1、探針標(biāo)記物     利用分子雜交的原理對(duì)待測(cè)核酸進(jìn)行檢測(cè)，必須將與待測(cè)核酸進(jìn)行雜交反應(yīng)的探針用某種可以檢測(cè)的分子進(jìn)行標(biāo)記。探針的標(biāo)記是指將一些可以用一定的方法顯示或檢測(cè)的物質(zhì)，即標(biāo)記物結(jié)合在探針上的過(guò)程。    理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具備以下特性：    高度靈敏性；    與探針的結(jié)合不影響探針的主要理化特性、雜交特異性和雜交穩(wěn)定性；    顯示或檢測(cè)要簡(jiǎn)便、節(jié)時(shí)、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好；    對(duì)環(huán)境無(wú)污染，對(duì)

2、人體無(wú)損傷。    目前用于標(biāo)記原位雜交探針的標(biāo)記物有20多種，可分為放射性標(biāo)記物(放射性核素)和非放射性標(biāo)記物兩大類。    1放射性標(biāo)記物  原位雜交技術(shù)最初建立時(shí)就是以放射性核素作為標(biāo)記物。目前，放射性核素仍用于探針的標(biāo)記。常用的放射性核素有32P、3H、35S等。用放射性核素標(biāo)記探針有以下優(yōu)點(diǎn)：放射性核素標(biāo)記的核苷酸易摻入DNA和RNA分子中；標(biāo)記反應(yīng)的情況可通過(guò)特殊的儀器(閃爍計(jì)數(shù)器)進(jìn)行監(jiān)測(cè)；用放射性核素標(biāo)記的探針進(jìn)行的原位雜交反應(yīng)，可用敏感性高的放射自顯影技術(shù)檢測(cè)。但放射性核素存在輻射危害。有半衰期限制，且放射

3、自顯影檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。由于這些缺點(diǎn)，放射性核素標(biāo)記探針的應(yīng)用受到了限制。    2非放射性標(biāo)記物  目前，非放射性標(biāo)記物主要有以下幾類： 酶類，如辣根過(guò)氧化物酶(HRP)和堿性磷酸酶(AKP)等；半抗原，如地高辛(DIG)及生物素等；    熒光素，如異硫氰酸熒光素(FITC)等。非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的探針雖然在敏感性方面不如放射性核素標(biāo)記探針，但其穩(wěn)定性和分辨率高，檢測(cè)所需的時(shí)間短，一般在24小時(shí)即可得到結(jié)果，且操作簡(jiǎn)便，不存在放射性污染的安全問(wèn)題。不需特殊的防護(hù)設(shè)備，因此非放射性標(biāo)記物的應(yīng)用日趨廣泛。缺口平移法探針標(biāo)

4、記  探針的標(biāo)記方法很多，大致可以分為兩大類：引入法和化學(xué)修飾法。引入法是運(yùn)用標(biāo)記好的核苷酸來(lái)合成探針，即先將標(biāo)記物與核苷酸結(jié)合，然后通過(guò)DNA聚合酶、RNA聚合酶及末端轉(zhuǎn)移酶等將標(biāo)記的核苷酸整合入DNA或RNA探針序列中去?；瘜W(xué)修飾法即采用化學(xué)方法將標(biāo)記物摻入已合成的探針?lè)肿又腥?，或改變探針原有的結(jié)構(gòu)，使之產(chǎn)生特定的化學(xué)基團(tuán)。引人法較化學(xué)修飾法更常用按其整合的方法不同,引入法可分為缺口平移法、隨機(jī)引物法、末端標(biāo)記法和PCR擴(kuò)增標(biāo)記法和RNA體外轉(zhuǎn)錄法等。     缺口平移法(nick translation)是一種最常用的標(biāo)記雙鏈D

