1、.SOD 在食品工業(yè)中， 作為保健食品的功效因子或食品營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑， 該保健品具有良好的抗衰老、抗炎、抗輻射、抗疲勞等保健強(qiáng)身的效果。目前已有添加SOD 的蛋黃醬、牛奶、可溶性咖啡、啤酒、白酒、果汁飲料、礦泉水、奶糖、酸牛乳、冷飲類等類型的保健食品面市。制成多種劑型的SOD 或復(fù)合型食品。已有SOD膠囊劑、片劑、口服液、脂質(zhì)體、顆粒劑等形式的SOD 保健食品。SOD 可作為罐頭食品，果汁、啤酒等的抗氧劑， 防止過氧化物酶引起的食品變質(zhì)及腐敗現(xiàn)象。此外，還可作為水果、蔬菜的保鮮劑。研究證實(shí)，SOD 添加于化妝品中可起到四方面的作用： 一是有明顯的防曬效果；二是SOD 作為抗氧化酶能有效防止皮膚衰老

2、、祛斑、抗皺；三是有明顯的抗炎效果，對(duì)防治皮膚病有一定效果；四是SOD 具有一定的防治瘢痕形成的作用。.自1969 年McCord 和Fridovich 首次從牛紅細(xì)胞中分離出超氧化物歧化酶（SOD）以來(lái)，人們相繼從牛、豬、羊、馬等動(dòng)物紅細(xì)胞、肌肉、肝臟組織以及植物中分離和純化出SOD。國(guó)外已有多種藥用SOD 應(yīng)用于臨床，主要集中在抗炎、抗輻射、抗腫瘤、抗衰老老及由超氧陰離子自由基引發(fā)疾病自身免疫性疾病等。目前，國(guó)內(nèi)SOD 的應(yīng)用主要集中在食品和化妝品等方面，在吸收機(jī)制質(zhì)量穩(wěn)定性、有效性等方面的基礎(chǔ)研究取得一些新進(jìn)展。國(guó)內(nèi)現(xiàn)有SOD 產(chǎn)品主要是從牧畜血液中提取， 發(fā)酵法生產(chǎn)還未產(chǎn)業(yè)化。.超氧化

3、物歧化酶是廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物細(xì)胞內(nèi)的金屬酶，至少可分為三種類型：Cu，Zn-SOD、Fe-SOD、Mn-SOD。該酶系一種酸性蛋白質(zhì)，較穩(wěn)定， 能耐熱。pH7.69 時(shí)穩(wěn)定，pH6 以下和12 以上不穩(wěn)定，pH2 以下極度不穩(wěn)定。具有較強(qiáng)的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的能力。.發(fā)酸罐中發(fā)酵培養(yǎng)： 平皿上挑取取H2O2 性能好的單個(gè)菌落， 經(jīng)斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)（一級(jí)）、擴(kuò)大培養(yǎng)（二級(jí)）后，按10%的量接入發(fā)酵罐（2L）中通氣培養(yǎng)。每隔2h 取樣一次， 于650mm 處測(cè)定發(fā)酵液的OD 值，當(dāng)OD 值恒定而有下降趨勢(shì)時(shí)，放出發(fā)酵液，離心收集菌體供提取SOD。酵母菌中SOD 的提取及純化：將離

4、心分離得到的酵母菌體， 懸浮于緩沖液（50mM 磷酸鉀緩沖液，0.3M海藻糖，10M 氯化鎂，pH7.07.5）中，用蝸牛酶酶解后，超聲波破碎細(xì)胞壁， 菌體碎片再用DNase酶酶解，離心除去殘?jiān)么置柑崛∫?；在攪拌下加入乙?氯仿（53）溶液，離心除去雜蛋白；再加入磷酸氫二鉀鹽析； 上清液加入0.75 倍冷丙酮，冷凍離心得粗酶沉淀； 將沉淀溶于pH7.8磷酸鉀（2.5mM）緩沖液中透析12d，即得Cu，Zn-SOD 酶液。.0.3M海藻糖：本來(lái)是0.5M的蔗糖的，但經(jīng)過查找文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)不同濃度的海藻糖對(duì)SOD 均有較強(qiáng)的保護(hù)作用，其中濃度在0.3mol/L 時(shí)效果最佳，而蔗糖對(duì)SOD既無(wú)激活作

5、用也沒抑制作用，所以改成了海藻糖。DNase I：即Deoxyribonuclease I，中文名稱為脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。DNase I水解單鏈或雙鏈DNA后的產(chǎn)物，5端為磷酸基團(tuán)，3端為羥基。10M氯化鎂溶液：是DNase I激活劑。 DNase I活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。鎂離子存在條件下，DNase I可隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)。蝸牛酶：是從蝸牛的嗦囊和消化道中制備的混合酶，它含有纖維素酶，果膠酶，淀粉 酶，蛋白酶等20多種酶。 蝸牛酶是很有價(jià)值的一種酶。它可以用于酵母細(xì)胞壁的破

