1、實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的單染色與革蘭氏細(xì)菌的單染色與革蘭氏染色法染色法 微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化學(xué)因素的作用而進(jìn)行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作行的。物理因素如細(xì)胞及細(xì)胞物質(zhì)對染料的毛細(xì)現(xiàn)象、滲透、吸附作用等。化學(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生的各種化用等?；瘜W(xué)因素則是根據(jù)細(xì)胞物質(zhì)和染料的不同性質(zhì)而發(fā)生的各種化學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，學(xué)反應(yīng)。酸性物質(zhì)對于堿性染料較易吸附，且吸附作用穩(wěn)固；同樣，堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對于堿性染料就

2、堿性物質(zhì)對酸性染料較易于吸附。如酸性物質(zhì)細(xì)胞核對于堿性染料就有化學(xué)親和力，易于吸附。有化學(xué)親和力，易于吸附。 1 1 微生物染色的基本原理微生物染色的基本原理 細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，細(xì)菌的等電點(diǎn)較低，pHpH值大約在值大約在2525之間，故在中性、堿性或弱酸之間，故在中性、堿性或弱酸性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶負(fù)電荷；而堿性染料電離時(shí)染料離子帶性溶液中，菌體蛋白質(zhì)電離后帶負(fù)電荷；而堿性染料電離時(shí)染料離子帶正電。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。所以，在正電。因此，帶陰電的細(xì)菌常和帶陽電的堿性染料進(jìn)行結(jié)合。所以，在細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。細(xì)菌學(xué)上常用堿性染料進(jìn)行染色。2 2 染色

3、方法染色方法 微生物染色方法一般分為微生物染色方法一般分為單染色法單染色法和和復(fù)染色法復(fù)染色法兩種。前者用一種染兩種。前者用一種染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料使微生物染色，但不能鑒別微生物。復(fù)染色法是用兩種或兩種以上染料，有協(xié)助鑒別微生物的作用，故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有料，有協(xié)助鑒別微生物的作用，故亦稱鑒別染色法。常用的復(fù)染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細(xì)胞各部分結(jié)構(gòu)的（如芽革蘭氏染色法和抗酸性染色法，此外還有鑒別細(xì)胞各部分結(jié)構(gòu)的（如芽胞、鞭毛、細(xì)胞核等）特殊染色法。胞、鞭毛、細(xì)胞核等）特殊染色法。 實(shí)驗(yàn)三實(shí)驗(yàn)三 細(xì)菌的革蘭氏染色法

4、細(xì)菌的革蘭氏染色法一、目的要求一、目的要求1 1 學(xué)習(xí)掌握學(xué)習(xí)掌握革蘭氏染色法。革蘭氏染色法。2 2 了解了解革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。革蘭氏染色法的原理及其在細(xì)菌分類鑒定中的重要性。二、基本原理二、基本原理三、器材三、器材1 1 菌種菌種 大腸桿菌約大腸桿菌約24h24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，金黃色葡萄球菌約約24h營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物。2 2 溶液和試劑溶液和試劑 革蘭氏染色液，草酸銨結(jié)晶紫染液，盧戈氏碘液，番紅復(fù)染液革蘭氏染色液，草酸銨結(jié)晶紫染液，盧戈氏碘液，番紅復(fù)染液3 3 儀器或用具儀器或用具 顯微鏡、酒精燈、載

5、玻片、接種環(huán)、雙層瓶顯微鏡、酒精燈、載玻片、接種環(huán)、雙層瓶（內(nèi)裝香柏油和二甲苯）、擦鏡紙、無菌生理鹽水、載玻片（內(nèi)裝香柏油和二甲苯）、擦鏡紙、無菌生理鹽水、載玻片夾子、濾紙夾子、濾紙四、操作步驟四、操作步驟1 1 制片制片 涂片：涂片：固體培養(yǎng)物，液體培養(yǎng)物。注意事項(xiàng)：載玻片要潔凈固體培養(yǎng)物，液體培養(yǎng)物。注意事項(xiàng)：載玻片要潔凈無油跡；滴加生理鹽水和取菌不宜過多；涂片均勻，不宜過無油跡；滴加生理鹽水和取菌不宜過多；涂片均勻，不宜過厚。厚。干燥：干燥：室溫自然干燥。室溫自然干燥。固定：固定：涂面朝上，通過火焰涂面朝上，通過火焰2 23 3次。熱固定溫度不宜過高，次。熱固定溫度不宜過高，以玻片背面不

6、燙手為宜。以玻片背面不燙手為宜。A. 加小滴水加小滴水 B. 涂成薄層涂成薄層 C. 固定菌體固定菌體 革蘭氏染色革蘭氏染色 制片制片2 2 初染初染滴加結(jié)晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）滴加結(jié)晶紫（以剛好將菌膜覆蓋為宜）, ,染色染色1 12 min2 min，水洗。，水洗。3 3 媒染媒染用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋菌膜約用碘液沖去殘水，并用碘液覆蓋菌膜約1min1min，水洗。，水洗。4 4 脫色脫色用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，用滴管流加用濾紙吸去玻片上的殘水，將玻片傾斜，用滴管流加9595的乙的乙醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時(shí)，立即水洗。脫色時(shí)間一般醇脫色，直至流出的乙醇無紫色時(shí)，

7、立即水洗。脫色時(shí)間一般液液202030 S30 S。脫色不足與過度都會影響和改變?nèi)旧慕Y(jié)果。脫色不足與過度都會影響和改變?nèi)旧慕Y(jié)果。5 5 復(fù)染復(fù)染用番紅液復(fù)染約用番紅液復(fù)染約2min2min，水洗。，水洗。革蘭氏染色革蘭氏染色 染色染色6 6 鏡檢鏡檢干燥后，用油鏡觀察。藍(lán)紫色為干燥后，用油鏡觀察。藍(lán)紫色為G G+ +, ,紅色為紅色為G G- -。7 7 混合涂片染色混合涂片染色將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作混合涂片、染色、鏡檢進(jìn)行將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌作混合涂片、染色、鏡檢進(jìn)行比較。比較。 Procedures of Gram StainingGram positive or Gram negative?實(shí)驗(yàn)報(bào)告1 1繪圖說明經(jīng)革蘭氏染色后大腸肝菌和金黃色葡萄球繪圖說明經(jīng)革蘭氏染色后大腸肝菌和金黃色葡萄球菌的染色結(jié)果。菌的染