1、選擇性熒光探針熒光探針的概述熒光探針的設(shè)計原理熒光探針的識別原理熒光分子探針的特點文獻講解熒光探針概述熒光探針概述熒光探針是建立在光譜化學(xué)和光學(xué)波導(dǎo)與測量技術(shù)基礎(chǔ)上，選擇性的將分析對象的化學(xué)信息連續(xù)轉(zhuǎn)變?yōu)榉治鰞x器易測量的熒光信號的分子測量裝置。熒光分子經(jīng)過特殊的設(shè)計，能夠選擇性識別待測物，再將這種識別信息轉(zhuǎn)換成熒光信號傳遞給外界，具有這種功能的分子就是熒光探針分子。熒光探針分子的結(jié)構(gòu)熒光探針分子的結(jié)構(gòu) 熒光探針分子通常由三部分組成： 識別基團（receptor） 熒光基團（fluorophore） 連接體部分（spacer） FSRhvstrongly fluorescentFluorepho

2、reSpacerReceptorAnalyte識別基團決定了探針分子的選擇性和特異性，熒光基團則決定了識別的靈敏度，而連接體部分則可起到分子識別樞紐的作用。熒光探針與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光探針與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系熒光探針的性能與探針的共軛體系大小、共軛鍵體系的共平面性和剛性程度、分子母體上取代基的種類及取代基位置和幾何構(gòu)型等因素相關(guān)。 給電子取代基如：-NH2，-NHR，-NR2，-OH，-OR和-CN。 吸電子取代基如：-C = O，-COOH，-CHO，-NO2和-N=N-。 熒光體取代上重原子后，熒光減弱，而磷光往往相應(yīng)增強。重原子的取代，一般指的是鹵素(Cl，Br和I)的取代。芳烴取代重原子后

3、，熒光強度一般隨鹵素原子量的增加而減弱，這一效應(yīng)稱為“重原子效應(yīng)”。熒光分子探針的設(shè)計原理熒光分子探針的設(shè)計原理 鍵合-信號輸出法 置換法 化學(xué)計量計法1.鍵合鍵合-信號輸出法信號輸出法 熒光 連接體 識別 被分析物 信號輸出 基團 基團 鍵合-信號輸出法是指將探針中的識別基團和熒光基團通過共價鍵連接起來設(shè)計熒光探針的方法。 作為熒光基團的香豆素和作為識別基團的鄰氨基苯硫醚以席夫堿相連，加入鋅離子后，與硫醚上的硫原子、席夫堿上的氮原子及香豆素上的氧原子配位得到結(jié)構(gòu)2，抑制了席夫堿上C=N鍵的旋轉(zhuǎn)，實現(xiàn)了熒光從無到有的變化。 122、置換法、置換法識別基團 被分析物 識別基團 熒光基團 結(jié)合熒光

4、基團 結(jié)合被分析物 該原理是利用識別基團分別與熒光基團和被分析物結(jié)合能力的不同來實現(xiàn)對被分析物的檢測。 識別基團和熒光基團形成絡(luò)合物，當(dāng)被分析物加入到該體系中時，由于識別基團與被分析物的結(jié)合能力要強于識別基團與熒光基團的結(jié)合能力，因此被測物將熒光基團置換出來，從而引起了整個體系熒光等化學(xué)參數(shù)的變化，進而為儀器或者裸眼識別，該原理常用于設(shè)計陰離子熒光探針。 CN-Cu(CN)234Cu2+ 化合物3以氟硼熒為熒光團修飾了DPA為識別基團，探針本身熒光很強，但與銅離子絡(luò)合后可形成結(jié)構(gòu)3，從而淬滅了氟硼熒的熒光，加入氰根離子后，由于銅離子與氰根離子的結(jié)合常數(shù)更大，從而把作為熒光基團的氟硼熒衍生物從絡(luò)

