1、1常規(guī)真核表達與鑒定常規(guī)真核表達與鑒定 劉宗梁 2019-10-192一、真核表達概述；二、常用真核表達系統(tǒng)；三、細胞與載體的選擇；四、哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染；五、Western-blot法對轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測； 六、間接免疫熒光法IFA對轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測；七、Cell-ELISA法對轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測；主要內(nèi)容：3一、真核表達概述1、真核表達：經(jīng)過將外源基因克隆到真核表達載體，并轉(zhuǎn)染到適宜的真核細胞中，最終獲得外源目的基因高效表達產(chǎn)物的過程。2、真核表達相對原核表達的優(yōu)點：在真核表達的過程中，可以經(jīng)過真核細胞的轉(zhuǎn)錄及修飾系統(tǒng)如甲基化修飾、糖基化修飾、乙?；揎椀全@得具有一定構(gòu)象和生物活性的蛋白質(zhì)；表達目的蛋

2、白更的構(gòu)造及生物學功能如免疫原性等更接近于該蛋白的天然形狀，且表達的蛋白不存在原核表達中“包涵體這一景象。3、真核表達缺陷：表達量低，普通難以耐久表達。4二、常用真核表達系統(tǒng)1、畢赤酵母表達體系：酵母細胞表達系統(tǒng)蛋白表達程度高，消費本錢低，但純化難度大。2、慢病毒表達系統(tǒng)：商品化的慢病毒表達系統(tǒng)如Lenti-X在病毒包裝時獲得VSV-G泛嗜性重組慢病毒，經(jīng)過膜質(zhì)偶聯(lián)和膜質(zhì)交融的方式感染靶細胞，可感染幾乎一切類型的哺乳動物細胞。3、哺乳動物細胞表達體系：對蛋白的加工與修飾與酵母及昆蟲表達系統(tǒng)完全不同，可經(jīng)過脂質(zhì)體等直接將外源表達質(zhì)粒導入哺乳動物細胞，進展表達。哺乳動物細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)更接近于天然

3、蛋白，但其表達量低。54、桿狀病毒昆蟲細胞表達體系：蛋白表達程度高，可長晶體，多用于蛋白結(jié)果與功能的研討，但重組質(zhì)粒構(gòu)建及交融非常復雜。6三、細胞與載體的選擇1、常用于表達的哺乳動物細胞：COS-7、BHK、293T、Sf-9、Sf-21等，詳細選擇可根據(jù)實踐需求或者表達載體所含的表達原件等進展選擇。2、表達質(zhì)粒的選擇：常用的真核表達質(zhì)粒有pCAGGS、pCDNA 3.1、 pEGFP等均為SV40 origin。3、某些特殊的表達載體：如反向遺傳表達載體，昆蟲表達系統(tǒng)載體等。7四、哺乳動物細胞轉(zhuǎn)染1、引物設(shè)計：構(gòu)建重組真核表達質(zhì)粒，普通在引物設(shè)計時首先會在引物中引物一些可以促進蛋白表達如Ko

4、zak序列或者便于后期檢測的序列或標簽如flag、HA、His等，留意這些序列在引物中的位置。2、實驗資料：真核表達細胞系、DMEM、FBS、OPTI-MEM、PBS、trypsin、攜帶有外源基因的重組質(zhì)粒去細胞內(nèi)毒素法抽提、轉(zhuǎn)染試劑或儀器、細胞計數(shù)器、蓋玻片、六孔板等。3、轉(zhuǎn)染細胞密度約25106/mL,普通在細胞鋪板后1218h內(nèi)進展轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒要測定濃度，按2ug/孔進展。8 細胞轉(zhuǎn)染步驟 以DFV-E基因轉(zhuǎn)染cos-7細胞為例1、cos-7細胞消化后計數(shù)，鋪六孔板，培育1224h，察看細胞生長情況，至適宜密度 (鋪板后的細胞盡能夠在24h內(nèi)進展轉(zhuǎn)染，普通選擇過夜)即可進展轉(zhuǎn)染。2

5、、質(zhì)粒及脂質(zhì)體處置1及脂質(zhì)體 ：脂質(zhì)體為4、6、8uL/孔脂質(zhì)體+OPTI-MEM，250ul/1.5 tube，孵育5min2質(zhì)粒：質(zhì)粒終濃度分別為2、3、4ug/孔質(zhì)粒+OPTI-MEM，250ul/1.5 tube，不需孵育，在脂質(zhì)體孵育5min中的過程中，把質(zhì)粒配好93、將第二步中2參與1中，混勻，不要猛烈吹打，孵育20min在兩者作用的20min時間內(nèi)，洗滌細胞4、細胞的洗滌：先棄掉原培育液，以維持液DMEM未加血清洗滌兩遍1mL/孔；再用OPTI-MEM洗滌一遍，約1mL/孔。細胞洗滌也可用預熱的PBS或者Hanks液洗滌，最后一遍洗滌最好運用維持液。5、將六孔板中的以上液體棄掉，

