1、設(shè)計實驗報告 1103018 宋 躍1103019 胡嘉健1103020 劉炫邑1103021 石雨晴 Experimental design report一，如何正確設(shè)計從生物樣品中分別純化生物大分子的道路和正確的設(shè)計方案？二，案例實驗：從動物肝組織樣品中分別提取純化鑒定一種酶如何正確設(shè)計從生物樣品中分別純化生物大分子的道路和正確的設(shè)計方案？ 1，確定生物大分子的種類2，查閱文獻資料確定生物大分子的性質(zhì)例如，分子量，等電點，沉降細數(shù)溶解度，耐熱性等3，查閱分別純化鑒定的方法以及其各有何特點和適用范圍4，根據(jù)所測生物大分子的知條件和實踐情況選擇適宜的分別純化方法5，根據(jù)選取的方法設(shè)計實驗詳細步

2、驟1，正確選材 總的來說，資料選擇應(yīng)遵照的原那么是：有效成分含量多，穩(wěn)定性好；來源豐富、堅持新穎；提取容易、工藝簡單；雜質(zhì)有綜合利用價值。2，資料預(yù)處置 及時運用防止有效成分喪失，否那么應(yīng)及時冰凍或枯燥儲存，同時把易于除去的非需求物質(zhì)如脂質(zhì)除去。3，初分 根據(jù)目的大分子的性質(zhì)確定初分方法，保證回收率高。4，純化 按照先選用粗放、快速、有利于減少樣品體積和后工序處置的方法，后選擇準確、費時和需樣品量少的方法的原那么確定分別方法的排布順序。5，鑒定 用于鑒定性質(zhì)和含量的方法有：光譜法、氣候?qū)游龇ê蜕镄酒ǖ?。用于鑒定生物樣品純度的方法有：電泳法、免疫分析。 根據(jù)實驗?zāi)看_實定鑒定方法，操作務(wù)必準確

3、，盡量防止目的物質(zhì)的流失案例實驗：從動物肝組織樣品中分別提取純化鑒定一種酶實驗?zāi)康模?，掌握從肝細胞中分別提取純化鑒定某種酶的實驗方法 2，培育靈敏選擇并綜合運用各種生物實驗方法的才干3， 培育探求精神及團隊協(xié)作認識 一，資料預(yù)處置1，因動物肝臟中的酶往往結(jié)合較多的脂質(zhì)、核酸的物質(zhì)，所以取饑餓24小時的動物肝臟為實驗資料。2，由于細胞膜的半透膜性質(zhì)，將細胞置于低滲溶液中，細胞易脹破，經(jīng)過攪碎研磨可以得到細胞質(zhì)中的胞液以及細胞核等各種細胞器和少量的細胞器碎片。3，由于目前未知該酶的詳細位置，因此對胞液，細胞核和線粒體應(yīng)該分開研討，使得提取物中雜質(zhì)盡量減少。實驗原理 實驗原理 實驗原理 實驗原理

4、五，離子交換柱層析(Ion exchange column chromatography )，按照可交換離子的類型分為陽離子交換柱色譜法和陰離子交換柱色譜法。根據(jù)物質(zhì)酸堿性、極性等差別，經(jīng)過離子間的吸附和解吸而將電解質(zhì)各組分分開。在離子交換過程中，可以將雜蛋白選擇性地結(jié)合到離子交換劑上，其他蛋白存在于過柱液中;或?qū)⒂謩e蛋白選擇性地結(jié)合到離子交換劑上，雜蛋白存在于過柱液中;或幾種帶同性電荷的蛋白均結(jié)合到交換劑上，利用其結(jié)合的結(jié)實程度不同(即帶電荷的數(shù)目不同)，靜電引力不同，分步洗脫下來，到達分別的目的。實驗原理 六，脫鹽經(jīng)過各種純化手段提取的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)常含有較高的鹽離子濃度，需求將多余的鹽離

5、子去除，稱為蛋白質(zhì)的脫鹽，脫鹽的主要方法有透析法，超濾法，凝膠過濾法等。實驗原理 七，SDS電泳(SDS electrophoresis )該方法中，由于該蛋白質(zhì)有三個大小不同的亞基，所以將會構(gòu)成三條不同的區(qū)帶。到達了實驗鑒定的目的。SDS-PAGE：運用陰離子去污劑十二烷基硫酸鈉，先將蛋白質(zhì)大分子變性，并與其蛋白質(zhì)分子結(jié)合構(gòu)成帶負電荷蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合體沿著以聚丙烯酰胺凝膠構(gòu)成的分子篩向電場的正極方向挪動，從而將蛋白質(zhì)根據(jù)它們分子量的大小而分開。由于小分子量的蛋白質(zhì)挪動速度大于分子量較大的，所以在垂直凝膠中其蛋白質(zhì)分子量由上至下遞減。實驗原理 實驗步驟實驗取材因動物肝臟中的酶往往結(jié)合較多的脂