5、NA探針的方法，該方法利用DNA聚合酶I的多種酶促活性將標(biāo)記的三磷酸脫氧核糖核苷(dNTP)摻入到新合成的DNA鏈中，從而合成高比活性的均勻標(biāo)記的DNA探針。其基本原理是首先用適當(dāng)濃度的DNA酶I在DNA探針?lè)肿拥囊粭l鏈上打開(kāi)缺口(nick)，缺口處形成3羥基末端；利用大腸桿菌DNA聚合酶 5，3，方向外切酶活性，將缺口處5，端核苷酸依次切除；與此同時(shí)，在大腸桿菌DNA聚合酶I的5，3，聚合酶活性的催化下，以另一條DNA鏈為模板，以dNTP為原料，順序?qū)NTP連接到切口的3，羥基上，從5，端向3，端方向重新合成一條互補(bǔ)鏈。其結(jié)果是在缺口的5，端，核苷酸不斷被水解，而在缺口的3，端核苷酸依次被

6、添加上去，從而使缺口沿著互補(bǔ)DNA鏈移動(dòng)，原料中含有的標(biāo)記核苷酸因此替代原DNA分子上的部分核苷酸而摻人到新合成的DNA鏈中，從而獲得標(biāo)記的DNA探針。此方法的缺點(diǎn)是需要較多的DNA模板(200ng)，且標(biāo)記效率較低。探針缺口平移法標(biāo)記原理圖 隨機(jī)引物法探針標(biāo)記    隨機(jī)引物法的原理是使被稱為隨機(jī)引物(random primer)的長(zhǎng)6個(gè)核苷酸的寡核苷酸片段與單鏈DNA或變性的雙鏈DNA隨機(jī)互補(bǔ)結(jié)合(退火)，以提供3，羥基端，在無(wú)5，3，外切酶活性的DNA聚合酶大片段(如Klenow片段)作用下，在引物的3，羥基末端逐個(gè)加上核苷酸直至下一個(gè)引物。當(dāng)反應(yīng)液中含有標(biāo)

7、記的核苷酸時(shí)，即形成標(biāo)記的DNA探針。6個(gè)核苷酸混合物出現(xiàn)所有可能結(jié)合序列，引物與模板的結(jié)合以一種隨機(jī)的方式發(fā)生，標(biāo)記均勻跨越DNA全長(zhǎng)。當(dāng)以RNA為模板時(shí)，必須采用反轉(zhuǎn)錄酶，得到的產(chǎn)物是標(biāo)記的單鏈cDNA探針。隨機(jī)引物法標(biāo)記的探針比活性高，但標(biāo)記探針的產(chǎn)量比缺口平移法低。DNA探針的隨機(jī)引物法標(biāo)記原理圖 末端標(biāo)記法探針標(biāo)記     末端標(biāo)記法(end-labelling)是將標(biāo)記物導(dǎo)入線型DNA或RNA的3，末端或5，末端的一類標(biāo)記法，可分為3，末端標(biāo)記法、5，末端標(biāo)記法和T4聚合酶替代法。末端標(biāo)記法主要用于寡核苷酸探針或短的DNA或RNA探針的標(biāo)記，

8、用該法標(biāo)記的探針攜帶的標(biāo)記分子較少。     (1)5，末端標(biāo)記法：5，末端標(biāo)記法需要T4多聚核苷酸激酶(polynucleotide kilnase)，最常用的標(biāo)記物是32PATP。T4多聚核苷酸激酶能特異地將32PATP中的32P轉(zhuǎn)移到DNA或RNA的5，OH末端，因此被標(biāo)記的探針必須有一個(gè)5，OH端，而大多數(shù)DNA或RNA的5，端都因磷酸化而含有磷酸基團(tuán)。因此標(biāo)記前要先用堿性磷酸酶去掉磷酸基團(tuán)。     (2)3，末端標(biāo)記法：通過(guò)末端脫氧核糖核苷酸轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)催化標(biāo)記的dNTP加到單鏈或雙鏈DNA的3，末端上。     (3)T4聚合酶替代法：根據(jù)T4DNA聚合酶具有5，3，聚合酶活性和3，5，方向核酸外切酶活性，而在4種三磷酸核苷存在時(shí)3，5，方向核酸外切酶活性被抑制的特性，首先，在缺乏核苷酸的情況下，利用工DNA聚合酶從3，5，端對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行水解，產(chǎn)