1、分子生物學筆記第一章基因的結構第一節(jié)基因和基因組一、基因(gene)是合成一種功能蛋白或RNA分子所必須的全部DNA序列一個典型的真核基因包括編碼序列外顯子(exon)插入外顯子之間的非編碼序列內(nèi)合子(intron)5'-端和3'-端非翻譯區(qū)(UTR) 調控序列(可位于上述三種序列中)絕大多數(shù)真核基因是斷裂基因(split-gene)，外顯子不連續(xù)。二、基因組(genome)一特定生物體的整套(單倍體)遺傳物質的總和，基因組的大小用全部DNA的堿基對總數(shù)表示。人基因組3X1 09(30億bp)，共編碼約10萬個基因。每種真核生物的單倍體基因組中的全部DNA量稱為C值，與進化的復

2、雜性并不一致(C-value Paradox)。人類基因組計劃（human genome project, HGP）基因組學（genomics）,結構基因組學（structural genomics）和功能基因組學（functional genomics）。蛋白質組（proteome）和蛋白質組學（proteomics）第二節(jié)真核生物基因組一、真核生物基因組的特點：，真核基因組DNA在細胞核內(nèi)處于以核小體為基本單位的染色體結構中真核基因組中，編碼序列只占整個基因組的很小部分(23)，三、基因家族(gene family)一組功能相似且核苷酸序列具有同源性的基因可能由某一共同祖先基因(ances

3、tral gene)經(jīng)重復(duplication)和突變產(chǎn)生。基因家族的特點：基因家族的成員可以串聯(lián)排列在一起，形成基因簇(gene cluster)或串聯(lián)重復基因(tandemly repeated genes)，如rRNA、tRNA和組蛋白的基因；有些基因家族的成員也可位于不同的染色體上，如珠蛋白基因；有些成員不產(chǎn)生有功能的基因產(chǎn)物，這種基因稱為假基因 (Pseudogene)a1表示與a1相似的假基因四、超基因家族(Supergene family ，Superfamily)由基因家族和單基因組成的大基因家族，結構上有程度不等的同源性，但功能不同第四節(jié)細菌和病毒基因組一、細菌基因組的特

4、點。1功能相關的幾個結構基因往往串聯(lián)在起，受它們上游的共同調控區(qū)控制，形成操縱子結構，2結構基因中沒有內(nèi)含子，也無重疊現(xiàn)象。3細菌DNA大部分為編碼序列。二、病毒基因組的特點1每種病毒只有一種核酸，或者DNA，或者RNA；2病毒核酸大小差別很大，3X103一3X106bp；3除逆病毒外，所有病毒基因都是單拷貝的。4大部份病毒核酸是由一條雙鏈或單鏈分子(RNA或DNA)，僅少數(shù)RNA病毒由幾個核酸片段組成 5真核病毒基因有內(nèi)含子，而噬菌體（感染細菌的病毒）基因中無內(nèi)含子6有重疊基因第五節(jié)染色質和染色體(二)組蛋白(histone)：一類小的帶有豐富正電荷<富含Lys，Arg)的核蛋白，與D

5、NA有高親和力(二)端粒(telomere)：真核生物線狀染色體分子末端的DNA區(qū)域端粒DNA的特點：1、由富含G的簡單串聯(lián)重復序列組成(長達數(shù)kb)人的端粒DNA重復序列：TTAGGC。2、端粒的末端都有一條12-16堿基的單鏈3端突出。端粒的作用：防止DNA末端降解，保證染色體的穩(wěn)定性和功能（三）、復制原點第二章 DNA的復制、修復和重組第一節(jié) DNA的復制(DNA Replication)一、DNA復制的基本特性1. 半保留性(Semi-Conservative)2. 雙向復制(一般)復制起始點(origin)+兩側復制叉=復制單位(復制子, Replicon)3.半不連續(xù)性(Semi-

6、discontinuous)前導鏈(leading strand)-連續(xù)合成，隨從鏈(Lagging Strand)-不連續(xù),由崗崎片段(okazaki fragment)連接而成.二、DNA復制必需的成份(真核生物)1.染色體DNA復制必需三種核苷酸序列復制起點著絲粒端粒.2 RNA引物(RNA Primer)一般8-14nt.帶游離3'-OH末端.3.參加DNA復制的主要酶和蛋白質 DNA聚合酶(DNA Polymerase)真核DNA復制的主要酶DNA Pol a/.功能:從5'-3'方向延伸與模板互補的子代鏈.引發(fā)酶(Primase)與其他多種蛋白組成多蛋白復合

7、體-引發(fā)體(Primosome).催化RNA引物合成和復制起始.DNA連接酶(DNA Ligase)催化一個雙鏈DNA的5'磷酸與另一雙鏈DNA的3'-OH形成磷酸二酯鍵.DNA解鏈酶(DNA Helicase),打開DNA雙鏈.增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen.PCNA)輔助催化前導鏈合成.端粒酶(Telomerase)末端復制問題。端粒酶負責染色體末端(端粒)復制,是由RNA和蛋白質組成的核糖核蛋白.其中的RNA成分是端粒復制的模板.(因此端粒是逆轉錄酶)作用:維持端粒長度.端粒酶活性可用基于PCR的“TRAP”（Telo

8、merase repeat amplification protocol）法測定端粒與細胞壽命。端粒、端粒酶與腫瘤的關系：絕大多數(shù)惡性腫瘤具有端粒酶活性但端?？s短，但也有約5%的腫瘤無端粒酶活性且端粒較長。端粒酶作為新的腫瘤標志和腫瘤治療靶點.第二節(jié) DNA修復（DNA repair）DNA修復是維持基因組完整性的重要機制，在保護基因組避免發(fā)生可能導致腫瘤或遺傳疾病的突變中起關鍵的作用。引起DNA損傷的因素：1、細胞內(nèi)源性損傷因素：DNA復制錯誤；自發(fā)損傷包括堿基互變異構、堿基脫氨（CU、AI）和堿基丟失等；氧化代謝副產(chǎn)物如活性氧物質（Reactive oxygen species，ROS）的