6、碎.在一般情況下，在一般情況下，SOD活性測(cè)定只能應(yīng)用活性測(cè)定只能應(yīng)用間接活性間接活性測(cè)定法測(cè)定法。其測(cè)定其測(cè)定方法很多，常見的有方法很多，常見的有化學(xué)法化學(xué)法、免疫法、免疫法和等電點(diǎn)聚焦法。其中化學(xué)法應(yīng)用最普遍，化學(xué)法的和等電點(diǎn)聚焦法。其中化學(xué)法應(yīng)用最普遍，化學(xué)法的原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會(huì)產(chǎn)生有原理主要是利用有些化合物在自氧化過程中會(huì)產(chǎn)生有色中間物和色中間物和O2-，利用，利用SOD分解而間接推算酶活力。分解而間接推算酶活力。在化學(xué)方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰在化學(xué)方法中，最常用的有黃嘌呤氧化酶法，鄰苯三酚法，化學(xué)發(fā)光法，腎上腺素法，苯三酚法，化學(xué)發(fā)光法，腎上腺素法，

7、NBT-還原法，還原法，光化學(xué)擴(kuò)增法，光化學(xué)擴(kuò)增法，Cyte還原法等。其中改良的鄰苯三酚還原法等。其中改良的鄰苯三酚自氧化法簡(jiǎn)單易行較為實(shí)用。本實(shí)驗(yàn)采用自氧化法簡(jiǎn)單易行較為實(shí)用。本實(shí)驗(yàn)采用鄰苯三酚自鄰苯三酚自氧化方法氧化方法。.鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出O2-（超氧陰離子自由基），生成帶色的中間產(chǎn)物（超氧陰離子自由基），生成帶色的中間產(chǎn)物（紅桔酚），反應(yīng)開始后反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分（紅桔酚），反應(yīng)開始后反應(yīng)液先變成黃棕色，幾分鐘后轉(zhuǎn)綠，幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因?yàn)樯傻溺姾筠D(zhuǎn)綠，幾小時(shí)后又轉(zhuǎn)變成黃色，這是因?yàn)樯傻闹虚g物不斷氧化的結(jié)

8、果。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的是鄰苯三酚中間物不斷氧化的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的是鄰苯三酚自氧化過程中的自氧化過程中的初始階段初始階段，中間物的積累在滯留，中間物的積累在滯留3045s后，與時(shí)間成線性關(guān)系，一般線性時(shí)間維持在后，與時(shí)間成線性關(guān)系，一般線性時(shí)間維持在4min的范圍內(nèi)，中間物在的范圍內(nèi)，中間物在325nm波長(zhǎng)出有強(qiáng)烈光波長(zhǎng)出有強(qiáng)烈光吸收。當(dāng)有吸收。當(dāng)有SOD存在時(shí)，由于它能催化存在時(shí)，由于它能催化O2-與與H+結(jié)結(jié)合生成合生成O2和和H2O2，從而阻止了中間有色產(chǎn)物的積累，從而阻止了中間有色產(chǎn)物的積累，導(dǎo)致吸光值下降因此，通過測(cè)定它們?cè)谔囟úㄩL(zhǎng)下得導(dǎo)致吸光值下降因此，通過測(cè)定它們?cè)谔囟úㄩL(zhǎng)下得光吸

9、收變化速率計(jì)算出光吸收變化速率計(jì)算出SOD的酶活性的酶活性。. 鄰苯三酚 O2- + 紅桔酚（自氧化：有色物質(zhì)積累，吸光值增加）（自氧化：有色物質(zhì)積累，吸光值增加） O2-+O2- +2H+H202+O2（SOD催化：阻止中間產(chǎn)物積累，吸光值降低）催化：阻止中間產(chǎn)物積累，吸光值降低）pH=8.2SOD. 1測(cè)定鄰苯三酚溶液自氧化速率：取兩支試管按右表加入25預(yù)熱過的緩沖液,然后加入預(yù)熱過的 鄰 苯 三 酚 （ 空 白 管 用10mmol/L HCl代替鄰苯三酚 ），迅速搖勻，立即傾入1cm比色杯中，在325nm波長(zhǎng)處測(cè)定光吸收值，每隔30s讀數(shù)一次，測(cè)定4min內(nèi)每分鐘光吸收值的變化。要求自氧

10、化速率控制在每分鐘的光吸收值為0.070（可增減鄰苯三酚的加入量，以控制光吸收值）。試劑試劑空白空白管管（mL）自氧化自氧化管管（mL）pH8.2、50mmol/LTris-HCl2.982.9810mmol/L HCl0.01 50 mmol/L鄰苯三鄰苯三酚酚0.01.2.SOD樣液活力測(cè)定：樣品管取代自氧化管。樣品管測(cè)定時(shí)先加入預(yù)熱的待測(cè)酶液，在 25水浴鍋中保溫10min，再加入預(yù)熱的鄰苯三酚。其余步驟同鄰苯三酚自氧化速率的測(cè)定 。 試劑試劑空白管（空白管（mL）樣品管（樣品管（mL）pH8.2 50mmol/LTris-HCl 2.982.9810mmol/L HCl 0.02 SOD樣