1、暨南大學藥學院1內(nèi)容 第四篇 遺傳信息的儲存、傳遞和調(diào)控16章章 DNA的復制及損傷修復的復制及損傷修復17章章 RNA的生物合成、轉(zhuǎn)錄后加工和調(diào)節(jié)的生物合成、轉(zhuǎn)錄后加工和調(diào)節(jié)18章章 蛋白質(zhì)的生物合成及其加工修飾蛋白質(zhì)的生物合成及其加工修飾19章章 基因表達的調(diào)控基因表達的調(diào)控20章章 重組重組DNA技術(shù)技術(shù)21章章 基因診斷與基因治療基因診斷與基因治療暨南大學藥學院217章 RNA的生物合成、轉(zhuǎn)錄后加工和調(diào)節(jié)暨南大學藥學院3第一節(jié) 基因轉(zhuǎn)錄的基本性質(zhì)是以DNA單鏈為模板，NTP為原料，在DNA依賴的RNA聚合酶催化下合成RNA鏈的過程。n DNA上的轉(zhuǎn)錄區(qū)域稱為 n 轉(zhuǎn)錄是基因表達的第一階

2、段也是基因調(diào)節(jié)的主要階段。暨南大學藥學院4轉(zhuǎn)錄與復制的異同相同相同差異差異轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄復制復制模版模版DNA一條鏈一條鏈2條條原料原料核苷三磷酸核苷三磷酸NTPdNTP堿基配對堿基配對遵從堿基配對遵從堿基配對A-U,G-C,T-A聚合酶聚合酶依賴依賴DNA的酶的酶RNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶產(chǎn)物產(chǎn)物多核苷酸鏈多核苷酸鏈RNA雙鏈雙鏈DNA特點特點不對稱轉(zhuǎn)錄不對稱轉(zhuǎn)錄半保留半不半保留半不連續(xù)連續(xù)暨南大學藥學院5 DNA分子中編碼RNA的區(qū)段 Watson W鏈 負鏈 Crick C鏈 正鏈 不同基因的模板鏈核編碼鏈并不是固定在某一條鏈上。暨南大學藥學院6： 以核糖核苷三磷酸（rNTP）為底物

3、；以DNA為模板；按53方向合成；無需引物的存在能單獨起始鏈的合成；合成時，第一個引入的NTP是以三磷酸形式存在；在體內(nèi)DNA雙鏈中僅一條鏈作為轉(zhuǎn)錄的模板；RNA的序列和模板是互補的；RNA聚合酶無校正能力。 原核生物的RNA聚合酶細菌中只有一種 真核生物的RNA聚合酶真核生物有三類不同的第二節(jié) RNA聚合酶暨南大學藥學院7RNA的酶促合成暨南大學藥學院8一、原核生物的RNA聚合酶 大腸桿菌RNA聚合酶的組成450kd，5個亞基2個Alpha亞基參與全酶的組裝及識別啟動子亞基與NTP及新生鏈結(jié)合亞基與模板DNA結(jié)合亞基辨認轉(zhuǎn)錄起始點，延伸階段與核心酶分離，一種轉(zhuǎn)錄輔助因子暨南大學藥學院9 因子

4、 原核只有一種RNA聚合酶，但有多種因子 在不同的條件下被表達，并與相應(yīng)啟動子結(jié)合 基因啟動子35和10區(qū)的保守序列是其識別位點暨南大學藥學院10RNA polymerase in prok. Core EnzymeHolo Enzyme for elongationfor initiation依靠靜電作用力依靠靜電作用力依靠空間結(jié)構(gòu)依靠空間結(jié)構(gòu)非專一性與非專一性與DNA 結(jié)合結(jié)合專一性與專一性與 DNA結(jié)合結(jié)合結(jié)合常數(shù)；結(jié)合常數(shù)；1011/mol結(jié)合常數(shù)；結(jié)合常數(shù)；1014/mol半衰期；半衰期；60衰期；數(shù)小時衰期；數(shù)小時cover60bp 暨南大學藥學院11基因 產(chǎn)物 功能E.coli