9、攻擊等。2、環(huán)境中的損傷因素：輻射（含紫外線、X射線）產(chǎn)生胸腺嘧啶二聚體；化學致癌物（氧化脫氨，烷化劑或代謝活化物如苯并芘、黃曲霉素等產(chǎn)生堿基加合物）一、堿基切除修復(Base excision repair、BER)該途徑中最關鍵的是必須通過一種糖苷酶(glycosylase)先除去變異堿基(如被氧化、烷基化或脫氨的堿基)，該糖苷酶催化連接損傷堿基與脫氧核糖之間的糖苷鍵水解，釋放游離堿基并在DNA中產(chǎn)生一個去堿基位點，然后由去嘌呤去嘧啶(AP)核酸內(nèi)切酶、DNA聚合酶和DNA連接酶等利用相對的一條正常鏈為模板進行修補合成。BER是修復內(nèi)源性DNA損傷(自發(fā)水解、烷基化和活性氧攻擊)的主要途徑

10、，因此對于降低自發(fā)突變的頻率、防止腫瘤發(fā)生有重要作用。二、核苷酸切除修復(Nucleotide excision repair，NER)首先由多聚體復合物識別損傷，再在損傷的兩側進行切除。隨著DNA鏈被解開，包含損傷的單鏈片段釋放出來，留下的缺口由DNA聚合酶填補，DNA連接酶封閉。該途徑包括20種以上蛋白，可以修復紫外輻射誘導的環(huán)丁烷嘧啶二聚體(CPD)和(64)光產(chǎn)物(64)PPs)，以及一些化學物質產(chǎn)生的大加合物。NER可再分為二條子途徑：(1)全基因組修復(Global Genomic repair，GGR)途徑：修復整個基因組內(nèi)的損傷，其效率取決于損傷的化學特性、損傷部位的DNA序列

11、和染色質結構。(2)轉錄藕聯(lián)修復(Trancsriptioncoupled repair，TCR，)：特異地修復基因組中具有轉錄活性(即表達)的基因的被轉錄DNA鏈上的損傷，該途徑的特點是依賴RNA聚合酶II催化的轉錄，其中的一些蛋白是普通轉錄因子TFIIH 的亞基。三、錯配修復(Mismatch repair)負責修復DNA復制過程中由于錯誤摻入而產(chǎn)生的錯配。四、重組修復(Recomhinant repair)修復DNA的兩條鏈均受損傷的部位的雙鏈斷裂或鏈間交連。第三節(jié)重組(recombination)重組的本質是基因的重排或交換.即2個DNA分子間或一個DNA分子的不同部位間,通過斷裂和重

12、接,交換DNA片段從而改變基因的組合和序列.一.同源重組(Homologous recombination)指DNA同源序列間的重組,常發(fā)生于兩個較長的同源DNA片段或同源染色體之間。可通過同源重組將外源基因定位整合到細胞基因組中.二.轉座(transposition)可移動的DNA元件(mobile DNA elements)-轉座元件(Transposable element).它是指那些可在DNA分子內(nèi)或DNA分子間轉移的DNA片段.轉座元件的轉移過程-轉座轉座的特點:1.轉座后原來位置的轉座元件序列仍然保留,但同時又把新合成的DNA 復本插入到另外一個位點.2.轉座過程需要轉座酶(tr

13、ansposase).它催化斷裂和重接兩步連續(xù)的過程(需要M2+)3.轉座元件插入位置的兩茶有3-12bp的正向重復序列(靶序列),它是由于轉座酶錯位切割DNA造成的.這種短正向重復序列是存在轉座元件的特征.轉座元件的分類轉座子(transposon):通過DNA復制而轉移的轉座元件.逆轉座子(retroposon)或返座子,通過RNA階段實現(xiàn)轉移的轉座元件 (DNA RNA DNA插入新位點)轉座的遺傳效應-導致基因重排、插入、缺失。第三章基因表達的調控基因表達：DNAmRNA蛋白質的遺傳信息傳遞過程第一節(jié)基因的活化基因的“開關”-染色質的活化一、活性染色質的結構二、活性染色質的結構特點(一

14、)DNaseI敏感性轉錄活性(或有潛在轉錄活性)的染色質對DNase I更敏感(二)組蛋白H3的CyS110上巰基暴露，三、活性染色質結構的形成(二)、組蛋白修飾。（三)HMG蛋白結合HMG（high mobility group)蛋白高遷移率蛋白, 如HMG14/HMG17.與核小體核心顆粒結合，有利轉錄。四、DNA甲基化與基因表達(一)、真核生物基因組DNA的甲基化(Methylation)(二)DNA甲基化的轉錄抑制作用。持家基因(housekeeping gene)：是指對所有類型組織細胞在任何時候都需要其表達的基因，通常都是維持細胞基本生存所必須的基因，其表達常保持在固定的水平。又稱

15、為組成性基因(Constitutive gene)。（三）甲基化與基因組印跡基因組印跡(genomic imprinting)：指基因表達活性只局限于來自雙親之一的基因版本。被印跡(imprinted)的基因第二節(jié)轉錄水平的調控一、真核基因轉錄基本條件：特異性基因轉錄的基本條件包括：啟動子(特別是核心啟動子)轉錄模板(轉錄起始點（+1）-終止點)RNA Pol普通轉錄因子(GTFs)(一)啟動子(promoter)與基因轉錄啟動有關的一組DNA序列，一般位于RNA poII轉錄起始點上游100-200bp以內(nèi)，其功能是決定轉錄的起始點和調控轉錄頻率啟動子區(qū)域包括核心啟動子和啟動子上游近側序列：