5、合狀態(tài)中置換出來得到結(jié)構(gòu)4，使之進入溶液，熒光恢復(fù)，而其它的陰離子沒有這樣的現(xiàn)象，因此可以實現(xiàn)對氰根離子的檢測。 3、化學(xué)計量計法、化學(xué)計量計法 探針分子 被分析物 新物質(zhì)A 探針分子 被分析物 中間體 新物質(zhì)B 新物質(zhì)C（I）被分析物和探針分子反應(yīng)形成了共價化合物；（II）被分析物催化探針分子反應(yīng)生成兩種新物質(zhì)。12熒光分子探針識別原理熒光分子探針識別原理熒光分子探針主要有如下幾種識別機理：光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機理（PET, photo-induced electron transfer）分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移機理（ICT, intramolecular charge transfer）熒光共振能量轉(zhuǎn)移機

6、理（FRET, fluorescence resonance energy transfer）形成激基締合物（excimer/exciplex）1 1、光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機理（光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機理（PETPET）光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移體系是由包含電子給體的識別基團部分R，通過間隔基S(如-CH2-)和熒光團F相連而構(gòu)成的?；赑ET機理設(shè)計的熒光分子探針，在未結(jié)合客體之前，探針分子不發(fā)射熒光或熒光很弱，而一旦識別基團與客體相結(jié)合，光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移作用就會受到抑制，甚至被完全阻斷，熒光團就會發(fā)射熒光?；诠庹T導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機理設(shè)計的熒光分子探針122 2、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移熒光探針分子通常

7、是熒光團上同時連有推電子基團（電子給體）和吸電子基團（電子受體）,通過鍵提供電子轉(zhuǎn)移的通道，形成強的推-拉作用的共軛體系，其吸電子基團或推電子基團本身充當(dāng)識別基團的一部分。當(dāng)識別基團和被分析物結(jié)合后，作為識別基團的供電子部分或拉電子部分的推拉電能力發(fā)生的改變，整個體系的的電子結(jié)構(gòu)重新分布，從而導(dǎo)致吸收光譜，發(fā)射光譜發(fā)生變化，主要是光譜紅移或藍移 ?；诜肿觾?nèi)電荷轉(zhuǎn)移機理設(shè)計的熒光分子探針343 3、熒光共振能量轉(zhuǎn)移熒光共振能量轉(zhuǎn)移 熒光共振能量轉(zhuǎn)移 是指在兩個不同的熒光團中，如果一個熒光團(供體Doner)的發(fā)射光譜和另一個熒光團(受體Acceptor)的吸收光譜有一定程度的重疊，當(dāng)這兩個熒光

8、團間的距離合適時(一般小于1000nm)，就可以觀察到熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，即用供體的激發(fā)波長激發(fā)時，可觀察到受體的熒光發(fā)射。4 4、激基締合物激基締合物/復(fù)合物復(fù)合物如果兩個相同的熒光團之間的位置和距離合適，其中一個熒光團被激發(fā)以后就會和另外一個處于基態(tài)的熒光團形成激基締合物(excimer)，其熒光發(fā)射光譜的特征表現(xiàn)是原來單體的發(fā)射峰減弱或者消失，而一個新的、強而寬的、長波長的無振動精細結(jié)構(gòu)發(fā)射峰出現(xiàn)。萘、蒽、芘等熒光團由于具有較長的激發(fā)單線態(tài)壽命，易形成激基復(fù)合物，常常用于此類探針的設(shè)計中?；诩せ喓衔镌O(shè)計的熒光分子探針56熒光分子探針的特點熒光分子探針的特點熒光探針的熒光必