5、RNA Pol 的結(jié)構(gòu)和功能rpoA 2 亞基(每個40kD)酶的連接，裝配啟動子的識別結(jié)合某些活化因子rpoB 亞基(160kD)rpoC 亞基(160kD)rpoD 亞基(3290kD)和底物結(jié)合催化核心和模板結(jié)合和啟動子結(jié)合識別模板鏈暨南大學藥學院12原核生物原核生物RNApol (Core) 的結(jié)構(gòu)與功能的結(jié)構(gòu)與功能Enzyme MovementDNA coding strand ( )Rewinding point ()Unwinding point ()RNA binding site RNA/DNA hybrid ()DNA template strand Holo Enzyme

6、 使使 DNA 形成形成10-17bp的解鏈區(qū)的解鏈區(qū) 暨南大學藥學院13 RNA 聚合酶需執(zhí)行多功能：識別DNA雙鏈上的啟動子；使DNA在啟動子處解鏈成單鏈； 通過閱讀啟動子序列，RNA聚合酶確定它自己的轉(zhuǎn)錄方向和模板鏈；最后當它達到終止子時，通過識別停止轉(zhuǎn)錄 暨南大學藥學院14二、真核生物的RNA聚合酶 已發(fā)現(xiàn)有3種 對抑制劑鵝膏覃堿的敏感性有差異 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不同暨南大學藥學院15 轉(zhuǎn)錄何處開始？ 啟動子DNA模板上被RNA聚合酶識別并結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄起始復合物的區(qū)段。 原核生物啟動子 真核生物啟動子第三節(jié) 與轉(zhuǎn)錄有關(guān)的DNA結(jié)構(gòu)暨南大學藥學院16一、原核生物啟動子 A or G 一致序列TAT

7、AAT pribnow box 一致序列TTGACA 因子識別位點，全酶結(jié)合于此， Sextama box 長短比序列重要暨南大學藥學院17大腸桿菌啟動子的保守序列暨南大學藥學院18 RNA聚合酶I 的啟動子rRNA 45s RNA，再加工成5.8s,18s,28s rRNA，啟動子由核心啟動子和上游的調(diào)控元件組成二、真核生物啟動子暨南大學藥學院19 RNA聚合酶II 的啟動子90的GC盒，70的CAAT盒，30處的TATA盒與原核生物相似，大多為A或GmRNA，種類繁雜種類繁雜，啟動子多樣性，還發(fā)現(xiàn)其還發(fā)現(xiàn)其它的相關(guān)元件它的相關(guān)元件。各種元件有不同的組合。II是最活躍的聚合酶。暨南大學藥學院

8、20真核RNA聚合酶II啟動子和增強子通過蛋白質(zhì)的介導互相結(jié)合，形成環(huán)，啟動轉(zhuǎn)錄暨南大學藥學院21真核啟動子含有的各種元件和分布暨南大學藥學院22 RNA聚合酶III的啟動子催化snRNA, tRNA, 5S RNA的轉(zhuǎn)錄需要其它輔助因子共同作用snRNA啟動子與蛋白質(zhì)基因啟動子相似tRNA, 5S RNA內(nèi)部啟動子暨南大學藥學院23真核RNA啟動子的基因內(nèi)啟動子和基因外啟動子暨南大學藥學院24真核啟動子不同于原核的特點 有多種元件； 結(jié)構(gòu)不恒定； 它們的位置、基序、距離和方向都不完全相同； 有的有遠距離的調(diào)控元件存在，如增強子、沉默子等； 這些元件常常起到控制轉(zhuǎn)錄效率和選擇起始位點的作用；