16、1、核心啟動子(core promoter)是決定轉錄起始位置的關鍵序列，也是普通轉錄因子TFD的結合位點，TATA盒(TATA box) 位于轉錄起始點上游-25-30bp起始子(initiator，Inr) Inr是與轉錄起始位點重疊的短的較保守序列注：不是所有基因都含有TATA盒或Inr序列有的只有其中之一，有的兩者都無這些核心啟動子的序列和它們之間的間隔多變2、上游啟動子元件(Upstream Promoter element，UPE)位于較上游(-30一-110bp)，能較強影響轉錄起始的頻率，如CAAT 盒和GC盒其中GC盒是轉錄因子SPl的結合位點。(二)RNA聚合酶負責真核生物

17、蛋白編碼基因的轉錄(產(chǎn)物mRNA)，有7-10個亞基，最大亞基的羧基末端結構域(CTD)具有7個氨基酸(Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser -Pro-Set)的重復序列，其中有多個磷酸化位點CTD磷酸化對調控基因轉錄有重要作用(三)基礎轉錄因子(basal transcription factor)真核基因轉錄除RNA聚合酶外還需要許多蛋白因子轉錄因子參加，其中一些轉錄因子是RNA聚合酶轉錄起始必需的，并且可以維持基礎水平的轉錄，因此稱為基礎轉錄因子或普通轉錄因子(general transcription factor)1RNA聚合酶 II的普通轉錄因子(TF II)包括TFIID,TF

18、B,TFIIF，TFIIE，TFIIH，TFIIA等TFIID是由TATA盒結合蛋白(TATA binding protein，TBP)和8種TBP協(xié)同因子(TBP associated factor，TAF)組成的復合物，TFIID可識別和結合核心啟動子(TATA盒和Inr)；TFB的C端與TFIID和DNA的復合物結合，N-端與TFF協(xié)同作用募集RNA聚合酶II，再加上TFIIE,TFIIH形成完整的轉錄復合物TFIIH有蛋白激酶活性，可使RNA Pol最大亞基CTD磷酸化，使轉錄起始過渡到轉錄延伸 TFIIA有助于TFIID與TATA盒核心啟動子結合2、TAF的作用TFIID中包括至少8

19、種TBP協(xié)同因子,分子量為30250kD,分別命名為TAF-30250TAF150識別起始子(1nr)序列TAF是基因轉錄調控的輔助因子，它的作用是通過與多種轉錄調控因子（激活物或阻遏物）的轉錄調控結構域結合，而介導轉錄激活或抑制。二、基因轉錄的順式調控元件順式調控元件(cis-regulating element)是指對基因表達有調控活性的DNA序列，其活性只影響與其自身同處于一個DNA分子上的基因(二)增強子(enhancer)能顯著提高基因轉錄效率的一類順式調控元件（其核心序列常為8-12bp)增強子的作用特點： 1能(通過啟動子)提高同一條鏈上的靶基因轉錄速率；2增強子對同源基因或異源

20、基因同樣有效；3增強子的位置可在基因5-上游、基因內(nèi)或3下游序列中；4自身沒有5-或3-方向性；5增強子可遠離轉錄起始點(最多30Kb)；6增強子一般具有組織或細胞特異性(三)負調控元件沉寂子負調控元件是能抑制基因表達的序列如沉寂子(silencer)(四)其它順式調控元件1應答元件(responsive elements)真核細胞中對某些特定的環(huán)境作出應答的基因，常具有相同的順式元件應答元件應答元件能被在一些特定情況下表達的調控因子識別(又稱為可誘導的順式調控元件反式作用因子)。2轉座元件對基因表達的調控，。三、基因轉錄的反式作用因子轉錄水平的調控主要是通過與多種DNA元件結合的蛋白因子來實

21、現(xiàn)反式作用因子(trans-acting factor)是通過識別和結合順式調控元件的核心序列而調控靶基因轉錄效率的一組蛋白質反式作用因子對基因表達的調控可正(激話)可負(阻遏)第三節(jié)轉錄后加工在細胞核內(nèi)對基因產(chǎn)物(mRNA前體)進行各種修飾、剪接和編輯，使編碼蛋白質的外顯子部分連接成為一個連續(xù)的開放讀框(open reading frame，ORF)的過程稱為轉錄后加工一、mRNA前體加工的分子機制 -核內(nèi)mRNA前體異質性核RNA(heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)，hnRNA與蛋白質結合形成核異質性核糖核蛋白(hnRNP), mRNA前體的加工在hnRNP上

22、進行選擇性剪接(alternative splicing)：在mRNA前體的剪接過程中，參加剪接的外顯子可以不按其線性次序剪接，內(nèi)含子也可以不被切除而保留，即一個外顯子或內(nèi)含子是否出現(xiàn)在成熟mRNA中是可以選擇的，這種剪接方式稱為選擇性剪接。此外，不同的啟動子或不同的poly(A)加尾位點的選擇，也可看作選擇性剪接選擇性剪接的主要方式。由來自一個基因的mRNA前體因選擇性剪接而產(chǎn)生多種mRNA，并翻譯出的不同蛋白質，稱為同源異構體(isoform)>5%的人基因可在不同的組織或生理狀態(tài)下，通過選擇性剪接產(chǎn)生不同的蛋白質異構體，這是造成真接生物高度異質性的基礎。第四節(jié)翻譯水平調控四、翻譯后

23、修飾1、氨基酸側鏈的共價修飾：乙?；?、磷酸化、糖基化（N-、O-）；2、蛋白質前體的切割和成熟。Proproteinprotein.例：胰島素的成熟。五、蛋白質的分泌和胞內(nèi)定位信號肽：作為蛋白質定位信號的短肽序列，指導蛋白質運輸?shù)秸_位置，定位結束后通常被特異的信號肽酶切除。第四章原癌基因與抑癌基因第一節(jié)概述病毒致癌作用，病毒癌基因Viral oncogene，V-onc).。細咆癌基因(cellular oncogene ，c-onc)或原癌基因(protoncogene)正常細胞中與v-onc同源的基因，抑癌基因(tumor suppressor gene)：是指由于其存在和表達而抑制細胞