6、質(zhì)、核酸的物質(zhì)，所以取饑餓24小時的動物肝臟為實驗資料。細胞破碎細胞破碎參與蛋白質(zhì)抑制劑，防止蛋白酶參與蛋白質(zhì)抑制劑，防止蛋白酶水解作用常用的絲氨酸蛋白酶水解作用常用的絲氨酸蛋白酶抑制劑有苯甲基磺酰氟抑制劑有苯甲基磺酰氟PMSF、二異丙基氟磷酸；、二異丙基氟磷酸；金屬蛋白酶抑制劑有金屬蛋白酶抑制劑有EDTA和和EGTA乙二醇四乙酸乙二醇四乙酸 除核酸：除核酸：普通微生物和植物的粗酶液中有普通微生物和植物的粗酶液中有大量的核酸污染。除核酸的常用大量的核酸污染。除核酸的常用方法是沉淀法，沉淀劑的選擇需方法是沉淀法，沉淀劑的選擇需求大量的實驗來選定，知的有求大量的實驗來選定，知的有1%2%的鏈霉素硫

7、酸鹽、溶菌的鏈霉素硫酸鹽、溶菌酶等。酶等。破碎方法：機械研磨破碎方法：機械研磨將剪碎的兔肝置于研缽中用將剪碎的兔肝置于研缽中用研磨棒研碎，參與一定的研磨棒研碎，參與一定的石英可提高研磨效果也可石英可提高研磨效果也可用勻漿器進展勻漿，參與低用勻漿器進展勻漿，參與低滲溶液。運用差速離心法在滲溶液。運用差速離心法在1600r/min 離心機中離心得離心機中離心得到上清一和沉淀一。將沉淀到上清一和沉淀一。將沉淀參與一定濃度蔗糖溶液后在參與一定濃度蔗糖溶液后在3500r/min離心機離心得到上離心機離心得到上清二和沉淀二細胞核。清二和沉淀二細胞核。將上清一二混合，取少量上將上清一二混合，取少量上清液在清

8、液在6600r/min離心機中離離心機中離心得到沉淀三是線粒體，棄心得到沉淀三是線粒體，棄去上清液微粒體與溶酶體去上清液微粒體與溶酶體最后得到上清液為胞液，沉最后得到上清液為胞液，沉淀二為細胞核，沉淀三為線淀二為細胞核，沉淀三為線粒體粒體以下步驟分別對三部分進展以下步驟分別對三部分進展操作操作酶的分別提取酶的分別提取鹽溶液提取適用于大多數(shù)酶。鹽溶液提取適用于大多數(shù)酶。 用用0.02mol/L磷酸鹽緩沖液提取線粒體和磷酸鹽緩沖液提取線粒體和細胞核中的酶細胞核中的酶一，初分，鹽析一，初分，鹽析運用飽和硫酸銨以一定的恰當比例，使蛋運用飽和硫酸銨以一定的恰當比例，使蛋白質(zhì)析出，視詳細情況經(jīng)過過濾和離心

9、的白質(zhì)析出，視詳細情況經(jīng)過過濾和離心的方法沉淀分別出來，得到的沉淀即為蛋白方法沉淀分別出來，得到的沉淀即為蛋白質(zhì)質(zhì)等電點沉淀法等電點沉淀法將上一步得到的沉淀溶解在將上一步得到的沉淀溶解在ph為為6.2的緩的緩沖液中，離心后得到上清液和沉淀，沖液中，離心后得到上清液和沉淀，棄去上清，沉淀即為一切棄去上清，沉淀即為一切pI為為6.2的蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)二，精分，離子交換柱層析法二，精分，離子交換柱層析法利用利用DEAE纖維素為作為纖維素為作為陰離子交換劑，帶有正電荷可以吸附帶有陰離子交換劑，帶有正電荷可以吸附帶有負電荷的蛋白質(zhì)負電荷的蛋白質(zhì)DEAE預(yù)處置，裝柱，平衡樣品上樣與洗預(yù)處置，裝柱，平衡樣品上

10、樣與洗脫搜集得到相對純真的蛋白質(zhì)脫搜集得到相對純真的蛋白質(zhì)利用利用CM-纖維素纖維素ph為為5.0作為陽離子作為陽離子交換劑，吸附帶正電荷的酶交換劑，吸附帶正電荷的酶DEAE的再生與保管的再生與保管實驗步驟如何使線粒體和細胞核破碎？脫鹽，運用透析袋脫鹽脫鹽，運用透析袋脫鹽SDS電泳，電泳，1，制備待測蛋白質(zhì)樣品：，制備待測蛋白質(zhì)樣品：2，垂直板狀聚丙烯酰胺凝膠的灌制：垂直板狀聚丙烯酰胺凝膠的灌制：3，加，加樣：樣：4，電泳：，電泳：5，剝膠：，剝膠：6，染色和褪色。，染色和褪色。實驗步驟實驗結(jié)果：察看脫色后凝膠中的蛋白質(zhì)區(qū)帶，假設(shè)被測蛋白質(zhì)樣品分別純化的好，純度高，應(yīng)出現(xiàn)三條區(qū)帶，假設(shè)在同一凝