 堿性磷酸酶(AP)及底物· AP為磷酸酯的水解酶，可通過兩種反應(yīng)顯色： 偶氮偶聯(lián)反應(yīng)，底物為a-萘酚磷酸鹽，經(jīng)水解后得a-萘酚，與重氮化合物如堅牢藍(lán)(fast blue)或堅牢紅(fast red

43、)形成不溶性沉淀，分別呈蘭色或紅色。 靛藍(lán)-四唑反應(yīng)：底物為溴氯羥吲哚磷酸鹽(5-bromo-4-chloro-3-indodyl phosphate,BCIP)，經(jīng)酶水解并氧化形成靛藍(lán)，而氮藍(lán)四唑(NBT)在此氧化過程中被還原成不溶性紫蘭色沉淀。2、常用的免疫酶染色方法· 又分為以下兩種方法： 酶標(biāo)抗體法· 直接法· 間接法 非標(biāo)記抗體酶法· 酶橋法· PAP法(1) 酶標(biāo)抗體法· 通過共價鍵將酶結(jié)合在抗體上，制成酶標(biāo)抗體，與標(biāo)本進行反應(yīng)后，再用酶組化法將酶顯色，使之生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，以供光鏡和電鏡觀察。

44、 優(yōu)點：切片能長期保存、反復(fù)觀察，適于鏡下半定量分析。 缺點：酶與抗體形成的共價鍵，可損害抗體和酶的活性；易產(chǎn)生非特異染色。(1) 酶標(biāo)抗體法直接法· 將酶直接標(biāo)記在一抗上，然后直接與相應(yīng)抗原特異地結(jié)合。形成抗原-抗體-酶復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。(1) 酶標(biāo)抗體法間接法· 將酶標(biāo)記在二抗上，先將一抗與相應(yīng)的抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，再用二抗(酶標(biāo)抗體)與復(fù)合物中的特異抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，最后用底物顯色劑顯色。酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟· 標(biāo)本準(zhǔn)備： 石蠟脫蠟至水； 冰凍切片浸入4°C丙酮固定10min，0.01M PBST漂

45、洗，5min×3； 細(xì)胞爬片先用PBS洗，然后4°C丙酮固定10min，再0.01M PBST漂洗，5min×3；· 石蠟切片需要進行抗原修復(fù)，其它標(biāo)本則不用；(2) 酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟(續(xù))· 封閉內(nèi)源性過氧化物酶：3%H2O2-甲醇溶液室溫孵育510min (濕盒內(nèi)) ；· 0.01M PBST漂洗，5min×3；· 510%正常山羊血清(0.01M PBS稀釋)封閉，室溫孵育30min (濕盒內(nèi)) ；· 傾去血清勿洗，加1%BSA(PBST配制)稀釋的一抗， 37°C孵育60min 或4°C過夜(濕盒內(nèi))；(2) 酶標(biāo)抗體間接法的操作步驟(續(xù))· 0.01M PBST漂洗，5min×3；· 加HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育lh或37°C 30min ；· 加0.01%H2O20.05%DAB顯色 (顯色液應(yīng)新鮮配置)；· 經(jīng)PBS漂洗3次后，梯度酒精脫水，二甲苯透明，明膠甘油封片，顯微鏡觀察。(2) 非標(biāo)記抗體酶法酶橋法· 首先用酶免疫