1、n原理：原理： SDSSDS是一種陰離子表面活性劑，其是一種陰離子表面活性劑，其SOSO4 4- -為親水基，為親水基，CHCH3 3（CHCH2 2）1111- -為疏水基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為水溶性時(shí)，為疏水基。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)為水溶性時(shí)，不管蛋白質(zhì)的種類是什么，大約不管蛋白質(zhì)的種類是什么，大約1g1g的蛋白質(zhì)將與的蛋白質(zhì)將與1.4g1.4g的的SDSSDS結(jié)合，蛋白質(zhì)將解離為多肽，其結(jié)合，蛋白質(zhì)將解離為多肽，其S-SS-S鍵鍵也在還原劑的作用下斷裂，最終形成也在還原劑的作用下斷裂，最終形成SDS-SDS-多肽，多肽，并帶有大量過剩的負(fù)電荷。當(dāng)利用聚丙烯酰胺凝并帶有大量過剩的負(fù)電荷。當(dāng)利用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行

2、電泳時(shí)，不管蛋白質(zhì)的本來的形狀和電荷膠進(jìn)行電泳時(shí)，不管蛋白質(zhì)的本來的形狀和電荷如何，都將形成形狀和電荷密度類似的如何，都將形成形狀和電荷密度類似的SDS-SDS-多肽多肽復(fù)合體，并根據(jù)其分子量的大小分離。復(fù)合體，并根據(jù)其分子量的大小分離。 試劑種類 膠 濃 度 5% 7.5% 10% 12.5% 15% 17.5%30:0.8丙烯酰胺/雙丙烯酰胺 5 7.5 10 12.5 15 17.51.5M Tris.Hcl(pH8.8) 6 6 6 6 6 610% SDS 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.31.5%(w/v) APS(過硫酸胺) 1 1 1 1 1 1TEMED 0.01

3、5 0.015 0.015 0.015 0.015 0.015水17.2 14.7 12.2 9.7 7.2 5.2總量 30 ml分離膠組成：分離膠組成： 膠濃度膠濃度 分離范圍（KD）5-7.5% 5010-12.5% 20-5015-17.5% 20操作步驟操作步驟：1. 樣品制備：樣品制備： 樣品和變性劑按樣品和變性劑按2：1比例混合后立即置于沸水溶中支架上比例混合后立即置于沸水溶中支架上5分鐘；分鐘； 樣品冷卻至室溫，微型離心機(jī)短暫離心。樣品冷卻至室溫，微型離心機(jī)短暫離心。2、 分離膠的灌注：分離膠的灌注： 將制膠的裝置、將制膠的裝置、Teflon梳子、塑料隔條用強(qiáng)堿性去垢劑洗凈、風(fēng)

4、干；梳子、塑料隔條用強(qiáng)堿性去垢劑洗凈、風(fēng)干； 灌膠前用少量酒精將上述裝置擦凈；灌膠前用少量酒精將上述裝置擦凈； 將玻璃板和隔膠條固定好，用瓊脂封好邊緣；將玻璃板和隔膠條固定好，用瓊脂封好邊緣； 分離膠各試劑充分混合，真空脫氣分離膠各試劑充分混合，真空脫氣10分鐘，分鐘，APS和和TEMED在灌膠前再在灌膠前再加；加； 灌注膠液直至液面高度離玻板頂部約灌注膠液直至液面高度離玻板頂部約1.5cm處處; 在膠液上面均勻布一層異丁醇（在膠液上面均勻布一層異丁醇（2-甲基甲基-1-丁醇），異丁醇可用水代替；丁醇），異丁醇可用水代替； 分離膠至少聚合分離膠至少聚合1小時(shí)。小時(shí)。3、壓縮膠的灌注：、壓縮膠的

5、灌注： 壓縮膠的試劑混合、脫氣方法同分離膠；壓縮膠的試劑混合、脫氣方法同分離膠； 分離膠聚合后傾出上層液體異丁醇，用蒸餾水洗滌膠的上部；分離膠聚合后傾出上層液體異丁醇，用蒸餾水洗滌膠的上部； 灌注壓縮膠液；灌注壓縮膠液； 將梳子插入玻板之間；將梳子插入玻板之間； 靜置聚合靜置聚合30分鐘。分鐘。 4、電泳：、電泳： 小心地取出梳子，上下槽中加入電泳緩沖液（小心地取出梳子，上下槽中加入電泳緩沖液（1*），確保每個(gè)樣品孔中都充），確保每個(gè)樣品孔中都充滿緩沖液；滿緩沖液； 除去樣品孔中的氣泡和聚丙烯酰胺碎片；除去樣品孔中的氣泡和聚丙烯酰胺碎片； 每個(gè)樣品按合適的蛋白質(zhì)量加樣，樣品不要溢出樣品孔外，避

6、免蛋白質(zhì)間互每個(gè)樣品按合適的蛋白質(zhì)量加樣，樣品不要溢出樣品孔外，避免蛋白質(zhì)間互相混合；相混合； 將電極導(dǎo)線接至電源，黑的接負(fù)極，紅的接正極，電泳由負(fù)極向正極遷移；將電極導(dǎo)線接至電源，黑的接負(fù)極，紅的接正極，電泳由負(fù)極向正極遷移； 壓縮膠部分每塊按壓縮膠部分每塊按8mA(!5mA)電流，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠時(shí)，每塊膠的電流電流，當(dāng)溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠時(shí)，每塊膠的電流增至增至18mA(30mA)； 溴酚藍(lán)遷移到膠的底部時(shí)，即關(guān)掉電源，停止電泳。溴酚藍(lán)遷移到膠的底部時(shí)，即關(guān)掉電源，停止電泳。操作步驟：操作步驟：硝硝 酸酸 銀銀 染染 色色試劑：試劑：1. 固定液（200ml） 100ml 甲醇 24ml

7、冰醋酸 100ul formalin 76ml 水2. 清洗液（200 ml） 100ml 甲醇或無水乙醇 100ml 水3. 定影液（200 ml） 0.04g Na2S2O3 200ml 水4. 染色液（200 ml） 0.4g AgNO3 150ul formalin 200ml 水5. 顯影液（200 ml） 12g Na2CO3 100ul formalin 4ml 0.02% Na2S2O3 185ml 水6. 停止液（200 ml） 100ml 甲醇 24ml 冰醋酸 76ml 水 操作步驟：操作步驟：1.電泳后的凝膠在固定液中固定電泳后的凝膠在固定液中固定1小時(shí)以上；小時(shí)以上；2.用洗凈液浸泡用洗凈液浸泡3次，每次次，每次20分鐘；分鐘；3.在定影液中反應(yīng)在定影液中反應(yīng)2分鐘；分鐘；4.用蒸餾水洗凈用蒸餾水洗凈3次，每次次，每次5分鐘；分鐘；5.染色液中反應(yīng)染色液中反應(yīng)30分鐘；分鐘；6