9、。暨南大學藥學院25 轉(zhuǎn)錄的起始 轉(zhuǎn)錄的延伸 轉(zhuǎn)錄的終止第四節(jié) 轉(zhuǎn)錄過程暨南大學藥學院26轉(zhuǎn)錄的起始 原核生物轉(zhuǎn)錄的起始 真核生物轉(zhuǎn)錄的起始暨南大學藥學院27原核生物的轉(zhuǎn)錄起始 1. 在的參與下與模板的DNA接觸，生成非專一的，不穩(wěn)定的復合物在模板上移動； 2. ：全酶與模板的啟動子結(jié)合，產(chǎn)生封閉的“酶酶-啟動子二元復合物啟動子二元復合物”（closed binary complex）； 3. 酶緊密地結(jié)合在啟動子的-10序列處，模板DNA局部變性，形成“”（open binary complex）； 4. 酶移動到轉(zhuǎn)錄起始點上，第一個rNTP轉(zhuǎn)錄開始，因子釋放，形成酶酶-啟動子啟動子-rNT

10、P三元復合體三元復合體。暨南大學藥學院28E.coli轉(zhuǎn)錄的起始暨南大學藥學院29真核生物的轉(zhuǎn)錄起始 每種RNA聚合酶都需要一些蛋白質(zhì)輔助因子，即轉(zhuǎn)錄因子，transcription factor（I,II,III類分別對應(yīng)于聚合酶）暨南大學藥學院30RNA聚合酶I催化的起始 轉(zhuǎn)錄起始點上游有2個順式作用元件，核心核心元件元件core element和上游調(diào)控元件和上游調(diào)控元件UCE。RNA聚合酶I催化的轉(zhuǎn)錄需要2種轉(zhuǎn)錄因子，。SL1有4個亞基，是,另是TBP相關(guān)因子。暨南大學藥學院31p342UBF和UCE結(jié)合令DNA發(fā)生彎曲，使相距上百bp的UCE 和核心元件靠攏，接著SL1和polI相繼

11、結(jié)合到UBF-DNA復合物上，完成復合物的組建，開始轉(zhuǎn)錄。暨南大學藥學院32 Pre-rRNA Allows RNApol binding complex to initiate RNApol 暨南大學藥學院33RNA聚合酶II催化的起始轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄因子： 需要較多的轉(zhuǎn)錄因子參與轉(zhuǎn)錄起始復合物的組裝轉(zhuǎn)錄起始復合物的組裝：TFII-D與TATA盒結(jié)合，。 TFII-A存在時與TFII-D結(jié)合成D-A復合物，防止復合物與抑制因子的結(jié)合，繼而與TFII-B結(jié)合。，此時不能啟動轉(zhuǎn)錄，必須TFII-E和TFII-H/ TFII-J的參與。，使起始部位DNA解鏈。 還有蛋白激酶活性，這是聚合酶離開起始點繼

12、續(xù)轉(zhuǎn)錄的重要因素。暨南大學藥學院34真核生物的轉(zhuǎn)錄RNA Pol 的轉(zhuǎn)錄起始暨南大學藥學院35RNA Pol 的轉(zhuǎn)錄起始暨南大學藥學院36TATA +1 Wilds minor groove TFII A TBP of D pre-TIC TFII F RNApol IITFII B Basic TIC conclusion暨南大學藥學院37mRNA Promoter clearance Transcription startingEHJE H B D AJ暨南大學藥學院38RNA聚合酶III催化的起始 需要3個蛋白質(zhì)因子TFIII-A,B,C。 tRNA基因轉(zhuǎn)錄的起始基因轉(zhuǎn)錄的起始： 在DN

13、A上的調(diào)控序列位于起始轉(zhuǎn)錄位點的下游，稱為內(nèi)部啟動子。有2個調(diào)控區(qū)，A盒和B盒。 5s RNA基因轉(zhuǎn)錄的起始基因轉(zhuǎn)錄的起始：除了TFIII-B,C外，還需要TFIII-A，首先TFIII-A結(jié)合到下游C盒，然后TFIII-C結(jié)合到A盒和B盒，繼而是類似tRNA的轉(zhuǎn)錄暨南大學藥學院39TFIII C +1 A box B box tDNA TFIIIB TBPBRFB暨南大學藥學院40TFIIIB allows RNApol III to bindand initiate transcription tRNA RNApolIII +1暨南大學藥學院41 RNApolIIITFIIIC TFIII

