1、Then how to get siRNA?siRNA制備方法In vitro、化學合成、體外轉錄、酶切長鏈dsRNAIn vivo、載體表達siRNA、PCR合成siRNA表達元件A. A. 化學合成法化學合成法方法簡單、快速，需要時間短；獲得的siRNA純度高適用于短期體外實驗研究，尤其適用于需要單一siRNA序列的研究siRNA可進行標記需要進行大規(guī)模的篩選來確定單一的siRNA序列不適用于長期研究不適用于siRNA序列的篩選 選擇以AA開頭的19-21nt長的序列 靶定序列從起始密碼子下游75-100個nt處開始，到終止密碼子上游75-100nt處結束 選擇 2-4個靶定序列，以篩選特

2、異性最好的進行實驗 選擇的序列中 GC含量在 30-70%,最好在50%左右,在一排序列中避免出現(xiàn)3 個以上G。 若需要發(fā)卡結構，發(fā)卡部分長度一般為6-9nt，有文獻報道9nt效果較好. 最后,選擇的DNA 片段經BLAST 查詢,應與其它人類基因無同源性 設定適當?shù)膶φ?siRNA序列設計注意事項設置適當?shù)膕iRNA對照1) 與靶定與靶定siRNAsiRNA有相同的堿基組成，但排列完全不同，有相同的堿基組成，但排列完全不同，且不與其它基因由同源性且不與其它基因由同源性 AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG SN(G4,C5,A5,T6) ATTCGTGCTCAATGCAATCG NSN(

3、G4,C5,A5,T6)2)1-2堿基錯配的堿基錯配的 siRNAsiRNA對照對照 (1-2nt) AGCCTTAGCTTAAGTCCTAG AGCCTTAGTTTAAATCCTAG T T 和和 A A錯配錯配siRNA序列設計根據(jù)文獻報道，使用確定的siRNA序列許多網站提供siRNA設計軟件，只需輸入靶定基因序列，即可提供候選siRNA序列；比如Ambion公司,武漢晶賽B、體外轉錄合成短的體外轉錄合成短的siRNAsiRNAT7 RNA 聚和酶體外轉錄DNA，直接產生小片斷的siRNA，快速、靈活，適用于siRNA序列的篩選以及化學合成siRNA價格昂貴時siRNA可進行標記可重復性

4、差，不適用于長期研究和需要大量單一siRNA序列的研究 C、 使用使用Dicer酶切長片斷酶切長片斷dsRNA產生產生siRNA使用T7RNA聚和酶體外轉錄,產生長片斷的dsRNA，然后使用Dicer酶消化，產生短的siRNA產生的為siRNA的混合物，因此沉默效果較好該方法方便、簡單、需要時間短，容易操作適用于快速而便宜的表型功能缺失研究可對產生的siRNA進行標記不適用于長期研究和需要確定的單一siRNA的研究可能產生非特異性的基因沉默、含有T啟動子的PCR產物的合成、長的dsRNA的轉錄合成、 siRNA的消化，和純化D1D1、質粒載體合成質粒載體合成siRNAsiRNA（非病毒非病毒）

5、 首先合成具有發(fā)卡結構的DNA，構建到含有U6 或者H1 啟動子的質粒中，質粒轉入細胞，在啟動子操縱下轉錄生成siRNA; 該方法可在胞內持續(xù)產生siRNA，適用于長期研究; 價格較貴，構建過程相對復雜，只適用于體外研究D2D2、病毒載體合成病毒載體合成siRNAsiRNA siRNA在病毒骨架上進行轉錄，適用于原代細胞、可進行體內和體外實驗；有可能進行穩(wěn)定轉染 使用腺病毒載體：可進行體內實驗，轉染效率高 使用逆轉錄病毒載體：可進行整合，導致穩(wěn)定轉染 構建過程復雜，成功率相對較低，而且具有安全隱患E E、PCRPCR方法構建方法構建siRNAsiRNA表達元件（表達元件（SEC)SEC) PC

6、R方法構建含有特定啟動子和終止子以及靶定DNA序列的表達元件 轉染到胞內后，在啟動子操縱下，siRNA表達 方法簡單，無需構建載體； 適用于siRNA序列篩選，及載體克隆前啟動子的篩選 不適用于長期研究常用的發(fā)卡結構中Loop環(huán)的長度和序列化學合成體外轉錄核糖核酸酶消化dsRNASiRNA表達載體PCR表達元件需要條件 21-mer RNA片斷29-mer DNA 片斷轉錄模板 (200-800 bp側翼含有T7 啟動子)55-60-mer DNA 片斷50-mer DNA 片斷需要的時間4天-2周24 小時加上DNA 準備時間 1天加上轉錄模板準備時間5天加上DNA 準備時間 6小時加上DN