24、癌變的基因。原癌基因與抑癌基因生物學性質差異：1功能：抑癌基因在細胞生長中起負調節(jié)作用，抑制增殖、促進分化成熟與衰老，或引導多余細胞進入程序性細胞死亡(PCD)，原癌基因的作用則相反2遺傳方式：原癌基因是顯性的，激活后即參與促進細胞增殖和癌變過程，而抑癌基因為隱性，只有發(fā)生純合失活時才失去抑癌功能3突變的細胞類型：抑癌基因突變不僅可發(fā)生在體細胞中，也可發(fā)生在生殖系(germ 1ine)細胞中，并通過其遺傳突變，而原癌基因只在體細胞中產(chǎn)生突變。第二節(jié)原癌基因原癌基因是細胞的正?；?，其表達產(chǎn)物對細胞的生理功能極其重要，只有當原癌基因發(fā)生結構改變或過度表達時，才有可能導致細胞癌變。一、原癌基因表達

25、的特點：l、正常細胞中原癌基因的表達水平一般較低，而且是受生長調節(jié)的，其表達主要有三個特點：具有分化階段特異性；細胞類型特異性；細胞周期特異性。2、腫瘤細胞中原癌基因的表達有2個比較普遍和突出的特點：一些原癌基因具有高水平的表達或過度表達原癌基因的表達程度和次序發(fā)生紊亂，不再具有細胞周期特異性。3、細胞分化與原癌基因表達在分化過程中，與分化有關的原癌基因表達增加，而與細胞增殖有關的原癌基因表達受抑制。二，原癌基因的結構改變與其表達激活(一)點突變(二)染色體易位染色體易位(translocation)：是染色體的一部分因斷裂脫離，并與其它染色體聯(lián)結的重排過程。(三)基因擴增即基因拷貝數(shù)增加(四

26、)LTR插入LTR是逆轉錄病毒基因組兩端的長末端重復，其中含有強啟動子序列。三、原癌基因產(chǎn)物的功能大多數(shù)原癌基因編碼的蛋白質都是復雜的細胞信號轉導網(wǎng)絡中的成份，在信號轉導途徑中有著重要的作用原癌基因產(chǎn)物可作為：1、生長因子，如sis(PDGF-)，fgf家族(int-2，csf-1等)2、生長因子受體(質膜)：具酪氨酸蛋白激酶活性，如neu，ht，met，erbB，trk，fms，ros-1等。 3、非受體酪氨酸蛋白激酶(質膜胞質)如src家族：src，syn，fyn，abl，lck，ros，yes，fes，ret等4、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(胞質)：如raf，raf-1，mos，pim-1，5

27、、G蛋白(質膜內(nèi)側)，具GTP結合作用和GTP酶活性，如ras家族中的 H-ras，K-ras，N-ras，以及mel和ral等，6核內(nèi)DNA結合蛋白(轉錄因子)如myc家族，fos家族，Jun家族，ets家族，rel，erb A(類固醇激素受體)第三節(jié)抑癌基因一、抑癌基因失活與雜合性丟失抑癌基因為隱性癌基因，只有發(fā)生純合失活時才對腫瘤形成起作用，通常的表現(xiàn)為抑癌基因的一個等位基因丟失，面另一個存留的等位基因發(fā)生突變(點突變、微缺失，重排等)，等位基因丟失常伴有抑癌基因相鄰區(qū)域的雜合性丟失(Loss of heterozygosity，LOH)，LOS指腫瘤中特定染色體上某種DNA多態(tài)性標志(

28、如RFLP，VNTR、STR或SSCP等)的等位基因片段在同一患者中由正常組織基因組中的兩種變?yōu)橐环N，即等位基因型由雜合子變?yōu)榧兒献?。LOH是腫瘤細胞中部分染色體區(qū)域缺失的表現(xiàn)。二、抑癌基因產(chǎn)物的功能巳知的腫瘤抑制基因及其蛋白產(chǎn)物功能基因相關癌產(chǎn)物胞內(nèi)定位作用p53 Rb WT-1 APC DCC NF l RET VHL P16(MTS-1) WAFCIPl BRCAl 肺癌、乳腺癌等（>51種）視網(wǎng)膜細胞瘤等wilm腫瘤結腸癌結腸癌神經(jīng)纖維瘤甲狀腺癌腎癌黑素瘤等(多種) 多種乳腺癌、宮頸癌等核胞質？粘附分子GTP酶激活劑受體酪氨酸激酶轉錄延伸因子 CDK抑制劑 CDK抑制劑轉錄因子抑

29、癌基因p53人P53基因定位：17P13，11個外顯子編碼393個氨基酸。p53基因突變：存在于一半以上的人腫瘤中，多為點突變，主要發(fā)生于外顯子5-8,如肝癌中的249號密碼子第3堿基GT ,與黃曲霉素B1有關。 P53蛋白結構和功能：P53蛋白為核內(nèi)轉錄因子，包括核心區(qū)的DNA結合域；N端轉錄激活域；C端介導寡聚體化的結構域。1、 P53的中央域識別和結合一個10bp的啟動子序列，可激活轉錄（通過N-端的反式激活域）。P53突變大多發(fā)生于中央DNA結合域。2、 P53也可結合DNA損傷時產(chǎn)生的單鏈區(qū)域。3、 P53是四聚體，寡聚化需要C-端域4、P53激活cki p21, 后者抑制細胞周期于