14、A +1 A box C box TFIIIB rRNA 5s pre-rRNA transcription暨南大學藥學院42轉(zhuǎn)錄的延伸 延伸階段，原核和真核比較相近。聚合酶如何向轉(zhuǎn)錄起始點下游移動？轉(zhuǎn)錄區(qū)的模板如何形成局部單鏈區(qū)？暨南大學藥學院43原核生物的延伸原核生物的延伸：核苷酸鏈中的的一個磷酸二酯鍵形成后， 因子從全酶中解離出來，核心酶沿DNA分子移動。真核生物真核生物： RNA聚合酶需要較多的轉(zhuǎn)錄因子，起始后酶的移動也靠多種轉(zhuǎn)錄因子的共同作用使酶的構(gòu)象發(fā)生改變來實現(xiàn)，如在TFII-H的作用下，polII C端絲氨酸的磷端絲氨酸的磷酸化酸化是向下游移動的重要因素。暨南大學藥學院44轉(zhuǎn)錄

15、的延伸延伸時RNA 聚合酶以穩(wěn)定收縮和突然伸展的方式在DNA上“爬行”，穩(wěn)定的收縮是指RNA聚合酶從35bp長連續(xù)地收縮到28bp，然后前端又突然向前伸展8bp,RNA聚合酶又恢復到35 bp長。 暨南大學藥學院45轉(zhuǎn)錄泡p345 在轉(zhuǎn)錄延伸的過程中，DNA雙鏈需要解開1020bp，形成的局部單鏈區(qū)象一個小泡 為了保持局部的轉(zhuǎn)錄泡狀態(tài)，在RNA聚合酶下游的DNA需要不斷的解鏈，可使越纏越緊，而其鏈變得松弛，產(chǎn)生。解旋酶和拓撲酶可以消除這些螺旋暨南大學藥學院46 第一個磷酸二酯鍵的形成是由第一個核苷酸的3OH與第二個核苷酸的5磷酸之間脫水形成的。 在轉(zhuǎn)錄局部形成的RNA:DNA雜合雙鏈之間的力比

16、DNA雙鏈的弱，延長中的RNA鏈的5端會被重新形成的DNA雙鏈擠出，使合成中的RNA鏈的5端游離端游離于轉(zhuǎn)錄復合物于轉(zhuǎn)錄復合物。暨南大學藥學院47轉(zhuǎn)錄的終止 生物轉(zhuǎn)錄的終止處有特殊結(jié)構(gòu)的存在，稱為終止終止子子 在原核細胞中有兩種不同的終止子，一種是強終強終止子止子，另一種是。強終止子在體外實驗中，無需其他任何因子的幫助就可以終止核心酶，這種終止子被稱為（intrinsic terminators）。弱終止子需要在一種蛋白質(zhì)因子（rho factor）的幫助一才能終止，所以又稱為依賴性終止子依賴性終止子（Rho-dependent terminator） 暨南大學藥學院48強終止子的結(jié)構(gòu)強終止子

17、的結(jié)構(gòu)有三個特點：有回文有回文結(jié)構(gòu)存在結(jié)構(gòu)存在。由它轉(zhuǎn)錄出mRNA可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，可阻止RNA 聚合酶的前進；，由于它和模板形成的連續(xù)U-A配對較易打開，從而便于釋放出RNA。暨南大學藥學院49弱終止子的結(jié)構(gòu)它也可形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)，但在莖中的莖中的G.C含量少含量少，莖環(huán)易打開。在，因此RNA 聚合酶合成此段RNA后，由于莖環(huán)的存在可使聚合酶暫停一下，若此時追上來和聚合酶結(jié)合，那么轉(zhuǎn)錄即可終止，若無因子聚合酶還可越過終止進行“通讀”。暨南大學藥學院50RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄mRNA 因 子 附 著 到mRNA識別位點因子在RNA聚合 酶 后 面 沿mRNA移動RNA聚合酶在終止位點停留，因子趕上了聚合酶