7、A準備時間工作量少或無中等中等高中等是否需要檢測優(yōu)化 siRNA 序列需要需要需要不需要需要可否進行標記（以分析轉染效率和顯微鏡定位可以可以可以不可以不可以轉染的容易程度好好好很容易很容易可否篩選（即抗生素篩選）不可以不可以不可以可以不可以可否用于長期研究不不不帶有選擇性標志則可以不能否大規(guī)模合成可以受限受限可以受限能否檢測群體的轉染效率不不不可以不每個基因需要的費用（不包括勞力）高中等抵中等中等干擾的應用干擾的應用（Application） 基因功能的研究（Gene function） 基因治療（Gene therapy） -遺傳性疾?。℉ereditary disease） -病毒感染引起

8、的疾?。―iseases by virus）：如艾滋病，肝炎等 -腫瘤（Tumor） 新藥開發(fā)（Development of new drugs） RNAiRNAi 技術的應用技術的應用: : 基因治療基因治療 疾病疾病/病毒病毒靶基因靶基因細胞細胞細胞來源細胞來源效果效果HIV-1CCR5CD4+TT細胞阻止病毒侵入HIV-1Tsg101293T腎臟阻止病毒出芽HIV-1Tat，RTJurkat白血病抵制病毒繁殖C型肝炎病毒NS3,NS5BHuh7肝癌抵制病毒繁殖脊髓灰質炎病毒polHeLa S3子宮癌抵制病毒繁殖勞氏肉瘤病毒Fusion proteinA549肺癌抵制病毒繁殖乳頭狀瘤病毒E

9、6，E7CasKi子宮頸癌細胞凋亡流感病毒CapsidMDCK上皮細胞抵制病毒繁殖乳腺癌P53MCF-1乳癌阻止細胞停在期胰腺癌K-RAS V-12CAPAN-1胰腺癌抑制腫瘤形成大腸癌K-rasSW480大腸癌抑制細胞增殖白血病Bcr/ablK562白血病抑制bcr/abr細胞 RNA干擾最初的研究多局限于植物、線蟲和果蠅等的研究.對哺乳動物的研究則是在最近幾年,對其發(fā)生機制有了初步了解后才開始的. RNA干擾技術在實驗動物體內的研究目前在國內還鮮有報道,在國外也不多見.目前的研究多局限于細胞水平.如何將siRNA安全有效地導入動物體內,即載體的選擇,是制約RNA干擾技術在實驗動物體內應用的

10、瓶頸之一.但RNAi誘人的應用前景仍吸引著許多科學家, 研究小組,實驗室以及國際知名的生物公司投入到這放方面的研究.國內外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢國內外研究現(xiàn)狀和發(fā)展趨勢 如Brummelkamp 等建立了突變體K-ras V12 的siRNA 表達系統(tǒng)pSUPER-K-ras V12 ,通過轉染人胰腺癌CAPAN-1 細胞系,觀察其抑制內源K-ras V12 的表達,結果顯示pSUPER-K-ras V12能顯著降低K-ras V12的mRNA 表達水平,而對照組cyclin D1 的表達水平沒有影響;構建突變體K-ras V12 的siRNA病毒載體轉染CAPAN-1 細胞能明顯抑制細胞克隆的生

11、長,以及阻止裸鼠腫瘤的形成,而對照組細胞生長良好并產生克隆,體內裸鼠實驗5周內均長出腫瘤,因此證明了siRNA 具有明顯的特異性和抑制腫瘤生長作用,為腫瘤研究提供了新的技術方案21 。 Wilda 等22 設計了M-BCR-ABL 融合蛋白的dsRNA ,通過轉染白血病細胞株K562 細胞,研究對白血病細胞的殺滅作用。結果表明siRNA 能明顯降低bcr-abl 的mRNA 表達水平,減少bcr-abl 癌基因的表達,導致白血病細胞的凋亡. Cioca 等 23 報道采用siRNA 轉染人髓白血病細胞系HL-60 ,U937 ,THP21 ,K562 ,觀察其對內源性c-raf和bcl-2 基

12、因的抑制作用以及對腫瘤細胞分化、凋亡和對藥物足葉乙甙(etoposide) 和柔紅霉素( daunorubicin) 敏感性的影響。結果表明,siRNA 能減少raf-1 和bcl-2 蛋白的表達; c-raf 的siRNA 能阻止佛波醇酯( TPA) 誘導的單核細胞分化; c-raf 和bcl-2 的siRNA能誘導人髓細胞性白血病細胞HL-60,U937,THP-1凋亡;siRNA 聯(lián)合抗癌藥物足葉乙甙和柔紅霉素能明顯提高藥物的作用效果。因此作者認為RNAi 可用于人髓細胞性白血病的研究和治療,并克服癌細胞對抗癌藥物產生的抗性,最終提高人髓性白血病的化療效果。 盡管RNAi 應用于腫瘤的研究才剛剛起步,但科學家已經認識到其在腫瘤研究中的巨大潛力。應用RNAi 技術抑制腫瘤細胞中過量表達的一些凋亡抑制劑如bcl-2 、c-myc 等,將有利于癌癥的治療。因此可以認為RN