30、G1期. 5、 p53 激活與負責輻身損傷的修復蛋白GADD45，維持基因組穩(wěn)定性。 6、P53誘導凋亡的機制尚不清楚。 7、正常情況下p53以低水平存在，半衰期短。DNA損傷穩(wěn)定P53并增加其轉錄活性8、Mdm2使p53不穩(wěn)定，易被降解，并能直接抑制其反式激活活性（Mdm2是癌基因）第五章信號轉導細胞外信號通過與細胞表面的受體相互作用轉變?yōu)榘麅?nèi)信號并在細胞內(nèi)傳遞的過程稱為信號轉導(signal transduction)跨膜信號轉導過程包括：1，胞外信號被質膜上的特異性受體蛋白識別，受體被活化；2，通過胞內(nèi)信號轉導物(蛋白激酶，第二信使等) 的相互作用傳遞信號；3，信號導致效應物蛋白的活化，

31、引發(fā)細胞應答（如激活核內(nèi)轉錄因子，調節(jié)基因表達）。第一節(jié)胞內(nèi)信使細胞內(nèi)信使(intracellular messenger)是具有信息傳遞作用的一些小分子，也稱為第二信使(second messengers)。一、cAMP環(huán)磷酸腺苷) ，生成：腺苷酸環(huán)化酶催化ATP生成cAMP;代謝： cAMP磷酸二酯酶水解cAMP產(chǎn)生5-AMP功能：，激活蛋白激酶A抑制蛋白磷酸酯酶二、cGMP(環(huán)磷酸鳥苷)生成酶：鳥苷酸環(huán)化酶代謝酶：cGMP磷酸二酯酶功能：激活蛋白激酶G 調控細胞膜離子通道三、三磷酸肌醇（inositol triphosphate,IP3）和甘油二酯（diacyglycerol, DAG）

32、G-蛋白偶聯(lián)受體激活磷脂酶C生成IP3及DAG功能：1、IP3：開放胞內(nèi)鈣庫，激活Ca2+途徑2、DAD：在Ca2+和磷脂酰絲氨酸存在下，激活蛋白激酶C，四、鈣離子細胞內(nèi)鈣離子主要貯存于胞內(nèi)鈣庫(如肌細胞的肌漿網(wǎng)，SR)和線粒體中。細胞質膜兩鍘Ca2+跨膜梯度：細胞外液>>胞漿胞漿內(nèi)Ca2+的調節(jié)一通過(質膜和鈣庫膜上的)鈣離子通道(進入)和鈣泵(出)，鈣通道開放的條件：質膜或鈣庫膜去極化(可興奮細胞)；成IP3介導鈣庫膜上鈣通道開放(任何細胞)鈣泵激活線粒體鈣泵的作用Ca2+功能：與鈣調蛋白(calmodulin, CaM)結合形成Ca2+CaM復合物：激活腺苷酸環(huán)化酶和磷酸二酯

33、酶，激活Ca2+CaM依賴蛋白激酶鈣通道阻斷劑及其臨床應用。五、一氧化氮(NO)NO合成酶催化L-精氨酸生成NO和胍氨酸NO合成酶(NOS)分類：神經(jīng)元型(nNOS)內(nèi)皮細胞型(ecNOS)誘導型（iNOS)功能：激活烏苷酸環(huán)化酶，刺激cGMP合成。NO的生理病理作用第二節(jié)蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶蛋白激酶(Protein kinase，PK)催化蛋白質的含羥基氨基酸(絲蘇和酪)的側鏈羥基形成磷酸酯（ATP的磷酸基轉移至氧）蛋白質磷酸酯酶(Protein phosphatase，PPase)催化磷酸蛋白的磷酸酯鍵水解而去磷酸化。細胞內(nèi)任何一種蛋白質的磷酸化狀態(tài)是由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶的兩種相反酶

34、活性之間的平衡決定的。蛋白質可逆磷酸化的調節(jié)在信號轉導過程中有重要作用，是細胞生命活動的調控中心。一、信號轉導過程中的蛋白激酶一)絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(SerThr PK)是一大類特異地催化蛋白質的絲氨酸和蘇氨酸殘基磷酸化的激酶家族，參與多種信號轉導過程。1、蛋白激酶A（PKA)-cAMP依賴性蛋白激酶.PKA由兩個催化亞基C和兩個調節(jié)亞基R所構成PKA參與cAMP介導的轉錄水平調控。PKA的其它(下游)底物：多種代謝相關酶核內(nèi)組蛋白和非組蛋白膜蛋白等。2、蛋白激酶C(PKC)-Ca2+激活的磷脂依賴性蛋白激酶調節(jié)：可被Ca2+，DAG和磷脂酰絲氨酸激活TPA(佛波酯)也可激活PKC分子由N-

35、端的調節(jié)區(qū)和C端催化區(qū)（親水的蛋白激酶結構域）所組成。 PKC有多種亞型(>12種)PKC可激活：受體，如EGFR，胰島素受體，細胞因子受體等。細胞骨架蛋白如Map，Tau膜蛋白，如Na+-H+交換蛋白，Ca2+-ATP酶等核蛋白轉錄因子，起始因子等，信號轉導物如鳥苷酸環(huán)化酶，Raf-1等3、Ca2+鈣調蛋白依賴性蛋白激酶(Cam-PK)Cam-PKII是一種多功能的蛋白激酶4。cGMP依賴的蛋白激酶(PKG)功能：調節(jié)胞內(nèi)鈣離子5，DNA依賴的蛋白激酶(DNA-PK)調節(jié)：結合游離DNA片段后被激活，底物：核內(nèi)DNA結合蛋白和轉錄因子，如SPl，F(xiàn)osJun，Myc和P53，作用：參與

36、DNA修復和重組,通過激活TF調節(jié)基因表達;參與細胞周期的關卡機制(Checkpoint).6絲裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase， MAPK)調節(jié)：MAPK激酶-MAPKK（MEK）。下游底物：核內(nèi)轉錄因子如Myc，Jun，Ets及其它胞內(nèi)蛋白(二)酪氨酸蛋白激酶（Tyrosine protein kinase，TPK)特異地催化蛋白質的酪氨酸殘基磷酸化，蛋白質酪氨酸磷酸化在細胞生長，分化和轉化的調節(jié)中起重要作用。1、經(jīng)典的src激酶家族原癌基因c-src蛋白產(chǎn)物Src是一種酪氨酸蛋白激酶，它有三個基本結構域：從C-端至N-端依次為SH1、S