18、在轉(zhuǎn)錄泡中因子解開DNA-RNA雜合鏈終止RNA聚合酶，因子和RNA被釋放在原核mRNA轉(zhuǎn)錄中依賴性終止機制暨南大學藥學院51依賴性終止子，其共同特點是C豐富，G缺乏暨南大學藥學院52RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄出mRNA后核糖體結(jié)合到mRNA上核糖體在突變位點解離 因 子 追 上 了RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄提前終止無義突變時因子可能使轉(zhuǎn)錄提前終止暨南大學藥學院53原核轉(zhuǎn)錄的過程暨南大學藥學院54真核生物轉(zhuǎn)錄的終止 機制了解不多，且3種聚合酶的轉(zhuǎn)錄終止不完全相同。 RNA聚合酶聚合酶I催化的轉(zhuǎn)錄有18bp的終止子序列，可被輔助因子識別。RNA聚合酶聚合酶II和和III催化轉(zhuǎn)錄催化轉(zhuǎn)錄的終止子的終止子，可能有與原核

19、生物不依賴因子的終止子相似的結(jié)構(gòu)和終止機制，即有。 由于成熟的mRNA3端已被切除了一段，并加入了polyA尾巴，具體的轉(zhuǎn)錄終止點目前尚未認識。暨南大學藥學院55真核生物的轉(zhuǎn)錄終止爪蟾rDNA的轉(zhuǎn)錄終止位點真核生物的RNA大部分都要經(jīng)過加工，包括剪切和加上poly(A)，因此對于其終止的情況了解因此對于其終止的情況了解很少，只有少數(shù)的例子搞得比較清楚很少，只有少數(shù)的例子搞得比較清楚。前體RNA轉(zhuǎn)錄的終止是隨著組織的變化而變化。例如在爪蟾中有兩個重要的轉(zhuǎn)錄終止位點：T2和T3。T2是28SrRNA序列3末端下游約235bp序列。T3是排列在下一個轉(zhuǎn)錄單位的上游約200bp處。T2和T3都含有7個

20、堿基的保守序列：5-GACTTGC-3。T2是前體rRNA轉(zhuǎn)錄的初始終止位點。T3是作為是作為“失敗失敗-保險保險”的終止位的終止位點點，由于rDNA轉(zhuǎn)錄單位是串聯(lián)排列的，所以“失敗-保險”終止系統(tǒng)讓RNA Pol分子可能在一個轉(zhuǎn)錄單位上起始和轉(zhuǎn)錄。 暨南大學藥學院56第五節(jié) RNA轉(zhuǎn)錄后加工 原核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工mRNA轉(zhuǎn)錄后的加工rRNA轉(zhuǎn)錄后的加工tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工 真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工rRNA轉(zhuǎn)錄后的加工tRNA轉(zhuǎn)錄后的加工mRNA轉(zhuǎn)錄后的加工暨南大學藥學院57原核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工 mRNA的加工的加工：mRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，一般無需加工即具有活性，可作為翻譯的模板。但

21、近年也發(fā)現(xiàn)要添加3polyA的現(xiàn)象。tRNA, rRNA的加工修飾較多。 rRNA的加工的加工：rRNA基因常與一些tRNA基因混合組成一個操縱子，呈有序排列。RNA酶酶III對其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進行切割，其產(chǎn)物還需再加工才成為成熟的rRNA，具體機制不明。暨南大學藥學院58原核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工 tRNA的加工的加工：原核生物tRNA的初始轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有幾種形式，1、與rRNA相連；2、相同的幾個拷貝連在一起；3、不相同的幾個連在一起。要經(jīng)過多個加工程序才能成為成熟的tRNA。參與tRNA加工的酶類有多種包括：RNA酶III，RNA酶D，RNA酶P，tRNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶暨南大學藥學院59真核生物RN