9、須與生物樣品的背景熒光易于區(qū)別;熒光探針必須不干擾研究的主體;熒光探針的毒性、使用的pH范圍，生物相容性等方面都有嚴格的要求。 目前使用的熒光探針主要有熒光素類、羅丹明類，香豆素類等化合物。 羅丹明及其衍生物是一種氧雜蒽類熒光染料 ，由于苯環(huán)間氧橋的存在，從而分子具有剛性共平面結(jié)構(gòu)，使其分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強，開環(huán)狀態(tài)下，在激發(fā)光的作用下能產(chǎn)生強烈的吸收和熒光，其最大發(fā)射波長位于500-700 nm之間，為紅色可見光區(qū)，可有效的避開生物體系背景熒光，從而能提高探針的靈敏度，因此是生物分析中經(jīng)常用到的熒光探針，具有很高的研究和應(yīng)用價值。 羅丹明類 14 15 羅丹明內(nèi)酰胺螺環(huán)結(jié)構(gòu)具以下特點：1）羅丹

10、明的內(nèi)酰胺螺環(huán)是非共軛結(jié)構(gòu)的，因此在長波長處無吸收，無色，無熒光；2）內(nèi)酰胺螺環(huán)結(jié)構(gòu)在酸性條件或者與被分析物結(jié)合后能夠誘導(dǎo)羅丹明內(nèi)酰胺結(jié)構(gòu)開環(huán)，氧雜蒽結(jié)構(gòu)電子重新排布，共軛結(jié)構(gòu)恢復(fù)，因此在長波長有吸收，有顏色，強熒光。由于此結(jié)構(gòu)的優(yōu)勢，羅丹明內(nèi)酰胺類衍生物是一類很好的OFF-ON型熒光傳感器熒光團。卟啉類 卟啉（Porphyrin）是卟吩（Porphine）外環(huán)帶有取代基的同系物和衍生物的總稱。卟吩是由4個吡咯環(huán)和4個次甲基橋聯(lián)起來的18電子的大環(huán)共軛結(jié)構(gòu)，具有平面分子結(jié)構(gòu)和芳香性，不同的卟吩分子其平面性不同，共軛程度也不同。其結(jié)構(gòu)具有以下幾個特點：（1）卟吩分子中4個吡咯環(huán)的8個位和4個中位

11、（meso-）的氫原子均可被其它基團所取代。（2）當(dāng)卟吩環(huán)中的兩個吡咯上的氫原子被金屬離子取代時，形成金屬卟啉，其配合物的種類繁多。（3）卟啉是兩性化合物，其中兩個吡咯環(huán)上的氮原子可接受質(zhì)子，又可以給出質(zhì)子。（4）卟吩的骨架是非常容易變形的，其分子構(gòu)型與四個中位（meso-）的取代基有關(guān)。卟啉（H2TPP）化合物具有非常好的光學(xué)性質(zhì)，是一種理想的熒光物質(zhì)，具有高的熒光量子產(chǎn)率、大的Stokes位移、相對長的激發(fā)（400 nm）和發(fā)射（600nm）波長，相對長的激發(fā)和發(fā)射波長能夠減少背景熒光的干擾，是一種值得深入研究的離子熒光探針，卟啉直接作為識別基團對某些金屬離子有一定響應(yīng)。卟啉可以與金屬陽離

12、子配位形成金屬卟啉。而且金屬卟啉與自由堿卟啉的吸收光譜和發(fā)射光譜又完全不一樣。因此，利用不同的卟啉化合物就能直接測定金屬離子。時至今日， 已有報道卟啉可以用于Zn2+、Cd2+、Li+、Cu2+、Na+、Co2+、Pd2+、Hg2+以及H+的檢測等。展望 隨著熒光探針技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,必然會給目前較為熱門的基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、生物芯片以及等藥物作用機制等領(lǐng)域帶來新的發(fā)展契機，提供非常有價值的方法和信息。文文 獻獻 講講 解解據(jù)于羅丹明據(jù)于羅丹明“關(guān)關(guān)- -開開”的熒光探針對的熒光探針對FeFe2+2+在活細胞成像中在活細胞成像中具有高選擇性具有高選擇性BackgroundDuring p

13、ast decades, some successful attempts have been made to develop selective fluorescent probes for Fe3+.Unfortunately, there have been relatively few fluorescent probesfor Fe2+On the other hand, rhodamine-based fluorescent probes with the construction of a turn-on type have received increasing interes