37、H2，SH3(SH=src homolog)。SHl結構域：具酪氨酸激酶活性，SH2結構域：能識別并結合含磷酸化酪氨酸的短序列，SH結構域：通過脯氨酸和疏水性氨基酸殘基與靶蛋白結合，Src家族：包括原癌基因src，yes，lyn，fyn，lck，blk，fgr，bcd和yrk編碼蛋白，它們都有TPK活性共同參與細胞轉化的信號轉導過程SH2結構域在信號轉導途徑中的重要作用：由于含SH2結構域的信號轉導分子可以識別和結合其他含磷酸化酪氨酸的蛋白，因此，通過蛋白質的酪氨酸磷酸化去磷酸化調節(jié)可以決定信號轉導分子的結合與解離，從而導致信號的開啟或關閉。2、JAK嫩酶家族JAK(Janus kinase)

38、激酶家族包括Jakl，Jak2，Jak3，Tyk2等，Jak激酶具有一個TPK結構域和一個激酶樣結構域，它們與Src的TPk激酶結構域具有同源性，但JaK激酶沒有SH2，SH3結構域；Jak激酶主要參與細胞因子的信號轉導二、蛋白磷酸酯酶對磷酸化的調節(jié)(一)、絲氨酸蘇氨酸蛋白磷酸酯酶這類酶選擇性地作用于含磷酸絲氨酸或磷酸蘇氨酸殘基的肽鏈，使之脫去磷酸基團并改變生物活性主要成員：PPl，PP2A，PP2B，PP2C，等PP2A，催化亞基及其功能 (二)酪氨酸蛋白磷酸酯酶(PTPase)蛋白質酪氨酸磷酸酯酶催化磷酸化酪氨酸殘基的去磷酸化反應，與相應的酪氨酸蛋白激酶共同調節(jié)蛋白質的磷酸化水平，PTPa

39、se家族可分為2類：1、胞質型(非受體型)：小的可溶性蛋白，只有一個催化結構域，特點是合有SH2 domain，如PTPlC，PTPlB等，2受體型(PTPR)，是大的跨膜蛋白，特點是有2個串聯(lián)的胞漿催化結構域，如白細胞共同抗原CD45，PTPlC(存在于造血細胞)：N端2個串聯(lián)重復的SH2結構域識別TyrP，并指導蛋白與蛋白結合)，C端為磷酸酯酶催化結構域。Jak可作為PTP1C底物PTPase基因可能是腫瘤抑制基因第三節(jié)細胞膜受體介導的信號轉導一、受體的分類質膜受體和胞內(nèi)受體（胞漿或核受體，如類固醇激素受體）膜受體的分類：（一）G蛋白耦聯(lián)受體家族又稱為七次胯膜受體家族，特點是具有七段跨膜的

40、螺旋結構，本身無酶活性，胞漿側肽鏈上有磷酸化位點，受體功能受磷酸化調節(jié)。成員；腎上腺素受體、多巴受體、視紫紅蛋白等。（二）酪氨酸激酶受體家族受體本身胞漿側有蛋白酪氨酸激酶活性，并且胞漿側肽鏈上有自身磷酸化位點，配基結合后受體形成二聚體，二聚體中每個亞基可以磷酸化對應的另一亞基，從而啟動信號轉導。這類受體主要包括多數(shù)生長因子受體(如IGF，EGF，PDGF，NGF，SCF，HGF等生長因子的受體)，除胰島素受體外，這類受體均由一條肽鏈組成(三)細胞因子受體家族這類受體本身無TPK活性，但其胞漿側近膜部分有非受體酪氨酸蛋白激酶的結合位點，在配基與受體結合后，受體發(fā)生二聚化或寡聚化，并激活Jak族蛋

41、白酪氨酸激酶此類受體包括細胞因子受體以及生長激素、促乳素等受體細胞因子(cytokine)：是淋巴細胞和造血細胞產(chǎn)生的一大類對細胞生長和分化有調節(jié)作用的蛋白因子。包括干擾素(IFN)、白細胞介素(IL)、白血病抑制因子（LIF）、抑癌素M等 (但IL-8R為G蛋白藕聯(lián)受體)(四)離子通道受體與配基結合后構成離子通道，主要存在于神經(jīng)突觸，如乙酰膽堿(ACH)，5-HT受體等。二、G蛋白介導的信號轉導。G蛋白藕聯(lián)受體的信號轉導途徑由三部分組成：細胞膜受體；G蛋白效應物(effector)，其中G蛋白將受體與效應物藕聯(lián)G-蛋白(G-protein)是一種鳥苷酸結合蛋白，是由、和三個亞基組成的異三聚體

42、，多，和亞基總是緊密結合在一起作為一個功能單位GG亞基可分為Gs,Go,Gi,Gq等，其活性可被霍亂毒素（CT）或百日咳毒素（PT）修飾。G-蛋白介導的信號轉導的機制：G-蛋白循環(huán)。G-pr的效應物：離子通道、腺苷酸環(huán)化酶、磷脂酶C、磷脂酶A2等三、RAS-MAPK信號轉導途徑1、途徑中的信號分子Ras：具鳥苷酸結合活性的一種胞漿蛋白（與G-蛋白不同）Ras活性與其結合的鳥苷酸有關。鳥苷酸交換因子（SOS）RasGDP RasGTP(失活) GTP酶激活蛋白（GAP）（激活）接頭蛋白：生長因子受體結合蛋白Grb2，通過其SH2結構域與Tyr被磷酸化的受體結合，同時通過其SH3域與具有pro富集