22、A轉(zhuǎn)錄后的加工 rRNA的加工的加工：有5s，5.8s，18s，28s四種，其中5.8s，18s，28s 是由RNA聚合酶I催化一個轉(zhuǎn)錄單位（中度重復序列），產(chǎn)生45s rRNA前體，rRNA轉(zhuǎn)錄后加工包括前體rRNA與蛋白質(zhì)結(jié)合，然后再切割和甲基化。 轉(zhuǎn)錄在核仁進行，新生的前體迅速與蛋白質(zhì)結(jié)合成前體核糖體顆粒，然后，其中的RNA經(jīng)一系列切割先產(chǎn)生18s rRNA，該RNA與蛋白質(zhì)組成核糖體的小亞基。余下的部分再拼接成5.8S, 28S rRNA。前體rRNA的切割在特殊序列位點，可能是由核仁小RNA(snoRNA)催化。，在切割加工后，甲基化仍保留，甲基化的位點在脊椎動物中是高度保守的。進入

23、核仁與28s，5.8s rRNA及蛋白質(zhì)一起組成核糖體的大亞基，以大亞基的形式通過核孔進入胞漿。 暨南大學藥學院60真核生物RNA轉(zhuǎn)錄后的加工 tRNA的加工的加工：包括，有些需要剪接。有些tRNA基因在反密碼環(huán)處含有內(nèi)含子，剪接加工與前體mRNA的加工有所不同：在內(nèi)含子兩端切割去除內(nèi)含子后將外顯子連接，沒有轉(zhuǎn)酯反應(yīng)。暨南大學藥學院61真核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后加工 RNA聚合酶II催化轉(zhuǎn)錄，初始產(chǎn)物為，新生的hnRNA從開始形成到轉(zhuǎn)錄終止，就逐步與蛋白質(zhì)形成，前體mRNA加工的順序是形成5帽子結(jié)構(gòu)、內(nèi)切酶去除3端序列、polyA聚合酶催化形成尾巴；剪接取出內(nèi)含子變成成熟的mRNA暨南大學藥學院6

24、25帽的形成 P348 經(jīng)鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶催化與另一個經(jīng)鳥苷酰轉(zhuǎn)移酶催化與另一個GTP作用作用 在鳥嘌呤在鳥嘌呤7甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，以甲基轉(zhuǎn)移酶作用下，以S-腺腺苷蛋氨酸為甲基來源苷蛋氨酸為甲基來源 再經(jīng)再經(jīng)2甲基轉(zhuǎn)移酶催化甲基轉(zhuǎn)移酶催化 5帽子的類型帽子的類型暨南大學藥學院63前mRNA3端切除及加polyA尾 除組蛋白的mRNA外，真核生物所有的mRNA都有3polyA尾。polyA，。暨南大學藥學院64mRNA的剪接 剪接splicing 幾乎所有真核生物的核前體mRNA都有特征的GU/AG序列，稱為。內(nèi)含子離3剪切點2050bp范圍內(nèi)有一個A也是不變的，稱為。分支點附近也有保守序列。暨南大學藥學院65剪接過程p350 由核小RNA與蛋白質(zhì)組成的核小核糖核蛋白與內(nèi)含子結(jié)合，通過中的與5剪接點互補結(jié)合，與內(nèi)含子分支點序列互補，以及snRNP之間的相互作用，內(nèi)含子折疊，使內(nèi)含子兩側(cè)的外顯子靠近，利于剪接反應(yīng)的進行。 剪接反應(yīng)通過2次轉(zhuǎn)酯，釋放出的第一內(nèi)含子。暨南大學藥學院66 核mRNA從核內(nèi)轉(zhuǎn)運至胞漿 mRNA在胞漿中的定位 胞漿中mRNA的穩(wěn)定性第六節(jié) mRNA的轉(zhuǎn)運及其在胞漿中的定位、穩(wěn)定性暨南大學藥學院67核mRNA從核內(nèi)轉(zhuǎn)運至胞漿 前體mRNA（hnRNA）的加工在核內(nèi)特定加工在核內(nèi)特定的亞核結(jié)構(gòu)（核基質(zhì)）中進行的亞核結(jié)構(gòu)（核基質(zhì)）中進行。隨著新合成的mRNA鏈延長