6、再參與1.5mL的OPTI-DMEM； 將孵育的脂質(zhì)體及質(zhì)粒500uL/孔均勻 滴入其中，輕搖六孔板使之混合均勻。106、將六孔板放入培育箱，普通56小時后換液，詳細能否要換液根據(jù)細胞詳細生長形狀進展調(diào)整。7、棄去原培育液，補加2mL/孔的OPTI-MEM，或者參與2mL/孔的含10%血清的DMEM培育基，繼續(xù)培育至3648h。8、培育至48h后收細胞即可停頓培育，然后進展表達蛋白的鑒定。假設(shè)用IFA法檢測，那么在此處即可進展細胞固定；假設(shè)進展Western bolt法檢測，那么此處需求將細胞消化下來，裂解，然后進展SDS-PAGE，最終經(jīng)過WB檢測。9、轉(zhuǎn)染時留意做空白細胞對照和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染對

7、照。11五、Western-blot法對轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測1、培育至48h后收細胞(視細胞形狀決議何時搜集細胞)，棄去六孔板中的培育液，然后以胰酶消化500uL/孔、作用1min。2、以預冷的PBS反復吹打洗脫細胞，PBS 1mL/每孔(最好再用PBS 500uL反復洗細胞孔一次，徹底搜集一切的細胞)，為了提高細胞量，可做兩轉(zhuǎn)染孔合一管。3、汲取消化下來的細胞于1.5mL tube中，4、12000r/m、2min；棄上清。 124、再以1mL PBS洗滌離心細胞沉淀，在管口沿壁參與，吹起沉淀；離心：4、12000r/m、2min；棄上清。5、每個離心管參與100uL細胞裂解液(RIPA)，吹打混

8、勻，冰上作用30min裂解細胞。6、離心4 12000r/m、5min；汲取上清約30uL；煮樣，加上樣loading buffer，蛋白電泳。7、轉(zhuǎn)膜、封鎖，進展western blotting鑒別。8、留意：由于真核表達的蛋白量較低，因此在做WB檢測時，最好采用ECL發(fā)光，然后經(jīng)過X膠片曝光或者運用低溫冷凍CCD儀器進展曝光，而不采用化學發(fā)光試劑DAB進展顯色，由于檢測的靈敏度差別較大。13細胞裂解液RIPA配方 強裂解液50mL 弱裂解液50mL Tris-HCL(pH=7.4) Tris-HCL(pH=7.4) NaCL 0.44g NaCL 0.44gTriton-X 100/NP4

9、0 500uL Triton-X 100/NP40 500uL 脫氧膽酸鈉 0.5g 脫氧膽酸鈉 0.125g SDS 0.05g SDS 0.05g 1mM EDTA 0.0186g 1mM EDTA 0.0186g 14六、間接免疫熒光法IFA對轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測1、轉(zhuǎn)染細胞培育至48h后，棄掉六孔板中培育基，用PBS洗滌細胞35次，每次1mL/孔，參與PBS后將培育板放在程度搖床中輕搖1min。留意：千萬不能用冷的PBS，否那么細胞會從培育板中大片零落。2、細胞固定：以4%多聚甲醛將細胞固定在六孔板中，防止零落；1mL/孔，室溫固定2030min。3、洗滌細胞板：PBS或PBST洗滌35次，

10、每次1mL/孔，1min/次。154、透膜：對于胞內(nèi)表達的分泌蛋白需求進展透膜，而在膜外表表達的可以不透膜。此時以冷的Triton-X 100，1mL/孔，室溫孵育1520min進展透膜。5、洗板：同上。6、封鎖：以1% BSAPBST溶解封鎖六孔板，1mL/孔，室溫孵育3060min。7、洗板：同上。168、孵育一抗：一抗可選擇制備的多抗或針對特定標簽的單抗，以1% BSA稀釋抗體。500uL1mL/孔，37，孵育1h。9、洗板：同上。10、孵育熒光二抗：二抗為FITC熒光標志抗體，孵育時需求用錫箔紙將六孔板完全包裹住，37，避光孵育1h。11、洗滌：此處洗滌同上，但仍需求避光。12、置于熒光顯微鏡同一設(shè)置參數(shù)下，分別進展對照孔及轉(zhuǎn)染孔的拍照。1718七、Cell-ELISA法對轉(zhuǎn)染結(jié)果的檢測1、該方法用于在96孔板進展的轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染至48h后，前期操作同IFA，只是在