43、區(qū)的SOS結合，并通過SOS活化Ras蛋白2、Ras-MAPK途徑：生長因子生長因子受體(具酪氨酸激酶活性)含有SH2結構域的接頭蛋白(如Grb2)鳥苷酸交換因子SOSRas-GTPRaflMAPKK（MEK）MAPK轉錄因子調節(jié)基因表達。3Ras-MAPK途徑的調節(jié)Ras-MAPK途徑中信號轉導分子的突變(如Ras)和表達量的改變其他信號轉導途徑的影響cAMP-PKA：抑制Raf-1； PKC：活化Rafl，四、Jak-stat途徑：STAT：信號轉導物與轉錄激活劑（signal transducer and activators of transcription）至少6種，分子量84-11

44、3KD，含一個SH2結構域(羧端)，一個SH3樣結構域，并合有DNA結合域，Stat的激活依賴通過磷酸化形成二聚體Jak-Stat途徑：細胞因子受體(二聚體化)JakStatStat二聚體(活化)易位至核，影響轉錄第六章細胞周期及其調節(jié)細胞增殖(cell proliferation)與細胞生長分裂周期第一節(jié)細胞周期一、細胞周期(cell cycle)：指親代細胞分裂結束到子代細胞分裂結束所經(jīng)歷的過程，這個過程所需的時間稱為細胞周期時間。細胞周期由G1、S、G2和M期組成(G1、S和G2期又合稱為分裂間期)。G1(Gap1)期：DNA合成前期(復制前期)，從上次有絲分裂完成到DNA復制之前的階段

45、;S期：DNA復制期;G2期：合成后期，從DNA復制完成至有絲分裂開始;M期：有絲分裂(Mitosis)期，包括核分裂和胞質分裂M期結束后形成兩個新的子細胞。注：不同細胞的細胞周期時間不同，一般S+G2+M期較恒定，而G1期變化較大，因而它決定了細胞周期時間的長短；G1期細胞有三種可能的趨向：1)進入S期(即進入細胞周期)2)處于靜止期即Co期(在一定條件下可重新進入增殖周期)，3)分化、衰老、凋亡。二、細胞周期中各時相的主要生化事件細胞周期中每期都有其特殊功能，其中S期的DNA復制和M期細胞核的有絲分裂是細胞周期中2個最關鍵的過程：1、G1期：為DNA復制作準備，G1早期合成各種RNA、結構

46、蛋白和酶等，細胞通過一個限制點(restriction point，R點)后在G1后期合成DNA復制有關的蛋白和酶。在開始合成DNA之前有一個關卡(checkpoint)，檢查染色體DNA是否有損傷，如有則先要進行修復。2、S期：DNA(包栝端粒)的復制及組蛋白合成、核小體裝配S期后每一染色體復制成2個染色單體 SG2期關卡：檢查DNA復制是否完成3、G2期：為有絲分裂作準備有RNA和非組蛋白合成。4、M期：染色體濃縮一仿錘體形成染色體分離并移向細胞兩端染色體解聚，形成兩個新核胞質分裂。第二節(jié)周期素依賴性蛋白激晦與細胞周期調節(jié)周期素依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase

47、s，CDKs) 通過使特異底物磷酸化調節(jié)細胞周期進行，其活性依賴與周期素(cyclin)結合形成復合物。一、周期素-周期素依賴性蛋白激酶周期素家族和周期素依賴蛋白激酶(CDK)家族細胞周期的不同時相表達不同cyc-CDK，這些cyc-CDK復合物在各不同的細胞周期過渡點起作用1、G1期cyc-CDKG1期表達的周期素為周期素C、D（D1、D2、D3)和E。D族周期素主要與CDK4(以及CDK2、CDK5、CDK6)結合成活性的蛋白激酶復合物，對細胞通過R點(G0G1過渡有重要作用。E族周期素與CDK2形成復合物。cycE-CDK2復合物調控G1S過渡。2、S期和M朔cyc-CDKscycA-C

48、DK2：驅動細胞通過S期cycB-cdc2：驅動G2M期過渡(cdc2或p34cdc2即CDKl)二、周期素依賴性蛋白激酶抑制物 (cyclin-dependent kinase inhibitor，CKIs)CKls通過與CDKs結合而抑制激酶活性，在細胞周期中起負調控作用CKIs一般按其分子量命名：CKls的分類：1、KipCip家族：包括三種結構相關蛋白P21、P27、P57、特點是能結合并抑制大多數(shù)cyc-CDK復合物；P21(其它名稱WAFICIPl等)：可被P53誘導轉錄，P21抑制cycDl-CDK4和cycE-CDK2，參與(由于DNA損傷誘導的)P53介導的細胞周期停止。P2

49、7參與血清去除、接觸抑制和TGF-等導致的細胞周期停止。2、 INK4蛋白家族，包括四種相關蛋P16、P15、P18、P19特點：INK4是cycD-CDK4和cycD-CDK6的專一性抑制劑，并與CDK單體結合。P15可能參與TGF-誘導的細胞周期停止于G1期，三、細胞周期調節(jié)因子與腫瘤 1、cyclin和CDKs可能為原癌基因，其突變或過度表達可導致細胞轉化。2、CKI可能是廣譜的腫瘤抑制基因，其失活導致CDK活性失調。p16(MTSl)在腫瘤中突變特點及其作用。第三節(jié)細胞周期的其它調節(jié)機制生長因子、生長抑制因子、原癌基因(如，myc)和抑癌基因產(chǎn)物、蛋白質可逆磷酸化、蛋白水解等對細胞周期

50、也有重要調節(jié)作用。一、pRB ，抑癌蛋白，分子量106KD，其活性與磷峻化狀態(tài)有關：G0及G1早期：pRB非磷酸化，與轉錄因子E2F-1結合(抑制轉錄)GF等cycD-CDK4及cycE-CDK2激活pRb磷酸化(失活)釋放E2FDNA合成基因表達。二、p53抑癌蛋白(轉錄因子)，在細胞周期中的作用：參與細胞周期關卡-DNA損傷檢查的關鍵蛋白(通過誘導P21轉錄使細胞周期停止于G1期)。三、細胞因子對細胞周期的作用1生長因子在細胞通鄖點中的作用GFGFRRas-MAPKfos/jun等基因表達cycD-CDK4等表達pRB磷酸化E2F釋放進入細胞增殖周期。2、生長抑制因子與細胞周期停止TGF-

