1、雙層平板法察看噬菌蛭弧菌斑實驗雙層平板法察看噬菌蛭弧菌斑實驗實驗 十 1一、蛭弧菌簡介 蛭弧菌(Bdellovibrio)是寄生于其他細菌并能導(dǎo)致其裂解的一類細菌。它雖然比通常的細菌小，能經(jīng)過細菌濾器，有類似噬菌體的作用，但它不是病毒，是一類能吃掉細菌的細菌。 1962年初次發(fā)現(xiàn)于菜豆葉燒病假單胞菌體中，隨后從土壤、污水中都分別到了這種細菌。2特征蛭弧菌屬于蛭弧菌科。具有細菌的一切形狀特征：單細胞，弧形或逗點狀，有時呈螺旋狀0.3-0.60.8-1.2微米，或僅為桿菌長度的1/3-1/4端生鞭毛，比其他細菌的鞭毛粗3-4倍，運動活潑革蘭氏染色陰性。細胞中蛋白質(zhì)含量較高，有的占干重的60-70%

2、。DNA含量5%，GC百分數(shù)為42-51%。3生活方式有寄生型，也有兼性寄生，極少數(shù)營腐生。非寄生型營腐生生活，可在蛋白胨和酵母提取物有寄生型，也有兼性寄生，極少數(shù)營腐生。非寄生型營腐生生活，可在蛋白胨和酵母提取物培育基上生長繁衍，絕大多數(shù)都喪失了寄生性。培育基上生長繁衍，絕大多數(shù)都喪失了寄生性。從自然界分別得到的蛭弧菌都是依賴寄生型，迄今為止，還沒有直接從自然界分別得到非寄從自然界分別得到的蛭弧菌都是依賴寄生型，迄今為止，還沒有直接從自然界分別得到非寄生型。不依賴宿主的蛭弧菌，只能生活在實驗室條件下。生型。不依賴宿主的蛭弧菌，只能生活在實驗室條件下。4生長要求寄生型蛭弧菌生長，要求寄生型蛭弧

3、菌生長，要求pH6.0-8.5pH6.0-8.5；溫度；溫度23-3723-37，低于，低于1212，高于，高于4242時均不生長；能時均不生長；能穩(wěn)定分解蛋白質(zhì)，普通不利用碳水化合物，而以肽、氨基酸作碳源和能源；能液化明膠穩(wěn)定分解蛋白質(zhì)，普通不利用碳水化合物，而以肽、氨基酸作碳源和能源；能液化明膠；嚴厲好氧。；嚴厲好氧。5侵入對象蛭弧菌與宿主細胞之間，常表現(xiàn)出一定的特異性。不過，有的特異性較差，能侵入多種細菌。例如不同的蛭弧菌菌株，能侵入各類不同的植物病原菌。6侵入機理周質(zhì)空間7分布和分別廣泛存在于自然界，土壤、河水、附近海洋水域及下水道污水。將蛭弧菌與敏感菌混合倒平板，在適宜條件下培育2-

4、3天，平板上便會出現(xiàn)類似噬菌體的噬菌斑，并逐漸擴展，宿主細胞完全被溶解而構(gòu)成透明區(qū)。從這些透明區(qū)中就可分別到蛭弧菌。利用這一特征，還可計算出蛭弧菌噬菌體的數(shù)目。同時可追蹤增殖過程、寄生埋伏時間、新產(chǎn)生蛭弧菌的數(shù)量以及它們的活性等。8運用價值用于凈化水體和去除工、農(nóng)、醫(yī)等方面的有害細菌。大量存在于污水中，對大腸桿菌和沙門氏菌屬的細菌均有廣泛的寄生性，因此，有人以蛭弧菌作為水域污染程度的一項最終目的實際研討：宿主細菌-蛭弧菌-蛭弧菌噬菌體這個三位一體的寄生系統(tǒng)。9二、實驗?zāi)康?. 1. 了解噬菌蛭弧菌的生物特性了解噬菌蛭弧菌的生物特性2. 2. 掌握雙層平板法分別蛭弧菌技術(shù)掌握雙層平板法分別蛭弧菌

5、技術(shù) 10三、實 驗 材 料儀器儀器 顯微鏡，生化培育箱，電子天平，高壓滅菌鍋，電熱枯燥箱，超凈任務(wù)臺，冰箱，顯微鏡，生化培育箱，電子天平，高壓滅菌鍋，電熱枯燥箱，超凈任務(wù)臺，冰箱，高速離心機，普通離心機。高速離心機，普通離心機。菌種菌種大腸桿菌大腸桿菌Escherichia coli、噬菌蛭弧菌、噬菌蛭弧菌Bdellovibrio bacteriovoru。11實驗試劑實驗試劑 1 1 牛肉膏蛋白胨培育基牛肉膏蛋白胨培育基: :牛肉粉牛肉粉5g5g0.5%0.5%；蛋白胨；蛋白胨10g10g1%1%；瓊脂；瓊脂20g20g2%2%；蒸；蒸餾水餾水1000ml1000ml；pH 7.0pH 7