14、t in recent years because of their simplicity, low detection limit, the capability for special recognition and excellent spectroscopic properties. Highlights A rhodamine-based “turn-on” fluorescent probe was synthesized with high yield. Probe displays high selectivity for Fe2+ and a stable response

15、range of 224 M. The “turn-on” fluorescence is caused by open-cyclic mechanism of rhodamine. Probe shows a good application to monitor Fe2+ in living cells by bioimaging.Results and discussion探針探針1 1（羅丹明）由（羅丹明）由2 2（2,6 - 2,6 - 二乙?；拎ぃ┰诙阴；拎ぃ┰诩状贾屑状贾懈弋a(chǎn)量合成高產(chǎn)量合成1、Selectivity analysis探針探針1的最大激發(fā)波長為的最大激發(fā)波長

16、為562nm(A); Fe2+具有高選擇性具有高選擇性(B)2、Job plot analysis溶液中探針溶液中探針1: Fe1: Fe2+2+=2:1=2:1形成絡(luò)合物時時，工作曲線的拐點為形成絡(luò)合物時時，工作曲線的拐點為0.67(Fig. 2A)；當(dāng)；當(dāng)FeFe2+2+的濃度范圍為的濃度范圍為224uM時的熒光強度時的熒光強度（ Fig. 2B ）。）。3、The pH-controlled emission measurement這個圖譜表明自由探針這個圖譜表明自由探針1在不同在不同pH緩沖液下的熒光強度；在緩沖液下的熒光強度；在pH范圍為范圍為5.5-8.0時熒光探針時熒光探針1對鐵

17、離子具有響應(yīng)，而熒光強度的變化小于對鐵離子具有響應(yīng)，而熒光強度的變化小于10。4、 Mechanism analysis羅丹明絡(luò)合物在構(gòu)造羅丹明絡(luò)合物在構(gòu)造“關(guān)關(guān)-開開”熒光探針時是一個理想的模型，熒光探針熒光探針時是一個理想的模型，熒光探針1 1的的發(fā)光性能對應(yīng)于發(fā)光性能對應(yīng)于“關(guān)關(guān)- -開開”的熒光信號，這種信號據(jù)于螺環(huán)和開環(huán)之間的轉(zhuǎn)換的熒光信號，這種信號據(jù)于螺環(huán)和開環(huán)之間的轉(zhuǎn)換機制。加入的金屬陽離子導(dǎo)致可逆或不可逆的螺環(huán)開環(huán)反應(yīng)，機制。加入的金屬陽離子導(dǎo)致可逆或不可逆的螺環(huán)開環(huán)反應(yīng)，F(xiàn)eFe2+2+能結(jié)合中間能結(jié)合中間的四個氧原子和乙酰吡啶，從而導(dǎo)致開環(huán)。兩組協(xié)調(diào)的四個氧原子和乙酰吡啶，

18、從而導(dǎo)致開環(huán)。兩組協(xié)調(diào) O2N2 單位的群體能單位的群體能夠滿足夠滿足FeFe2+2+的飽和配位層結(jié)構(gòu)。的飽和配位層結(jié)構(gòu)。5、Aser scanning confocal microscopy. .（激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)）（激光掃描共焦顯微鏡技術(shù)）探針探針1會對活細胞內(nèi)的會對活細胞內(nèi)的Fe2+濃度的變化具有響應(yīng)；細胞內(nèi)含濃度的變化具有響應(yīng)；細胞內(nèi)含F(xiàn)e2+和探針的場發(fā)和探針的場發(fā)射圖片表明細胞成像的實驗是可行的（射圖片表明細胞成像的實驗是可行的（ C圖）。圖）。Conclusions1、據(jù)于羅丹明絡(luò)合物、據(jù)于羅丹明絡(luò)合物“關(guān)關(guān)-開開”熒光探針高產(chǎn)量合成。熒光探針高產(chǎn)量合成。2、各種金屬離子的選擇性在、各種金屬離子的選擇性在PBS緩