51、使細胞周期停止于G1期。四、泛有素(Ubiquitin，Ub)介導的蛋白水解作用周期素，周期素依賴性蛋白激酶抑制劑(如P27)以及其它細胞周期調節(jié)蛋白均可通過泛有素介導的蛋白酶水解作用降解，這些按精確的時間順序進行的蛋白水解反應在細胞周期的不同階段起著重要的調節(jié)作用。第七章細胞凋亡凋亡（apoptosis）, 程序性細胞死亡（programmed cell death,PCD）生理性細胞死亡。第一節(jié)細胞凋亡概論一、凋亡與壞死apoptosis vs. necrosis）凋亡是一個受細胞主動調節(jié)的自身消化過程，凋亡細胞的特征形態(tài)學改變使其可被其它細胞吞噬而不泄露胞質內(nèi)容物，不會引起炎癥反應。壞死

52、是由于物理損傷、缺血或細菌毒素等引起的破壞性細胞死亡過程，細胞內(nèi)容物的釋放導致局部炎癥反應。二、凋亡的生理功能1、維持組織穩(wěn)態(tài)平衡（homeostasis）,通過干細胞分裂產(chǎn)生新細胞的同時，選擇性地除去那些損傷的或老的或多余的細胞。2、清除不需要的免疫細胞。3、神經(jīng)元發(fā)育4、個體發(fā)育三、凋亡細胞的形態(tài)學和生化特征1、細胞皺縮（shrinkage）2、質膜出泡（blebbing）3、染色質濃縮4、 DNA裂解：核小體DNA ladder5、磷脂酰絲氨酸由質膜內(nèi)側翻轉至外側6、凋亡小體的釋放第二節(jié)凋亡的分子機制一、細胞表面死亡受體細胞死亡受體家族的成員是一類跨膜蛋白，它們均含有一個與配基結合的胞外

53、結構域；一個跨膜域和一個轉導胞外信號進入胞內(nèi)的胞內(nèi)結構域(死亡結構域)。這此受體（如Fas、TNF受體）同它們的配基結合后被激活并導致細胞凋亡。二、Bcl-2家族對B細胞淋巴瘤的研究發(fā)現(xiàn)bcl-2是一種抗凋亡基因，進一步研究證明它與ced-9基因同源。1、由于8：14染色體易位所致的bcl-2過度表達抑制腫瘤細胞凋亡。2、與Bcl-2功能相似的有Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, and A1等，構成一個大的蛋白家族。3、這些蛋白表達于線粒體、內(nèi)質網(wǎng)和核被膜的外膜，Bcl-2及其高度同源物Bcl-xl 保護線粒體膜的完整性。Bax-促進凋亡的Bcl-2家族成員：1、與Bcl-2結合的蛋

54、白，包括Bax、Bak、Bik 、Bid、 Bim和HRK。2、當在細胞中過度表達時促進凋亡，其殺細胞活性可被Bcl-2類蛋白拮抗。3、抗凋亡蛋白和促進凋亡的蛋白如Bcl-2和Bax間的比率決定細胞對凋亡信號的敏感性。4、 Bax可被 P53上調，這是DNA損傷時P53誘導細胞死亡的一種方式。5、這些蛋白通常存在于其它胞內(nèi)隔室如胞漿中，在凋亡時移動進入線粒體。三、Caspase 蛋白酶-實施凋亡的蛋白酶1、這是一族半胱氨酸（cysteine）催化的在天冬氨酸（aspartic acid）處裂解底物的蛋白酶（半胱天冬酶）2、所有Caspase先以無活性的酶原（procaspase）的形式合成，其

55、激活過程包括：二聚體化caspase自身序列裂解成小亞其和大亞基除去prodomain。3、最早發(fā)現(xiàn)的 caspase 為IL-1轉化酶 (ICE=caspase-1) 它將 pro-IL-1 前體裂解成其活性形式。 ICE 基因轉染導致細胞凋亡。此過程可被一種牛痘病毒蛋白CrmA抑制。 CrmA抑制所有caspase。4、已知該家族成員超過12個，雖然其中某些 caspase參與白細胞介素的成熟，但大多數(shù)作用是激活凋亡。通過在特異性caspase裂解位點(e.g. DEV D)處裂解靶蛋白，而使蛋白激活或失活，從而影響凋亡。例如：a. DFF -DNA fragmentation facto

56、r- cleavage of an inhibitory subunit activates this nuclease which cuts the DNA into a distinct ladder-likepattern and for chromatin to condense.b. PARP -Poly-ADP ribose polymerase, a DNA repair enzyme inactivated by caspasesc. nuclear lamin - causes nucleus to lose its structural integrity after cl

57、eavaged. cytoskeletal proteins - cleavage causes membrane blebbing5、殺傷 T-淋巴細胞可釋放顆粒酶（granzymes）于靶細胞上而誘導凋亡： granzymes 裂解和激活 caspase誘導凋亡6、現(xiàn)正研究能完全阻斷凋亡的caspases抑制劑，看它們是否能保護中風、心梗和器官移植中細胞免于因缺血誘導的凋亡四、 Caspases的激活（一）死亡受體被其配基激活1、TNF 受體與稱為TRADD的蛋白結合，后者再結合 FADD； Fas直接與 FADD結合。2、 FADD結合caspase-8 (又稱為 FLICE),它含有死亡結構域同時又具蛋白酶催化活性3、活化的caspase-8激活凋亡途徑.；4、 .觸發(fā)激活的關鍵是受體的寡聚化。在 Fas系統(tǒng)中 FasL與