6、.07.27.2 2 2 雙層平板培育基雙層平板培育基 下層瓊脂培育基：瓊脂下層瓊脂培育基：瓊脂17.5g17.5g1.75%1.75%；蒸餾水；蒸餾水1000ml1000ml 上層上層LBLB培育基：蛋白胨培育基：蛋白胨5g5g0.5%0.5%；酵母提取物；酵母提取物1.5g1.5g0.15%0.15%；NaCl 2.5gNaCl 2.5g0.25%0.25%；瓊脂；瓊脂4g4g0.4%0.4%；蒸餾水；蒸餾水1000ml1000ml。大腸桿菌的制備大腸桿菌的制備 將大腸桿菌接種牛肉膏蛋白胨培育基斜面上，放在將大腸桿菌接種牛肉膏蛋白胨培育基斜面上，放在3737培育箱里培育培育箱里培育24 h

7、24 h后，備用。后，備用。 12四、實四、實 驗驗 程程 序序1. 1. 利用雙層平板法分別噬菌蛭弧菌利用雙層平板法分別噬菌蛭弧菌2. 2. 察看噬菌蛭弧菌斑出現(xiàn)及其形狀的察看察看噬菌蛭弧菌斑出現(xiàn)及其形狀的察看即：經(jīng)過雙層平板法使噬菌蛭弧菌對大腸桿菌的裂解而構(gòu)成噬菌斑。即：經(jīng)過雙層平板法使噬菌蛭弧菌對大腸桿菌的裂解而構(gòu)成噬菌斑。13雙層平板法主要優(yōu)點：14五、實驗方法及操作1 1、 蛭弧菌懸液的制備：挑取蛭弧菌單斑浸泡于蛭弧菌懸液的制備：挑取蛭弧菌單斑浸泡于1.5 mL 1.5 mL 無菌水中，搗碎混勻，無菌水中，搗碎混勻，10000 g10000 g離離心心1 min1 min，得到蛭弧菌

8、懸液，備用。，得到蛭弧菌懸液，備用。 2 2、大腸桿菌懸液的制備：取、大腸桿菌懸液的制備：取0.5 mL0.5 mL無菌水在大腸桿菌的斜面上，用接種環(huán)鉤分散乳化無菌水在大腸桿菌的斜面上，用接種環(huán)鉤分散乳化菌苔，制備菌懸液，備用。菌苔，制備菌懸液，備用。 3 3、倒入融化的瓊脂培育基、倒入融化的瓊脂培育基20ml20ml于無菌培育皿中，冷卻凝固，備用。制造下層瓊脂培育于無菌培育皿中，冷卻凝固，備用。制造下層瓊脂培育基?；?4 4、汲取、汲取3.5 mL3.5 mL上層上層LBLB培育基培育基5050中參與中參與0.2mL0.2mL蛭弧菌液和蛭弧菌液和0.3 mL0.3 mL大腸桿菌菌懸液，大腸

9、桿菌菌懸液，混勻后立刻傾注于下層培育基上，待凝固后置于混勻后立刻傾注于下層培育基上，待凝固后置于3535培育箱內(nèi)培育培育箱內(nèi)培育24h-120 h24h-120 h。15實驗操作本卷須知 1 1、上層、上層LBLB培育基溫度必需控制在培育基溫度必需控制在5050左右，溫度過高導(dǎo)致大腸桿菌和蛭弧菌失活。左右，溫度過高導(dǎo)致大腸桿菌和蛭弧菌失活。 2 2、參與、參與0.2mL0.2mL蛭弧菌液和蛭弧菌液和0.3 mL0.3 mL大腸桿菌菌懸液時動作要快，倒入下層培育基上迅速搖大腸桿菌菌懸液時動作要快，倒入下層培育基上迅速搖勻，防止勻，防止LBLB培育基凝固。培育基凝固。 3 3、一定要等培育基凝固后，在倒置培育。、一定要等培育基凝固后，在倒置培育。16六、實驗結(jié)果 1 1、察看噬菌斑出現(xiàn)及大小、察看噬菌斑出現(xiàn)及大小 2 2、記錄噬菌斑個數(shù)、記錄噬